방풍통성산의 지방대사조절을 통한 비알콜성 지방간 유도 인슐린저항성 개선 효과
서일복1․안상현1․김기봉2,3
1세명대학교 한의과대학 해부학교실, 2부산대학교한방병원 한방소아과, 3부산대학교 한의학전문대학원
Received: October 15, 2018 ∙ Revised: November 10, 2018 ∙ Accepted: November 13, 2018 Corresponding Author: Kibong Kim
Department of Korean Pediatrics, Pusan National University Korean Medicine Hospital, Geumo-ro 20, Mulgeum-eup, Yangsan-si, Gyeongsangnam-do, 50612, Republic of Korea Tel: +82-55-360-5952, Fax: +82-55-360-5952
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Abstract
The Effect of Bangpungtongsungsan on Insulin Resistance Induced by Non-alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD)
Seo Il-bok1․Ahn Sang Hyun1․Kim Ki Bong2,3
1Department of Anatomy, College of Korean Medicine, Semyung University,
2Department of Korean Pediatrics, Korean Medicine Hospital, Pusan National University,
3School of Korean Medicine, Pusan National University
Objectives
Bangpungtongsungsan is an herbal medicine that treats obesity and dampness-phlegm. The aim of this study was to investigate the efficacy of Bangpungtongsungsan on insulin resistance induced by non-alcoholic fatty liver disease.
Methods
Male 6-week-old C57BL/6 male mice were divided into four groups: control group (Ctrl), high fat diet group (HFF), high fat diet with Bangpungtongsungsan extract administration group (BT1), and high fat diet with double concentration of Bangpungtongsungsan extract administration group (BT2). Each 10 mice were allocated to each group (total of 40 mice). All mice were allowed to eat fat rich diet freely throughout the experiment. To examine the effect of Bangpungtongsungsan, we observed weight changes, lipid blot distributions, PGC-1, p-IκB, 8-OHdG, p-JNK, total cholesterol and glucose levels.
Results
Comparing of body weight measurements between 4 groups, weight gain was significantly lower in BT1 and BT2 group than the HFF group. The distribution of lipid blots and positive reaction of PGC-1 were significantly lower in BT1 and BT2 group. The positive reaction of p-IκB and 8-OHdG in hepatic tissues was significantly lower in BT1 and BT2 group. The positive reaction of p-JNK in hepatic tissues was significantly lower in BT1 and BT2 group. Total cholesterol and glucose levels were significantly lower in BT1 and BT2 group.
Conclusions
Bangpungtongsungsan has the effect of improving non-alcoholic fatty liver induced insulin resistance through regulation of lipid metabolism.
Key words: Bangpungtongsungsan, NAFLD, Insulin resistance, Obesity
ISSN 1226-8038(Print), 2287-9463(Online), https://doi.org/10.7778/jpkm.2018.32.4.001
Ⅰ. Introduction
비알콜성 지방간질환 (non-alcoholic fatty liver dis- ease, NAFLD)은 유의한 분량의 알코올 섭취가 없음에 도 알코올 간염과 비슷한 조직소견을 보이는 질환으로, 간세포에 지방의 과도한 축적만 있는 단순 지방증 (simple steatosis), 간세포 괴사와 염증과 섬유화를 동반 하는 비알콜성 지방간염 (non-alcoholic steatohepatitis, NASH) 및 더 진행된 형태인 간경변증 (liver cirrhosis) 을 포함하는 일련의 질환군을 의미한다1). 서구화된 식 생활로 인한 국내 비만 증가율이 높아짐에 따라 NAFLD의 유병률이 2004년 11.5%에서 2010년 23.6%
로 6년 사이 2배로 급격히 증가하였다2). 청소년 비만의 유병률 또한 증가하고 있으며3), 이로 인한 대사증후군 과 NAFLD의 유병률 역시 꾸준히 증가하는 추세이다
4,5). 2008년 국내에서 소아청소년의 비만 혹은 과체중 의 유병률은 약 19%까지 보고되었으며3), 간 조직 검사 의 어려움으로 정확한 유병률을 파악하기는 어려우나, 청소년 일반 인구 집단의 경우 NAFLD의 유병률은 미 국과 국내에서 2.6~3.2%, 비만 청소년에서의 NAFLD 유병률은 간 기능 검사 시 10~80%, 간 초음파 검사 시 15~44% 정도로 보고되고 있다6). 특히 NAFLD는 간질 환의 문제에서 끝나지 않고 인슐린저항성을 일으켜 당 뇨 및 대사증후군 발생에 중요한 역할을 하므로 적극 적인 치료가 필요하다7).
현재 식이조절 외에 표준화된 지방간 치료제는 없 으며, 당뇨 진단 이전에 나타나는 인슐린저항성에 대 한 대처방안은 개인의 생활습관 교정밖에 없는 실정이 다8). 특히 NAFLD의 경우 연령이 증가할수록 체중 감 량이 어렵고 오히려 저체중인 지방간, 당뇨 환자들도 있어 근본적으로 지질 대사 및 인슐린저항성을 개선할 수 있는 약물 개발이 필요하다. 인슐린저항성 개선제 인 Metformin의 수요가 증가하고 있으나 당뇨 진단 이 후 사용되고, 간 기능 장애가 있을 때는 사용할 수 없는 단점이 있다9). 이에 최근 인슐린저항성에 대한 치료 수 요 증가로 관련 연구가 이루어지고 있으며, 특히 간의 지방합성 과정에 관여하는 LIPIN1의 인슐린저항성과 의 연관성이 밝혀졌으나 아직 관련 치료제 개발은 이 루어지지 못하고 있다10-12).
