Effects of Trachelospermum caulis Extract on Sodium Nitroprusside (SNP)-induced Inflammatory Responses in Rabbit HIG-82 Synovial Membrane Cells

낙석등 추출물이 토끼 HIG-82 활액막 세포주에서 Sodium Nitroprusside (SNP)로 유도된 염증반응에 미치는 영향

박정식⋅임형호

가천대학교 한의과대학 한방재활의학과교실

Effects of Trachelospermum caulis Extract on Sodium Nitroprusside (SNP)-induced Inflammatory Responses in Rabbit HIG-82 Synovial Membrane Cells

Jung-Sik Park, K.M.D., Hyung-Ho Lim, K.M.D.

Department of Korean Medicine Rehabilitation, College of Korean Medicine, Gachon University

이 논문은 2013년도 가천대학교 지원에 의한 결과임.

RECEIVED March 18, 2014 REVISED April 4, 2014 ACCEPTED April 7, 2014

CORRESPONDING TO

Hyung-Ho Lim, Department of Korean Medicine Rehabilitation, College of Korean Medicine, Gachon University, 1200-1, Guwol 1-dong, Namdong-gu, Incheon 405-835, Korea

TEL (070) 7120-5011 FAX (032) 468-4033 E-mail [email protected]

Copyright © 2014 The Society of Korean Medicine Rehabilitation

Objectives Trachelospermi caulis , known as Nak-Suk-Deung in Korea, is the dried leafy stem of Trachelospermum asiaticum var. intermedium Nakai , and climbing stems and branches of Trachelospermum sdisyivum var, intermedium nakai or Apocyanaceae . Trachelospermi caulis has antipyretic and analgesic activity. It has traditionally been used as a folk remedy in Korea for the treatment of various infla mMatory diseases, including rheumatoid arthritis. The purpose of this study was to evaluate the Effects of Trachelosper- mum caulis extract on SNP-induced infla mMatory responses in rabbit HIG-82 synovial membrane cells.

Methods Anti-infla mMatory effects of the extract of Trachelospermum caulis were inves- tigated using rabbit HIG-82 synovial membrane cells. For this study, 3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay, western blot analysis, PGE2 i mMuno- assay, and NO detection were conducted.

Results The aqueous extract of Trachelospermum caulis exerted cytotoxicity and sup- pressed PGE2 synthesis and NO production in rabbit HIG-82 synovial membrane cells. The aqueous extract of Trachelospermum caulis also inhibited the SNP-induced expressions of COX-2, iNOS, and TNF-α in rabbit HIG-82 synovial membrane cells.

Conclusions These results showed that the extract of Trachelospermum caulis exerts the anti-infla mMatory effect by suppressing COX-2, iNOS, and TNF-α expressions in the synovial membrane cells. (J Korean Med Rehab 2014;24(2):31-40)

Key words Trachelospermum caulis , infla mMation, COX-2, iNOS, TNF-α, PGE2, NO

서론»»»

염증은 박테리아와 같은 이물질이나 때론 내부에서 생 성된 물질로 인해 복잡하고 국소적인 반응을 보이는 것으 로 생체나 조직기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 손상 부위를 재생하려는 기전으로^1,2) 세포내 다양한 염증

조절인자들인 Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) 등 과 같은 Proinfla mMatory cytokines, Prostagrandin, Lysosomal enzyme, Free radicals 등 다양한 매개물질이 관여한다^3,4). 특히 Cytokines, TNF-α와 같은 자극에 의 해 염증 반응의 전사 인자를 활성화시키며 그 결과 Inducible nitric oxide synthase (iNOS), Cyclooxyge-

nase-2 (COX)-2를 발현시켜 Nitric oxide (NO)와 Prosta- glandin (PG)E2를 생성하여 염증을 일으킨다^5,6).

임상적으로 활막의 염증은 부종, 압통, 운동 제한 등의 증상을 유발한다. 이러한 동통과 염증으로 인한 초기 관 절운동장애는 활동성 류마티스관절염의 흔한 초기증상이 다. 류마티스 관절염은 가장 흔히 접할 수 있는 관절 활 액막 염증성 질환으로 말단 관절을 침범하는 지속적인 염 증성 활액막염이며 대칭적으로 분포한다⁷⁾. 류마티스 관절 염에 현재 쓰이고 있는 약물로 aspirin, 비스테로이드성 소염제, 단순 소염제, 부신피질호르몬제, 질환 변형 약제 (DMARD: disease modifying antirheumatic drug), 항 TNF-α제제, 면역억제제, 세포독성 억제제 등의 약물이 광범위하게 사용되고 있다. 이런 약물들은 골수억제, 고 혈압, 간과 신장의 기능장애 등 심각한 부작용으로 인하 여 사용에 제약이 따르는 경우가 많아 보다 효과적이며 안정성이 입증된 치료제의 개발 연구가 필요한 실정이다⁸⁾.

