곰보배추 열수 추출물이 마우스 비장세포 사이토카인 생성에 미치는 영향 ⁃

곰보배추 열수 추출물이 마우스 비장세포 사이토카인 생성에 미치는 영향

⁃ 연구노트 ⁃

신진섭¹*․박정진^1,2*․전우진^1,2

1전남대학교 식품영양학과

2전남대학교 생활과학연구소

Effect of Hot Water Extract of Salvia plebeia R. on the Production of Splenocyte Cytokines in Mouse

Jinseop Shin^1*, Jeongjin Park^1,2*, and Woojin Jun^1,2

1Division of Food and Nutrition and ²Research Institute for Human Ecology, Chonnam National University

ABSTRACT This study examined the antioxidant and immuno-enhancement effects of Salvia plebeia R. For the an- tioxidant activities, the total polyphenol and, flavonoid contents were 99.10±2.53 mg gallic acid equivalent/g and, 48.71±1.06 mg catechin equivalent/g, respectively. 2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) and 1,1-di- phenyl-2-picrylhydrazyl radical scavenging activities increased in a dose-dependent manner. The oxygen radical absorb- ance capacity was 109±1.78 nm Trolox equivalent/mL. The levels of IL-2 and IL-12 cytokine production on C57BL/6 mice splenocytes (the FIE-SP group, 150 μg/mL) were significantly higher than the CON group. These results suggest that S. plebeia R. might increase the antioxidant activity, and immune-enhancement effect.

Key words: Salvia plebeia R., antioxidant activities, splenocyte, imuuno-enhancement, cytokine

Received 21 April 2020; Accepted 3 June 2020

Corresponding author: Woojin Jun, Division of Food and Nutrition, Chonnam National University, Gwangju 61186, Korea

E-mail: [email protected], Phone: +82-62-530-1337

*These authors contributed equally to this work.

Author information: Jinseop Shin (Graduate student), Jeongjin Park (Instructor), Woojin Jun (Professor)

서 론

경제 성장과 의학의 발달로 평균 수명이 연장되고 삶의 질에 대한 가치관이 변화하면서 건강의 중요성이 증가하고 있다. 최근에는 의약품의 도움에 앞서 천연자원 유래 건강기 능 식품 섭취를 통해 암, 당뇨병, 심혈관계 질환 등의 만성 퇴행성 질환의 예방을 통한 건강 유지와 증진을 기대하는 경향이 점차 확대되고 있다. 이에 따라 세계적으로 천연 식 물자원을 이용하여 질병 예방을 위한 건강기능식품 소재 개 발을 위하여 과학적인 연구가 체계적으로 진행되고 있다.

기존의 많은 연구를 통해 천연식물의 폴리페놀 화합물과 플라보노이드에 의한 항산화 활성은 보고되어 있다(Jeong 등, 2010). 약용식물의 항산화 활성물질은 인체 내에 존재하 는 활성산소 방어 효소인 superoxide dismutase(SOD), glutathione peroxidase, catalase 등을 보완하고, 활성산 소종에 의한 면역력 저하(Park 등, 2000), DNA 손상(Lee 등, 2011), 장기 및 조직손상(Park 등, 2011) 등의 개선에

효과를 나타낸다. 일반적으로 합성 항산화제로 널리 사용되 고 있는 butylated hydroxytoluene, butylated hydrox- yanisole, propyl gallate는 우수한 항산화성과 경제성으로 널리 사용되어 왔지만 장기간 섭취할 경우 간, 폐, 신장, 위장, 순환계 등에 심각한 독성을 일으키는 것으로 알려져 그 사용 량에 제한이 있다(Branen, 1975). 그러므로 천연으로부터 안전한 식이성 대체 항산화제의 개발이 요구되고 있으며 연 구 또한 활발히 진행되고 있다.

곰보배추(Salvia plebeia R.)는 꿀풀과(Labiatae)에 속하 는 일년생 혹은 이년생 적립초목으로 우리나라 전 지역에서 자생한다(Bae 등, 2007). 설견초 혹은 뱀배추라는 이명을 가지고 있으며 예로부터 곰보배추는 항산화(Jeong 등, 2014;

Jo 등, 2010), 기침, 천식(Chang 등, 2017; Choi 등, 2014), 염증(Jang 등, 2016; Jeong 등, 2012), 항암(Kim 등, 2018) 등에 효과가 있다고 알려져 있으며, 주요 성분으로는 플라보 노이드와 페놀성 물질, 정유, 사포닌, 강심배당체, 불포화 스테롤 등이 보고되어 있다(Gu 등, 2001; Shin 등, 2001).