방풍통성산 (防風通聖散)은 금원시대 유완소의 ≪宣 明方論≫에 최초로 수록된 처방으로 發汗과 大便排泄, 解熱 등의 효능이 있어 임상에서 食積型 肥滿에 효과
적인 것으로 알려져 있다13). 방풍통성산이 비만에 미치 는 영향에 관한 선행연구로 류 등14)은 비만 환자에 대 한 방풍통성산의 치료효과를 보고하였고, 안 등15)은 방 풍통성산이 고지방식이 흰쥐의 간 조직 내 지방축적을 억제시킴을 보고하였다. 또한 황 등16)은 고지방식이 비 만 생쥐의 체중과 지방 중량의 감소 및 일차 지방세포 에서 β3AR의 발현 증가를 보고하였고, 신 등17)은 세포 내 지질축을 유도하는 효소와 성지질의 세포내 축을 억제하는 효과가 발현됨을 보고하였다.
한의학에서는 간의 기혈순환 기능이 저하되면 濕痰 이 쌓여 비만이나 지방간과 같은 질환을 일으킨다고 인식하였다. 또한 최근 보고에서 지방간과 당뇨의 관 련성을 제시하고 있다18). 따라서 한의학의 淸熱利濕法 이 지방간 및 인슐린저항성을 개선시킬 수 있을 것으 로 생각되어 본 연구를 시작하게 되었다.
NAFLD에 대한 한약 치료의 선행연구로 적소두19), 곤포20), 청간탕 (淸肝湯)21), 인진22), 강지환 (降脂丸)23), 가미소체환 (加味消滯丸)23) 등을 이용한 세포 및 동물 실험에서 유의한 효과가 있음이 보고된 바 있다.
본 연구는 20주 동안 고지방식이 섭취를 통해 NAFLD를 유발시킨 생쥐에서 방풍통성산의 지방대사 조절을 통하여 인슐린저항성을 조절하는 데 효과가 있 음을 확인하였기에 보고하는 바이다.
Ⅱ. Materials and Methods
1. 실험동물
태령 6주 C57BL/6계 수컷 생쥐 (오리엔트, 한국)를 무균사육장치내에서 2주일 동안 적응시킨 후 체중 20 g 된 생쥐를 선별하여 사용하였다. 대조군 (Ctrl), 고지 방식이 섭식군 (HFF), 고지방식이 섭식과 방풍통성산 투여군 (BT1), 고지방식이 섭식과 방풍통성산 배방 (倍 方) 투여군 (BT2)으로 나누어, 각 군에 10마리씩 배정 하였다. 실험기간 20주 동안 high fat diet (fat, 60%; car- bohydrate, 20%; protein, 20%; DIO DIET, USA)를 자유 섭식하도록 하였다. 방풍통성산 추출물 투여에 따른 부작용을 조사하기 위해서 태령 20주 생쥐를 8주간 방 풍통성산만 투여한 군 (OBT1)과 8주간 방풍통성산 배 방만 투여한 군 (OBT2)으로 나누어, 각 군에 10마리씩 배정하였다.
동물실험은 세명대학교 동물실험윤리위원회의 승
인 (No. smecae-2017-08-01) 후 실시되었고, 실험실 동 물의 관리와 사용에 대해서는 NIH 가이드라인에 따라 시행되었다.
2. 실험약물
방풍통성산 (Bangpungtongsungsan, BT)은 세명대학 교 제천한방병원에서 조제하여 사용하였다 (Table 1).
방풍통성산 4첩을 증류수 1500 ㎖에 넣고 3시간 동안 전탕한 후 여과하였다. 그 여액을 rotary evaporator를 이용하여 50 ㎖으로 감압, 농축한 후 동결 건조하여 추 출물 42 g (수득률 21.2%)을 사용하였다. 방풍통성산 배방 4첩도 동일한 방법을 적용하여 추출물 71 g (수득 률 17.9%)을 사용하였다. 투여량은 BT1군에 0.35 ㎎/
㎏, BT2군에 0.59 ㎎/㎏로 투여하였다. 고지방식이 섭 식 12주 후부터 BT 추출물을 생리식염수에 녹여 0.1
㎖ 량으로 8주 동안 BT1과 BT2에 경구 투여하였다.