낙석등(

Trachelospermum caulis

대상 및 방법»»»

1. 세포배양

토끼 활액막 세포주인 HIG-82는 American Type

Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)으로부터 구입하였다. HIG-82를 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA)을 넣은 Ham's F-12 nutrient mix medium (Ham's F-12, GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 배양액으로 5% CO2, 95% O2가 공급 되는 배양기에서 37^oC 조건으로 배양하였으며, 배지는 3 일마다 교체하였다.

2. 낙석등 추출

본 실험에 사용한 낙석등(가천대학교 부속 길한방병원 약제실) 추출물은 50 g을 1 L의 3차 증류수에 넣어 80^oC 에서 2시간 동안 추출하고, rotary evaorator (Eyela, Tokyo, Japan)를 사용하여 농축하였다. 그리고 농축된 낙석등을 24시간 동안 동결건조 (Eyela)하여 13.60 g (收率 27.2%) 의 시료를 얻었다.

3. 세포 독성 측정

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (MTT) cytotoxicity 분석은 세포배양에서 생존 하는 세포의 수를 측정하는 방법으로 살아있는 세포의 mitochondrial dehydrogenase가 기질 MTT를 검푸른 색 깔의 formazan으로 변환시키는 작용을 이용한다. 흡광도 (OD; optical density)의 값은 살아있는 세포의 수를 반영 하므로 세포생존 지수는 다음의 산출식에 따라 %로 나타 내었다.

세포생존지수(%)=

(실험군의 흡광도/대조군의 흡광도)×100 세포를 10% FBS가 함유된 Ham's F-12 medium에서 5% CO2-95% O2, 37^oC 온도 조건이 유지되는 세포 배양 기에서 배양하였다. 그리고 96 well plate에 well당 2.0×10⁴의 세포수가 되도록 분주하고 배양액 100 μl를 첨가하였다.

SNP (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)의 농 도에 따른 세포 독성을 알아보기 위하여 세포에 각각 0.5 mM, 0.75 mM, 1 mM의 SNP를 처치하여 24시간 동안 배 양하였다. 별도로 낙석등 추출물이 세포 독성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 세포에 각각 1 μg/ml, 10 μg/

ml, 100 μg/ml, 1,000 μg/ml의 낙석등 추출물 처치를

하고 1시간 후에 1 mM SNP를 처치를 하여 24시간 동안 배양하였다. 대조군으로는 낙석등 추출물 처치, SNP 처치 를 하지 않은 군을 사용하였다.

각각의 96 well plate에 MTT 용액을 10 μl 가한 뒤 알루미늄 호일로 덮어 빛에 노출되지 않게 하여 4시간 동 안 배양하였다. 배양 후 solubilization solution을 100 μl 씩 첨가하여 overnight reaction 후 enzyme-linked i mMunosorbent assay (ELISA) reader (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 595 nm와 690 nm에서 흡광도를 측정하였 다.

4. NO (Nitric oxide) 농도 측정

NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 nitric oxide detection kit (iNtRON Biotech, Gyeonggi-do, Korea)를 이용하여 측정하였다. HIG-82세포를 Ham's F-12 me- dium을 이용하여 24 well plate를 사용하여 5% CO2 항온 기에서 18시간 배양하였다. 0.5 mM, 0.75 mM, 1 mM의 SNP를 처치하여 NO 농도를 알아보기 위하여 24시간 동 안 배양하였다. 또한 낙석등이 NO 생성에 미치는 효과를 알아보기 위하여 세포에 100 μg/ml와 1,000 μg/ml의 낙석등 추출물을 전처리하고 1시간 후 1 mM의 SNP를 처 리하여 24시간 배양하였다. 배양 후 배양액을 각 집단별 로 100 μl 씩 96 well plate에 옮긴 후 N1 buffer를 50 μl 씩 넣은 후 10분간 반응시켰다. 대조군으로는 낙석등 추출물 처치, SNP 처치를 하지 않은 군을 사용하였다. 그 다음 N2 buffer를 50 μl 씩 한 후 10분간 반응시킨 후 ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하여 sodium nitrite의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액 내의 NO를 정량하였다.

5. PGE2 (Prostatglandin E2) 생성량 측정

HIG-82 세포로부터 생성되는 PGE2의 양을 측정하기 위해 먼저 세포를 24 well plate에 24 well plate에 배양 한 후 100 μg/ml와 1,000 μg/ml의 낙석등을 1시간 전 처치 후 1 mM SNP를 처리한 후에 24시간 동안 배양하였 다. 세포로부터 배양액을 100 μl 씩 goat anti-mouse i mMunoglobulin G-coated microtiter plate에 넣은 후 mous-anti-PGE2와 peroxidase가 conjugate된 PGE2를 각

well에 추가하여 2시간동안 반응시켰다. 그 다음 well의 용액을 제거하고 wash buffer로 wash 한 후 3,3',5,5'-tet- ramethylbenzidine/hydrogen peroxide 용액을 첨가하여 상온에서 shaking 하면서 반응시켰다. 대조군으로는 낙석 등 추출물 처치, SNP 처치를 하지 않은 군을 사용하였다.