면역(immune)은 외부로부터의 항원 및 질병으로부터의 신체 보호를 의미하며 여기에는 다양한 면역세포와 사이토 카인과 같은 분자가 면역반응을 조절한다. 여기서 체내의 면역 체계는 면역 세포와 기관 조직의 상호작용과 항상성을 유지하며 외부인자인 병원체 및 상해에 대해 인체를 보호한 다. 하지만 산화적 스트레스 및 질병에 의해 면역 시스템의 항상성이 불균형된 면역 시스템은 자기 면역, 만성 염증 및

암으로 발전하여 신체에 치명적인 질병을 일으키는 원인이 될 수 있다. 체내의 면역반응은 내재면역반응과 적응면역반 응에 의해 매개된다. 내재면역(innate immunity)은 외부 병 원체에 대한 초기 반응이며 비특이적 반응으로 적응 면역보 다 빠르게 일어난다. 이러한 내재면역은 세포성 및 생화학적 방어기전으로 구성되며 내재면역에 관여하는 대표적인 세포 로는 대식세포(macrophage), 수지상세포(dendritic cell), 자연살해세포(natural killer cell)가 있으며, 이들은 사이토 카인이라 부르는 단백질을 분비하여 면역세포의 활성을 조 절하고 면역반응을 조화시킨다.

이에 본 연구에서는 곰보배추 추출물의 항산화 및 면역기 능 증진에 미치는 영향을 조사하고자 농도를 달리한 곰보배 추 추출물의 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량, 2,2′-azino -bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)(ABTS) 및 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)의 전자공여능 분석을 통해 항산화 활성을 확인하고, 마우스에서 분리한 비 장세포(splenocyte)의 interleukin-2(IL-2), interleukin- 12(IL-12) 분비량을 측정하여 면역증진 효과를 갖는 식품 소재로서 곰보배추 추출물의 활용 가능성을 확인해 보고자 하였다.

재료 및 방법

실험소재

본 연구에 사용된 시료는 국내에서 수확한 곰보배추를 85

°C 열수(FIE-SP)로 추출해 동결건조된 것으로 (주)프롬바 이오(Suwon, Korea)에서 제공받아 사용하였다.

실험 시약 및 마우스 구입

본 연구의 항산화 활성 측정에 사용된 시약인 Folin- Ciocalteu reagent, ABTS, DPPH와 세포의 안전성을 측정 하기 위한 XTT는 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 실험에 사용하였다. Fetal bovine se- rum(FBS)과 RPMI-1640 그리고 penicillin은 Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)에서, Cytoselect 96-well phag- ocytosis assay kit은 Cell Biolabs, Inc.(San Diego, CA, USA)에서 구입하여 실험에 사용하였으며, cytokine 측정을 위한 IL-2, IL-12의 Duo-set sandwich ELISA mouse kit 은 R&D Systems Inc.(Minneapolis, MN, USA)에서 구입 하였다. 본 연구에 사용된 동물은 오리엔트바이오(Seong- nam, Korea)에서 20 g 내외의 4주령 수컷 C57BL/6 마우스 를 공급받아 실험에 사용하였다.

총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 측정

곰보배추 추출물의 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 방 법(1912)으로 측정하였다. 각 시료는 1,000 µg/mL, 2,000 µg/mL의 농도를 이용하였다. 각 농도의 시료 1 mL를 25 mL volumetric flask에 넣고 증류수 9 mL를 첨가한 후,

1 mL의 Folin-Ciocalteu’s phenol reagent를 넣고 잘 섞어 상온에 5분간 방치하였다. 7% Na₂CO₃를 10 mL 넣고 총량 이 25 mL가 되도록 증류수를 첨가한 후 23°C에서 90분간 방치하고 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 총 폴 리페놀 함량은 0, 100, 200, 300, 400 µg/mL 농도의 gallic acid로 작성된 표준곡선식을 이용하였고, 총 폴리페놀 함량 은 시료 1 g 중에 mg gallic acid로 산출하였다. 곰보배추 추출물의 플라보노이드 함량은 colormetric 방법으로 측정 하였다(Zhishen 등, 1999). 각 농도의 시료 1 mL에 4 mL의 증류수를 첨가하고 5% NaNO2 0.3 mL를 넣어 잘 혼합하였 다. 상온에 5분간 방치하고 10% AlCl3 0.3 mL를 첨가하였 다. 상온에 6분간 방치한 후 1 M NaOH 2 mL를 넣고 증류수 2.4 mL를 넣은 다음 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시 료의 플라보노이드 함량은 0, 100, 200, 300, 400, 500 µg/mL 농도의 catechin hydrate로 작성된 표준곡선식을 이 용하였고, 플라보노이드 함량은 시료 1 g 중의 mg catechin 으로 산출하였다.