Table 1. The Amount and Composition of Bangpungtongsungsan Extract
韓 藥 名 生 藥 名 重量 (g)
滑石 Talcum 7
防風 Saposhnikoviae Radix 2
甘草 Glycyrrhizae Radix 5
當歸 Angelicae Gigantis Radix 2
川芎 Cnidii Rhizoma 2
赤芍藥 Paeoniae Radix Rubra 2
梔子 Gardeniae Fructus 1.5
大黃 Rhei Rhizoma 2
荊芥 Schizonepetae Spica 1.5
白朮 Atractylodis Rhizoma Alba 1.5
石膏 Gypsum 3
薄荷 Menthae Herba 2
麻黃 Ephedrae Herba 2
芒硝 Natrii Sulfas 2
連翹 Forsythiae Fructus 2
桔梗 Platycodi Radix 3
黃芩 Scutellariae Radix 3
生薑 Zingiberis Rhizoma Crudus 6
Total 49.5
3. 혈액검사
혈액검사는 방풍통성산 투여 8주 후 심장천자를 통해 얻어진 혈액을 사용하였다. Total cholesterol은 혈청을 분리 후 Cholesterol E kit (BC 108-E, 영동제약, 한국)로 측정하였다. Glucose는 채취된 혈액을 혈당계 (Freestyle, Therasense Inc, USA)로 측정하였다.
4. 조직화학
간 조직을 10% Neutral buffered formalin 용액에 12 시간 동안 처리하였다. 고정된 조직은 파라핀 (Sigma, USA)에 포매하여 5 ㎛ 두께의 연속절편으로 제작하였 다. 지방화에 따른 간 조직 내 형태 변화를 Hematoxylin
& Eosin 염색 후 관찰하였다. 또한 고정된 간 조직을 10% formol-calcium에 1주일 동안 oxidation 처리하였 다. Cryo-protection을 위해 30% sucrose 용액에 처리된 조직을 O.C.T. compound (Fisher, USA)에 포매한 후 냉 동절편기 (Microm, Germany)를 이용하여 10 ㎛ 두께의 냉동절편으로 제작하였다. 냉동절편을 Sudan Black B 염색을 한 후 지방분포 차이를 관찰하였다.
5. 면역조직화학
지방대사 변화를 관찰하기 위해 PPARγ co-activator (PGC)-1 항체, 지방화에 따른 산화적 스트레스 변화를 관찰하기 위해 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG) 항체, 지방간에 따른 염증 변화를 관찰하기 위해 phos- pho-IκB (p-IκB) 항체, 그리고 지방화에 따른 인슐린저 항성 변화를 관찰하기 위해 phospho-c-Jun N-terminal kinase (p-JNK) 항체를 이용한 면역조직화학적 염색을 실시하였다. 간 조직을 proteinase K (20 ㎍/㎖)에 5분 동안 proteolysis 과정을 거친 후 blocking serum인 10%
normal goat serum에 4시간 동안 실온에서 반응시켰다.
그리고 1차 항체인 mouse anti-PGC-1 (1:100), mouse anti-8-OHdG (1:100), mouse anti-p-IκB (1:250), mouse anti-p-JNK (1:100)에 4 ℃ humidified chamber에서 72 시간 동안 반응시켰다. 그런 다음 2차 항체인 bio- tinylated goat anti-mouse IgG2a (1:100)에 4 ℃ humidi- fied chamber에서 48시간 동안 반응하였다. 모든 항체 는 Santa Cruz Biotec (USA) 제품을 사용하였다. 이후 avidin biotin complex kit (Vector Lab, USA)를 이용하여 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 0.05% 3,3'-dia- minobenzidine과 0.01% HCl이 포함된 0.05 M tris-HCl 완충용액 (pH 7.4)에서 발색시킨 후, hematoxylin으로 대조염색하였다.
6. 영상분석
면역조직화학의 결과는 image Pro Plus (Media cy- bernetics, USA)를 이용한 영상분석을 통해 수치화 (means ± standard error) 되었다. 각 군의 표본에서 임의 로 선정된 간 조직을 ×100 배율에서 촬영한 다음 pos-
itive pixels /20,000,000 pixels로 영상을 분석하였다.
7. 통계
통계는 SPSS software (SPSS 23, SPSS Inc., USA)를 사 용하였으며, one-way ANOVA를 통해 유의성 (p<0.05) 을 검증하고 Tukey HSD로 사후 검증하였다.
Ⅲ. Results
1. 체중 변화
고지방식이 섭식 12주 후 HFF군은 91%, BT1군은 91%, BT2군은 94%로 정상식이를 섭식한 Ctrl군의 27%보다 큰 체중 증가를 보였다. 이후 8주간의 방풍통 성산 추출물 투여는 체중 증가를 둔화시켰다. 20주 후 HFF군의 체중이 36% 증가한 반면, BT1군은 13%, BT2군은 4% 증가하였다. 또한 방풍통성산 배방 추출 물을 투여한 BT2군의 체중 증가가 BT1군에 비해 유의 성 있게 낮았다 (p<0.05) (Table 2).
2. 지방방울 분포변화
HFF군의 간 조직에서는 지방방울 (lipid blot)이 가 득 찬 그물모양 (mesh-like type)의 세포질을 가진 지방 축적 간세포들과 큰 지방방울 덩어리가 세포질에 찬 지방축적 간세포들이 다수 관찰되었다. BT1군에서는 HFF군에 비해 적은 수의 지방축적 간세포가 중심정맥 (central vein)과 문맥 (portal vein) 사이 중간에서만 관찰 되었다. 큰 지방방울 덩어리가 가득 찬 세포질을 가진 지방축적 간세포는 BT2군의 간 조직에서 BT1군에 비 해 낮은 분포를 보였다 (Fig. 1).
HFF군의 간 조직에서는 검고 진하게 염색된 다양한 크기의 지방방울을 포함하고 있는 간세포가 다수 관찰 되었다. 이에 반해 BT1군은 옅게 염색된 작은 지방방 울이 축적된 간세포가 관찰되었고, 관찰 지역은 중심 정맥과 문맥 사이였다. BT2군은 BT1군에 비해 지방방 울의 분포가 적었다. Ctrl군 (23,129 ± 734 /20,000,000 pixels)에 비해 HFF군 (125,419 ± 2,389 /20,000,000 pixels)은 지방방울이 442% 증가되었다. BT1군 (77,549
± 1,625 /20,000,000 pixels)은 HFF군에 비해 38% 감소 되었고, BT2군 (46,025 ± 1,310 /20,000,000 pixels)은
Table 2. Effects of Bangpungtongsungsan on Body Weight in High Fat Diet Feeding Mice
Group Body Weight (g)
INI HF12W HF20W
Ctrl 20.0 ± 0.27 25.3 ± 0.34 30.2 ± 0.35
HFF 20.4 ± 0.34 39.0 ± 0.58 53.0 ± 0.61
BT1 20.4 ± 0.24 38.9 ± 0.43 43.8 ± 0.51*
BT2 20.3 ± 0.22 39.3 ± 0.56 40.9 ± 0.59*,#
Ctrl, General diet feeding C57BL/6 mice; HFF, High fat diet feeding C57BL/ 6 mice; BT1, High fat diet feeding C57BL/6 with Bangpungtongsungsan (0.35 ㎎/㎏/day) extract for 8 weeks; BT2, High fat diet feeding C57BL/6 with double prescribed Bangpungtongsungsan (0.59 ㎎/㎏/day) extract for 8 weeks; INI, 8th week old mice; HF12W, High fat diet feeding mice for 12 weeks; HF20W, High fat diet feeding mice for 20 weeks;
*, p<0.05 compared with HFF; #, p<0.05 compared with BT1
Fig. 1. The mitigative effects of Bangpungtongsungsan in hepatic tissue of mice with non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) H&E, Hematoxylin and Eosin stain; CV, central vein; PV, portal vein; Asterisk, aggregation of hepatocyte with lipid deposition; Arrow, sudan black B stain positive lipid blot; Bar size, 100 ㎛; *, p<0.05 compared with HFF; #, p<0.05 compared with BT1
HFF군에 비해 63% 감소되었다. 또한 BT2군은 BT1군 에 비해 41% 감소되었다 (Fig. 1).
3. PGC-1 발현
PGC-1 발현은 지방축적 간세포의 핵과 핵막에서 강 한 양성으로 관찰되었다. HFF군의 간 조직에서는 PGC-1 양성반응 (101,670 ± 2,405 /20,000,000 pixels) 이 Ctrl군 (10,566 ± 402 /20,000,000 pixels)에 비해 862% 증가하였다. BT1군 (73,370 ± 1,741 /20,000,000 pixels)은 HFF군보다 28%, BT2군 (34,851 ± 1,091 /20,000,000 pixels)은 HFF군보다 66% 감소되었다. 또 한 BT2군은 BT1군에 비해 53% 유의성 있게 감소되었 다 (Fig. 2).
4. 항염증효과
p-IκB 양성반응은 중심정맥과 문맥 주변에 분포하 는 그물모양 세포질을 가진 지방축적 간세포의 핵과 핵막에서 강한 양성으로 관찰되었다. HFF군에서는 p-I κB 양성반응 (89,295 ± 1,781 /20,000,000 pixels)이 Ctrl 군 (13,379 ± 1,016 /20,000,000 pixels)에 비해 567% 증 가하였다. BT1군 (55,355 ± 1,621 /20,000,000 pixels)은 HFF군보다 38%, BT2군 (35,192 ± 1,407 /20,000,000 pixels)은 HFF군보다 61% 감소되었다. 또한 BT2군은 BT1군에 비해 36% 유의성 있게 감소되었다 (Fig. 3).
8-OHdG 양성반응은 중심정맥과 문맥 주변에 분포 하는 그물모양 세포질을 가진 지방축적 간세포의 세포 질에서 강한 양성으로 관찰되었다. HFF군의 간 조직에 서는 8-OHdG 양성반응 (125,910 ± 2,108 /20,000,000 pixels)이 Ctrl군 (15,286 ± 602 /20,000,000 pixels)에 비해
724% 증가하였다. BT1군 (65,367 ± 1,232 /20,000,000 pixels)은 HFF군보다 48%, BT2군 (42,908 ± 1,204 /20,000,000 pixels)은 HFF군보다 66% 감소되었다. 또 한 BT2군은 BT1군에 비해 34% 유의성 있게 감소되었 다 (Fig. 3).