ABTS 및 DPPH에 의한 전자공여능 측정

곰보배추 추출물의 ABTS 라디칼 제거 활성은 ABTS 양 이온 라디칼을 2.45 mM 칼륨과 황산염 용액에 7 mM ABTS를 첨가하여 혼합물을 실온조건의 어두운 곳에서 12

~16시간 동안 교반시킨 후, ABTS 양이온 라디칼 용액을 phosphate-buffered saline으로 희석하여 734 nm에서 0.8~1.2의 흡광도를 얻었다. 시료는 에탄올에 녹인 후 500, 2,000 µg/mL 농도로 준비하여 ABTS 양이온 라디칼 용액 을 첨가한 다음 분광광도계를 사용하여 734 nm에서 흡광도 를 측정하였다. 곰보배추 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 500, 2,000 µg/mL 농도로 조절된 추출물 또는 증류수 20 µL에 0.1 mM DPPH 용액 380 µL를 가하여 실온조건의 어두운 곳에서 30분간 방치한 후 515 nm에서 흡광도를 측 정하였다.

Oxygen radical absorbance capacity (ORAC) 측정 곰보배추 추출물의 항산화 활성은 peroxy radical의 생 성과 소멸에 의한 fluorescent의 감소율을 통해 측정하였 다. 과산화 라디칼의 생성을 위해 2,2′-azobis(2-amidino- propane)(AAPH)을 사용하였고, 추출물이 항산화 물질과 반응하여 형광물질이 안정화됨으로써 형광색이 유지되며 이의 흡광도의 변화를 측정하여 항산화 능력을 측정하였다.

시료를 100~500 µg/mL 농도로 희석하여 25 µL의 추출물 과 blank 및 Trolox를 96-well plate(black)에 넣은 후 150 µL fluorescein을 추가하여 37°C에서 15분 동안 방치하였 다. 후에 25 µL의 AAPH를 첨가한 후 70분간 485/528 nm 에서 시간별 형광도를 측정하여 정리하였다.

동물 사육

본 연구에 사용된 동물은 오리엔트바이오에서 20 g 내외

Table 1. Total polyphenol and flavonoids contents of Salvia ple- beia R. (FIE-SP)

Total polyphenol (mg GAE/g)¹⁾

Flavonoids (mg CE/g)²⁾ FIE-SP 99.10±2.53 48.71±1.06

1)mg gallic acid equivalent per dry S. plebeia R. weight g.

2)mg catechin equivalent per dry S. plebeia R. weight g.

의 4주령 수컷 C57BL/6 마우스를 공급받았다. 온도는 22±

3°C, 명암은 12시간(light/dark cycle)인 조건에서 1주 동 안 적응기를 거쳐 실험에 이용하였다. 적응 기간에 식이와 음용수는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 본 연구의 동물실험 은 전남대학교 동물실험윤리위원회의 승인 하에 수행되었 다(CNU IACUC-YB-2019-86).

비장세포 분리

본 실험에 사용된 비장세포는 C57BL/6 마우스의 비장을 적출하여 10% FBS, 1% penicillin이 함유된 RPMI 1640 배지에 세척 후 40 µm cell strainer로 균질화시켜 세포 부 유액을 만들었다. 세포 부유액에 적혈구 용해액으로 적혈구 는 용해하여 제거하고 비장세포를 분리하여 37°C, 5% CO2

조건으로 배양기에서 배양하였다.

IL-2, IL-12 사이토카인 분비량 측정

곰보배추 추출물이 면역세포에 대한 활성을 조절하는지 알아보기 위해 IL-2, IL-12를 C57BL/6 마우스에서 분리한 비장세포에서 측정하였다. 분리한 비장세포를 96-well plate 에 1×10⁶ cells/well씩 분주하고 세포독성실험에서 독성이 없는 농도(100, 150, 200 µg/mL)로 ConA(5 µg/mL)와 함 께 분주한 후 37°C, 5% CO₂ 조건으로 48시간 동안 incu- bator에 배양하였다. IL-2와 IL-12 분비량 측정은 Duo- set sandwich ELISA mouse kit을 이용하여 96-well plate 에 capture antibody를 24시간 동안 상온에 방치하였다.