5. 인슐린저항성 조절
p-JNK 양성반응은 중심정맥과 문맥 사이에 분포하 는 큰 지방방울 덩어리가 세포질에 찬 지방축적 간세 포들의 세포질에서 강한 양성으로 관찰되었다. HFF군 의 간 조직에서는 p-JNK 양성반응 (150,576 ± 2,896 /20,000,000 pixels)이 Ctrl군 (8,478 ± 483 /20,000,000 pixels)에 비해 1,676% 증가하였다. BT1군 (73,269 ± 2,078 /20,000,000 pixels)은 HFF군보다 51%, BT2군 (38,168 ± 1,844/ 20,000,000 pixels)은 HFF군보다 75%
감소되었다. 또한 BT2군은 BT1군에 비해 48% 유의성 있게 감소되었다 (Fig. 4).
6. Total cholesterol 및 Glucose 변화
Total cholesterol은 HFF군 (675 ± 6 ㎎/㎗)이 Ctrl군 (200 ± 6 ㎎/㎗)에 비해 238% 높았다. BT1군 (528 ± 5
㎎/㎗)은 HFF에 비해 22% 감소되었으며, BT2군 (445 ± 4 ㎎/㎗)은 HFF에 비해 34% 감소되었다. 특히, BT2군은 BT1군에 비해서도 16% 유의성 있게 감소되었다 (Fig. 5).
Glucose는 HFF군 (462 ± 9 ㎎/㎗)이 Ctrl군 (151 ± 5 ㎎/㎗)에 비해 206% 높았으며, BT1군 (324 ± 8 ㎎/
㎗)은 HFF군에 비해 30%, BT2군 (255 ± 4 ㎎/㎗)은 HFF군에 비해 45% 감소되었다. 특히, BT2군은 BT1군 에 비해 21% 유의성 있게 감소되었다 (Fig. 5).
Fig. 2. The regulation of lipogenesis in hepatic tissue of mice with NAFLD by Bangpungtongsungsan Arrow, PGC-1 positive reaction; Other abbreviations same as Fig. 1.
Fig. 3. The decrease of hepatic stress and anti-inflammation in hepatic tissue of mice with NAFLD by Bangpungtongsungsan (p-IκB and 8-OHdG immunohistochemistry)
8-OHdG, 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine; p-IκB, phospho-IκB; arrow, immunohistochemistry positive reaction; Other abbreviations same as Fig. 1.
Fig. 4. The alleviation of insulin resistance in hepatic tissue of mice with NAFLD by Bangpungtongsungsan (p-JNK immunohistochemistry)
p-JNK, phospho-c-Jun N-terminal kinase; arrow, p-JNK positive reaction; Other abbreviations same as Fig. 1.
Fig. 5. The decrease of total cholesterol & glucose in blood by Bangpungtongsungsan
*, p<0.05 compared with HFF; #, p<0.05 compared with BT1
7. 방풍통성산 추출물 투여에 따른 부작용 유발 여부 방풍통성산 추출물이 8주 동안 투여된 OBT1군과 OBT2군의 간 조직에서 부작용은 관찰되지 않았다 (Fig. 6).
Ⅳ. Discussion
NAFLD의 유병률은 세계 여러 국가에서 증가하고 있으며 국내에서도 최근 증가하고 있다. 국가마다 차 이가 있지만 선진국에서는 전체 인구의 약 20~30%로 보고되고 있으며, 이러한 유병률의 증가는 성인과 소 아 비만의 증가와 관련성이 높다24). 최근 NAFLD는 인 슐린저항성을 근간으로 한 비만, 고혈압, 제2형 당뇨 병, 지질대상이상과 같이 간에 나타나는 대사증후군의 한 상태로 간주되고 있다. NAFLD 환자의 다수는 유의 미한 섬유화가 없는 단순 지방간으로 임상경과가 양호 하다25). 하지만 NAFLD 환자의 약 10~20%에서 NASH 가 발생하며 이 중 약 9~25%는 간경변증으로 진행된
다26-28). 간경변증이 발병하면 간세포암의 발생 가능성
이 증가하고, 10년 이상 경과하면 이 중 30~40%는 간 질환의 합병증으로 사망하게 된다.
한의학에서 肝은 疏泄 기능을 통해 인체의 氣血을 소통시키며, 이러한 기능이 떨어지면 지방에 해당되는 濕痰이 쌓여 비만 및 지방간을 일으키게 된다고 인식 하였다. 특히 肝腎同源이라 하여 肝의 기운이 鬱結되 어 火를 생성하면 腎陰이 燥하여 消渴, 즉 당뇨나 황달 이 잘 생긴다고 하여 지방간과 당뇨와의 관련성을 제 시하고 있다29). 이러한 이론적 근거를 토대로 肝에 濕 痰이 쌓이면 濕熱로 질병을 유발하므로 한의학의 淸熱 利濕法이 지방간 및 인슐린저항성을 개선시킬 수 있을
것으로 생각된다.
방풍통성산은 이러한 淸熱利濕法의 대표적인 처방 이다. 방풍통성산에 대한 실험 연구로는 추출방식에 따른 지방세포 대사에 미치는 영향30), 비만유도 흰쥐의 항고지혈 효과 및 항산화 효과31), 고지방식이를 한 흰 쥐의 체지질구성과 항산화능에 미치는 영향32), 고혈압 및 고지혈증에 미치는 영향33)을 보고한 연구가 있다.
방풍통성산은 風熱과 飢飽勞役의 內外諸邪에 손상 되어 氣血이 鬱滯되고 表裏와 三焦가 俱實한 증상을 치료한다13). 따라서 諸風熱, 瘡疹, 瘡疥, 頭生白屑, 面 鼻紫赤, 肺風瘡, 大風癩疾, 熱結二便不通, 酒毒에 사 용하며 發汗, 大便排泄, 解熱의 효과가 있다34).
방풍통성산은 滑石, 甘草, 石膏, 黃芩, 桔梗, 防風, 川芎, 當歸, 赤芍藥, 大黃, 麻黃, 薄荷, 連翹, 芒硝, 荊 芥, 白朮, 梔子, 生薑으로 구성된다35). 防風, 荊芥, 薄 荷, 麻黃은 발한케 하여 상부의 邪氣를 발산시키고, 大 黃, 芒硝, 梔子, 滑石은 利小便하여 하부의 邪氣를 배 설한다. 또한 桔梗, 石膏는 淸肺瀉胃하고, 川芎, 當歸, 芍藥은 和血益肝하며, 黃芩은 淸中上二焦之火하고, 連翹는 散氣聚血凝하여 신체의 毒熱을 치료한다. 甘 草는 緩峻而和中하고 滑石과 함께 육일산 (六一散)이 되어 利水瀉熱한다. 白朮은 健脾而燥濕하여 上下分消 하고 表裏交治하며 散邪하는 동시에 溫陽하게 한다.
본 연구에서는 이러한 방풍통성산의 지방대사조절 을 통하여 NAFLD로 유도된 인슐린저항성에 대한 개 선 효과를 알아보고자 하였다.
비만과 인슐린저항성이 있는 사람의 경우 간으로 유리지방산 (free fatty acid, FFA)의 유입이 증가하게 되 며, FFA는 베타산화과정 (β-oxidation) 또는 중성지방 (triglyceride, TG)의 에스테르화를 통해 간 내 지방축적 이 이루어지게 된다. 이에 따라 지방이 축적되면 PGC-1 의 발현이 증가하게 되고, 증가된 PGC-1에 의해 지방 Fig. 6. No side effect in hepatic tissue of mice by Bangpungtongsungsan administration
Ctrl, No treated mice; OBT1, BT (0.35 ㎎/㎏/day) extract administration for 8 week; BT2, double prescribed Bangpungtongsungsan (0.59 ㎎/㎏/day) extract administration for 8 week; CV, central vein; PV, portal vein; Bar size, 100 ㎛
산 합성효소인 Acetyl CoA carboxylase-1 (ACC)와 Fatty acid synthase (FAS) 유전자의 발현이 촉진되어, 간에서 지방산 합성을 위한 glucose의 acetyl-CoA로의 전환이 증가함으로써 간 내 지방축적이 가속화된다36). 또한 과 도한 FFA 자체로 인한 산화적 스트레스의 증가와 염증 신호전달과정의 활성화에 의해 직접적인 간 손상이 일 어나고 이에 대한 보호기전으로 간 내 TG가 축적된다
37,38). 이러한 간세포 사멸과 불충분한 복구는 궁극적으
로 간섬유화와 질병의 진행을 유발한다39).
본 연구에서는 먼저 방풍통성산이 체중을 조절하여 비만을 억제시킬 수 있는지 확인하고자 생쥐의 체중을 측정하여 비교하였다. 12주 동안 고지방식이를 섭식한 HFF군, BT1군, BT2군이 정상식이를 섭식한 Ctrl군보 다 큰 체중 증가를 보였으나, 이후 8주 동안 방풍통성 산 추출물을 같이 투여한 BT1군과 BT2군은 HFF군에 비해 체중 증가가 급격하게 둔화되었다. 또한 방풍통 성산 배방 추출물을 투여한 BT2군의 체중 증가는 BT1 군에 비해 유의성 있게 낮았다 (p<0.05). 이는 방풍통성 산이 실제로 비만한 상태에서 체중의 급격한 증가를 완화시킬 수 있음을 의미한다.
이를 확인하고자 본 연구에서는 지방축적 간세포들 을 관찰하였다. 20주 동안 고지방식이가 투여된 HFF 군의 간 조직에서 관찰된 형태적 변화는 지방방울이 가득 찬 그물모양 (mesh-like type)의 세포질을 가진 지 방축적 간세포들과 큰 지방방울 덩어리가 세포질에 찬 지방축적 간세포들이 많았다. 이에 비해 8주 동안 방풍 통성산 추출물이 투여된 BT1군에서는 HFF군에 비해 적은 수의 지방축적 간세포가 중심정맥과 문맥의 사이 에서 관찰되었다. 방풍통성산 배방 추출물이 투여된 BT2군의 간 조직에서는 큰 지방방울 덩어리가 가득 찬 세포질을 가진 지방축적 간세포가 BT1군에 비해 낮은 분포를 보였다.