모든 well을 wash buffer를 이용하여 세척 후 reagent di- luent를 첨가하고 다시 2시간 상온에 방치하였다. 세척 후 sample과 standard를 첨가하여 상온에 2시간 동안 방치하 였다. 또다시 wash buffer를 이용하여 세척한 후 detection antibody를 첨가하고 2시간 동안 상온에 방치하였으며 반 응 후에 세척하였다. 다시 streptavidin-HRP를 첨가한 후 빛을 차단한 상태로 20분 동안 상온에 방치하였으며 또다시 wash buffer를 이용하여 세척하였다. 세척 후 substrate를 첨가하고 20분 동안 상온에 방치하였으며 육안으로 색이 발현한 것을 확인하여 2 N H2SO4 stop solution을 첨가하여 반응을 중지시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

통계 분석

실험 결과는 평균±표준편차(SD)로 나타내었고, 실험 결 과들의 유의성을 검정하기 위해 SPSS(PASW Statistics 23) 프로그램(IBM Inc., Amonk, NY, USA)의 Duncan의 다중 검정법(Duncan’s multiple range test)을 이용하여 사후검 정을 실시하였다(P<0.05).

결과 및 고찰

총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량

식물체에 존재하는 폴리페놀류와 플라보노이드류는 대표

적인 항산화성 물질이며, 항균, 항암 등의 다양한 생리활성 을 나타내는 것으로 알려져 있다(Cross 등, 1987; Wu 등, 2016). 본 연구에서 곰보배추 추출물을 이용한 총 폴리페놀 및 플라보노이드의 함량은 Table 1에서 보는 바와 같이 각 각 99.10±2.53 mg GAE/g, 48.71±1.06 mg CE/g으로 나 타났다. Jeong 등(2015)의 연구에 의하면 곰보배추 열수 추출물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드의 함량은 71.8±4.74 mg GAE/g 및 38.7±2.95 mg QUE/g으로 나타나 본 연구 결과와 유사하였다.

ABTS 및 DPPH에 의한 전자공여능

암소에서 반응시킨 ABTS 용액은 ABTS cation radi- cal(ABTS^･+)이 생성되어 청록색을 나타내고, 곰보배추 중 에 항산화 활성을 갖는 물질이 존재하면 ABTS 라디칼이 소거되어 기존에 나타내던 청록색이 무색으로 변하는 것을 흡광도의 변화로 나타내게 된다. 곰보배추 열수 추출물의 ABTS 라디칼과 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과는 Fig.

1에 나타내었다. ABTS 라디칼은 곰보배추 추출물 1,000, 2,000 µg/mL의 농도에서 각각 35.3±2.2%, 61.5±1.7%의 소 거능을 나타내었고 농도 증가에 따라 유의적으로 증가하는 것으로 나타났다. DPPH 라디칼은 곰보배추 추출물 1,000, 2,000 µg/mL의 농도에서 28.3±0.1%, 62.3±1.3%의 소거 능을 나타내었고 ABTS의 결과와 마찬가지로 곰보배추 추 출물의 농도 증가에 따라 소거능이 유의적으로 증가하는 것 으로 나타났다. 이러한 결과는 문헌 보고된 연구의 곰보배추 에탄올 추출물의 항산화 및 항알레르기 효과를 관찰한 연구 논문에서 농도별 처리에 의해 ABTS, DPPH 라디칼 소거능 을 나타낸 결과(Lim 등, 2017)와 유사하며, 곰보배추 열수 추출물 또한 곰보배추 에탄올 추출물이 가지는 항산화 효과 와 유사하게 나타난 것으로 사료된다.

ORAC 함량

ORAC 측정법은 식품 내에 존재하는 소수성 성분과 친수 성 성분에 모두 반응하기 때문에 응용 범위가 넓다는 장점을 가지고 있으며 기존의 여러 항산화 작용 측정법들의 오류를 없애고 더욱 정확한 결과를 낼 수 있는 대표적인 항산화 측 정 방법 중 하나이다. 본 연구에서 곰보배추 추출물의 ORAC assay에 의한 항산화 활성을 알아보기 위해 농도별로 희석 하여 AAPH에 의한 peroxy radical의 생성과 소멸에 따른 fluorescent의 감소율을 측정한 결과는 109±1.78 nm TE/

a

c b

0 20 40 60 80

FIE-SP ascorbic acid

ABTS radical scavenging . activity (%) .

ascorbic acid

A

a

c b

0 20 40 60 80 100

FIE-SP ascorbic acid

DPPH radical scavenging . activity (%) .

ascorbic acid

B

Fig. 1. Level of ABTS and DPPH radical scavenging activities of water extract from Salvia plebeia R. (FIE-SP). Data express the mean±SD. Different letters (a-c) above the bars are statistically different by Duncan’s multiple range test (P<0.05). FIE-SP concentration is 500 and 2,000 µg/mL.

a

b

0 20 40 60 80 100 120 140 160

FIE-SP ascorbic acid

ORAC (nm trolox eq/mL) .