또한 sudan black B 염색을 통해 관찰한 간 조직 내 지방방울의 분포변화는 HFF군에서는 검고 진하게 염 색된 다양한 크기의 지방방울을 포함하고 있는 간세포 가 다수 관찰되었으나, BT1군은 옅게 염색된 작은 지 방방울이 축적된 간세포가 관찰되었다. Ctrl군에 비해 HFF군은 지방방울이 높게 증가하였으나, BT1군은 HFF군에 비해 감소되었고, BT2군도 HFF군에 비해 감 소되었다. BT2군은 BT1군에 비해 지방방울의 분포가 41% 유의성 있게 감소되었다 (p<0.05).
지방대사에 관여하는 PGC-1 발현은 면역조직화학 적 염색을 통하여 관찰하였으며, PGC-1 양성반응은 지
방축적 간세포의 핵과 핵막에서 강한 양성으로 나타났 다. HFF군의 간 조직에서는 PGC-1 양성반응이 Ctrl군 에 비해 862%로 높게 증가하였다. 이에 비해 방풍통성 산 추출물 투여는 PGC-1 양성반응을 감소시켰는데, BT1군은 HFF군보다 28%, BT2군은 HFF군보다 66%
나 감소되었다. 또한 BT2군에서 PGC-1 양성반응은 BT1군에 비해서도 53% 유의성 있게 감소되었다 (p<0.05).
이러한 내용은 혈청 total cholesterol 수치를 통하여 다시 확인할 수 있었다. 혈청 total cholesterol은 Ctrl군 에 비해 HFF군이 높았으나, 이에 반해 BT1군은 HFF군 에 비해 22%, BT2군은 HFF군에 비해 34% 감소되었 다. 특히, BT2군은 BT1군에 비해 16% 유의성 있게 감 소되었다 (p<0.05).
이러한 조직학적, 면역조직화학적 결과와 혈액학 적 결과들은 방풍통성산이 실제로 간 조직 내에서 지 방대사조절에 관여하고 있음을 분명하게 보여주고 있다.
지방축적이 간에서 과도하게 이루어지면 지방대사 조절에 문제가 생기면서 염증이 발생한다. 단순한 지 방축적 소견만 보이는 지방간에서 염증소견이 동반된 지방간염으로의 이행은 지방축적과 더불어 손상받기 쉬운 상태가 된 간세포에 이차적 타격 (second hit)이 가해짐으로써 나타나는 현상이다. 이는 과도한 지방축 적과 지질의 과산화 등에 따른 반응성 산소기 (reactive oxygen species)의 생성, 패혈증과 동반된 사이토카인의 발현 증가 등이 주요 요인으로 고려되고 있다40). 염증 질환에서는 비만세포와 대식세포가 자극되면 nuclear factor (NF)-κB, nitric oxide와 같은 물질들이 분비된다.
염증 시 iNOS의 발현은 염증효소전사인자인 NF-κB에 의해 조절되는데, 염증반응 시 inhibitor of NF-κB (IκB) 의 인산화 (phosphorylation)가 증가하여 염증효소전사 인자 NF-κB의 핵 내로 translocation하여 들어가 target 유전자의 NF-κB binding site에 결합하여 염증 관련 유 전자의 발현을 유도한다41). NF-κB는 염증반응에 주요 한 전사인자로, pro-inflammatory mediators의 유전자 발현 조절을 통하여 hypoxia-inducible factor (HIF)-1이 나 cyclooxygenase (COX)-2를 조절하며, 혈관 투과성을 증가시키고, 부종 등의 염증반응을 촉진한다42,43).
본 연구에서는 염증 유도에 관여하는 NF-κB의 활성 조절을 확인하고자 p-IκB 양성반응을 조사하였다. p-Iκ B 양성반응은 중심정맥과 문맥 주변에 분포하는 그물 모양 세포질을 가진 지방축적 간세포의 핵과 핵막에서
강한 양성으로 관찰되었다. HFF군에서는 p-IκB 양성 반응이 Ctrl군에 비해 567%로 높게 증가하였다. 이에 비해 방풍통성산 추출물 투여는 p-IκB 양성반응을 감 소시켰는데, BT1군은 HFF군보다 38%, BT2군은 HFF 보다 61%로 감소한 것이 관찰되었다. 또한 BT2군의 p-IκB 양성반응은 BT1군에 비해 유의성 있게 감소되 었다 (p<0.05).
산화적 스트레스가 증가하면 8-OHdG의 생성이 증 가하게 된다. 8-OHdG 양성반응은 중심정맥과 문맥 주 변에 분포하는 그물모양 세포질을 가진 지방축적 간세 포의 세포질에서 강한 양성으로 관찰되었다. HFF군의 간 조직에서는 8-OHdG 양성반응이 Ctrl군에 비해 높 게 증가하였으며, 방풍통성산 추출물을 투여한 BT1군 과 BT2군은 HFF군보다 감소되었다. 또한 BT2군의 8-OHdG 양성반응은 BT1군에 비해 유의성 있게 감소 되었다 (p<0.05).
이러한 결과는 방풍통성산이 간 내 지방이 과도하 게 축적되어 지방간염으로 진행되는 것을 완화 혹은 감소시킬 수 있음을 의미한다. 비만하면서 간 내 지방 축적이 높은 상태에서 지속적인 고지방식이 섭취는 지 방에 의한 산화적 스트레스를 증가시키고 지방간염으 로의 이행 가능성을 높인다. 본 연구 결과를 통해 방풍 통성산 투여가 이러한 가능성을 줄일 수 있음을 확인 하였다.
지방에 의한 산화적 스트레스 증가는 염증 및 순환 장애를 유발하며, 지방간에 의한 인슐린저항성 증가 는 고인슐린증 및 내당장애를 일으킨다. 임상적으로 NAFLD와 연관성 있는 질병은 당뇨병, 비만, 고혈압, 고지혈증 등으로 대사증후군에 속하는 질환들이다. 대 사증후군은 인슐린저항성을 나타내는 것이 특징이며, NAFLD에서도 대부분 인슐린저항성이 증가되어 있다
40). 이로 인해 NAFLD 치료에 대한 중요성이 높아지고 있다.
인슐린저항성은 2형 당뇨병의 가장 중요한 선행요 인이고 대사증후군 발생의 핵심인자이므로 인슐린저 항성 발생기전에 근거한 치료가 필요하다. 기존에 사 용 중인 인슐린저항성 치료제인 Metformin은 주로 당 뇨 진단 후에 사용되며 위장관계 부작용을 유발하고 간 기능 장애 시 사용이 불가능하다9). Thiazolidinedione 은 부작용으로 간 손상이 보고되어 사용이 제한적이다.
현재까지 개발된 약물들의 경우 부작용으로 사용이 제 한적이며, 인슐린저항성 개선을 통해 NAFLD를 예방 하는 목적으로 사용되기는 어렵다44,45).
인슐린저항성에 관여하는 p-JNK의 양성반응은 중 심정맥과 문맥 사이에 분포하는 큰 지방방울 덩어리가 세포질에 찬 지방축적 간세포들의 세포질에서 관찰되 었다. HFF군에서는 p-JNK 양성반응이 Ctrl군에 비해 1,676%나 증가하였다. 이에 비해 BT1군은 HFF군보다 51%, BT2군은 75% 감소되었다. 또한 BT2군의 p-JNK 의 양성반응은 BT1군에 비해 48% 유의성 있게 감소되 었다 (p<0.05).
본 연구에서는 이러한 조절 효과를 보다 정확하게 확인하고자 혈당 수치를 측정하였다. 혈당은 Ctrl군과 비교하여 HFF군, BT1군, BT2군 모두 증가하였으나, BT1군은 HFF군에 비해 30%, BT2군은 HFF군에 비해 45% 적게 증가하였다. 또한 BT2군은 BT1군에 비해서 도 21%로 유의성 있게 감소되었다 (p<0.05). 이러한 면 역조직화학적 결과와 혈액학적 결과들은 방풍통성산 이 인슐린저항성 조절 효과가 있음을 의미한다.
또한 본 연구에서는 방풍통성산 추출물의 장기간 투여에 따른 부작용 유발을 확인하기 위해 8주간 방풍 통성산 추출물을 투여한 OBT1군과 방풍통성산 배방 추출물을 투여한 OBT2군의 간 조직을 관찰하였으나 부작용을 의심할 근거는 발견하지 못했다.
본 연구는 이러한 연구 결과를 근거로 방풍통성산 이 지방대사조절을 통하여 비알콜성 지방간증을 완화 시키는 효과가 있으며, 비알콜성 지방간으로 인하여 유도된 인슐린저항성을 개선시키는 효과가 있음을 확 인하였다. 현재 Metformin이 일부 부작용이 있음에도 불구하고 인슐린저항성 당뇨 치료제로 사용되고 있다.
본 연구는 방풍통성산의 원방과 배방으로만 비교 연구 를 하였기에, 향후 후속 연구로 Metformin과의 비교 연 구를 통해 방풍통성산의 인슐린저항성 조절 효과 정도 에 대한 확인이 필요할 것으로 생각된다.
Ⅴ. Conclusion
방풍통성산의 지방대사조절을 통한 비알콜성 지방 간 유도 인슐린저항성 개선 효과를 확인하기 위해 본 연구는 태령 6주의 수컷 생쥐에 고지방식이를 섭식시 킨 후 방풍통성산을 투여하여 생쥐의 체중 변화, 지방 방울 분포, PGC-1 양성반응, 항염증작용, 인슐린저항 성 조절, total cholesterol 및 glucose 변화를 통해 다음과 같은 결과를 얻었다.
1. 체중 측정 결과 방풍통성산을 투여한 고지방식이 섭식군이 단순 고지방식이 섭식군에 비해 체중 증가가 유의하게 감소되었다.
2. 지방방울 분포 및 PGC-1 양성반응은 방풍통성산 투여군에서 증가가 유의하게 감소되었다.
3. 간 조직의 p-IκB, 8-OHdG 양성반응은 방풍통성 산 투여군에서 증가가 유의하게 감소되었다.
4. 간 조직의 p-JNK 양성반응은 방풍통성산 투여군 에서 증가가 유의하게 감소되었다.
5. Total cholesterol 및 Glucose 수치는 방풍통성산 투 여군에서 증가가 유의하게 감소되었다.
Acknowledgement
이 논문은 2017학년도 세명대학교 교내학술연구비 지원에 의해 수행된 연구임.
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