Fig. 2. Level of ORAC radical scavenging activities of water extract from Salvia plebeia R. (FIE-SP). Data express the mean±

SD. Different letters (a,b) above the bars are statistically differ- ent by Duncan’s multiple range test (P<0.05). FIE-SP concen- tration is 100∼500 µg/mL.

mL로 Fig. 2에 나타냈다.

IL-2와 IL-12 사이토카인 분비량

IL-2는 초기 염증반응에서 세포 간 신호전달을 수행함으 로써 면역반응에 중요한 역할을 담당하며(Ryu, 2010), T cell growth factor로 알려져 있다. IL-12 역시 IL-2와 동일 하게 염증성 사이토카인으로서 세포성 면역 반응을 효과적 으로 유도하는 데 필수적인 역할을 하며(Trinchieri, 1998), 자연살해세포 및 CD8+ T 세포의 세포독성 활성을 증가시 킨다고 알려져 있다. 본 연구에서는 C57BL/6 마우스에서 분리한 비장세포를 이용하여 곰보배추 추출물의 서로 다른 농도에서의 사이토카인 분비량을 측정하여 곰보배추 추출 물의 면역증진 효과를 알아보았다. 분리한 비장세포를 96- well plate에 1×10⁶ cells/well씩 분주하여 배양하고, 곰보 배추 추출물을 농도별로 처리한 후 배양 상층액을 ELISA 방법을 이용하여 사이토카인을 측정하였다. IL-2와 IL-12 사이토카인 분비량을 측정한 결과는 Fig. 3에 나타냈다. 세 포독성을 나타내지 않은 농도(100, 150, 200 µg/mL)의 곰 보배추 추출물 처리에 따른 비장세포에서의 IL-2와 IL-12

모두 곰보배추 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비해 150 µg/mL 농도에서 유의적으로 높은 사이토카인 분비량을 보 였고 200 µg/mL의 곰보배추 처리군에서 분비량이 가장 높 은 것을 나타내었다.

요 약

본 연구는 곰보배추 추출물에 대한 항산화 활성 및 면역력 증진 활성을 평가하였다. 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 은 99.10±2.53 mg GAE/g, 48.71±1.06 mg CE/g으로 나 타났으며, ABTS와 DPPH 라디칼 소거능은 1,000, 2,000 µg/mL의 농도에서 각각 35.3±2.2%, 61.5±1.7%와 28.3±

0.1%, 62.3±1.3%로 농도 의존적으로 라디칼 소거능이 증 가하였다. ORAC 측정 결과는 109±1.78 μm TE/mL로 나 타났다. C57BL/6 마우스에서 분리한 비장세포에 곰보배추 추출물을 처리하여 비장세포에서 분비하는 사이토카인(IL- 2, IL-12)의 분비량을 측정한 결과, 곰보배추를 처리하지 않은 대조군에 비해 곰보배추를 농도별로 처리한 군에서의 사이토카인의 분비량이 증가하였다. 따라서 본 실험 결과를 바탕으로 곰보배추 추출물의 in vivo 후속연구를 통해 곰보 배추 추출물의 면역증진에 대한 추가적인 기전연구가 필요 할 것으로 생각된다.

감사의 글

본 연구는 산업통상자원부와 한국산업기술진흥원의 ‘국가 혁신클러스터사업(P0006892_작물 생육정보 정량화 시스 템 및 빅데이터 서비스 상용화)’의 지원을 받아 수행된 연구 결과입니다.

REFERENCES

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0 20 40 60 80 100 120 140

CON 100 150 200

Concentration (μg/mL)

Cell viability (%) .

A n.s

a b a

b

0 10 20 30 40 50

CON 100 150 200

Concentration (μg/mL)

IL-2 (pg/mL) .

FIE-SP

B

a bc ab

c

0 20 40 60 80 100 120 140

CON 100 150 200

Concentration (μg/mL)

IL-12 (pg/mL) .

FIE-SP

C

Fig. 3. Cell viability and IL-2, IL-12 production in the spleno- cyte culture media treated with Salvia plebeia R. (FIE-SP) were determined by ELISA. Data express the mean±SD. Different let- ters above the bars are statistically different by Duncan’s multi- ple range test (P<0.05).

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