그 다음 용액의 반응을 멈추기 위하여 H2SO4를 첨가한 후 450 nm 흡광도를 측정하였다.

6. Western blot 분석

1 mM SNP 처치 1시간 전에 낙석등 추출물을 각각 100 μg/ml, 1,000 μg/ml로 처치하고 24시간 동안 배양 한 후 HIG-82 세포를 PBS로 washing 후 extraction buf- fer (50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 10% glycer- ol, 1% Triton X-100, 1.5 mM magnesium chloride hex- ahydrate, 1 mM ethyleneglycol-bis-(β-aminoethyl ether)- N,N'-tetraacetic acid, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluo- ride, 2 μg/ml leupeptin, 1 μg/ml pepstatin, 1 mM sodium ortho vanadate, and 100 mM sodium floride)로 세포를 lysis 시켰다. 10분간 ice에 방치 후 4^oC에서 14,000 rpm으로 15분간 원심분리 하였다. 상층액을 새로 운 tube에 옮겨 단백질을 정량 후 사용하였다. 단백질의 정량은 Bio-Rad protein assay kit (Bio-Rad)를 사용하였 다. HIG-82 세포주에 lysis buffer를 넣고 4^oC에서 30분간 얼음에 방치하고 12,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여, 그 상층액을 실험에 사용하였다. 추출된 단백질 30 μg을 loading buffer와 혼합하여 10분간 끓이고, 10% SDS-pol- yacrylamide gel에서 전압 70 V로 전기영동 시켰다. 전기 영동 후 단백질을 transfer buffer를 이용하여 260 mA로 4^oC에서 90분 동안 nitrocellulose membrane (Whatman, Clifton, NJ, USA)에 옮긴 후, 5% skim milk (Becton Dickinson, Sparks, MD, USA)으로 4^oC에서 overnight re- action 시키고 Tris buffered saline with Tween-20으로 세척하였다. 1차 항체를 TBS-T buffer에 희석하여 실온에 서 2시간 반응시키고, tris-buffered saline Tween-20 (TBST) buffer로 3회 세척하고, horseradish peroxidase 결합 2차 항체(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)를 희석하여 실온에서 1시간 반응시켜 enhanced chemiluminescence (ECL) kit (Santa Cruz Biotechnol- ogy Inc., Santa cruz, CA, USA)를 이용하여 필름에 현상

Fig. 1. Effect of Sodium nitroprusside (SNP) on cytotoxicity (a) and Nitric oxide (NO) production (b).

(A) Control group, (B) 0.5 mM SNP-treated group, (C) 0.75 mM SNP-treated group, (D) 1 mM SNP-treated group. Results are presented as mean±standard error of the mean (SEM).

*Represents p＜0.05 compared to the control group.

Fig. 2. Effect of Trachelospermum caulis extract (TCE) on cell viability.

(A) Control group, (B) 1 μg/ml TCE-treated group, (C) 10 μg/

ml TCE-treated group, (D) 100 μg/ml TCE-treated group, and (E) 1,000 μg/ml TCE-treated group. Results are presented as mean±standard error of the mean (SEM).

하였다. 1차 항체는 염증과 관련된 단백질들에 대한 항체 로서 anti-COX-2 antibody (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA) anti-iNOS antibody (Cayman Chemi- cal), anti-TNF-α antibody (Santa Cruz Biotechnology Inc.)를 각각 사용하였다. 그리고 단백질 발현정도는 Image-Pro^®Plus software (Media Cybernetics Inc., Silver Spring, MD, USA)를 사용하여 정량화하였다.

7. 통계처리

통계처리는 SPSS-statistical software version 21.0 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA)을 사용하였다. 측정치는 평 균±표준오차로 표시하였다. 그룹간 비교를 위해 one- way ANOVA 분석과 사후검증으로 Duncan's multiple

range test를 사용하였으며, 모든 통계적 유의 수준은 p

＜0.05로 설정하였다.

결과»»»

1. SNP가 세포독성과 NO 농도에 미치는 영향

SNP를 0.5, 0.75, 1 mM 농도에서 24시간 동안 처치한 결과, 세포 생존율은 대조군(100%)과 비교했을 때 각각 77.53±1.50, 69.03±0.91, 48.54±0.41%로 농도 의존적 으로 감소하였다(Fig. 1a).

NO 농도는 대조군에서 12.14±1.29, SNP 0.5에서 16.61±1.22, SNP 0.75에서 24.30±0.67, SNP 1 mM에서 28.69±0.92 μM이었다(Fig. 1b). 이 결과를 통해 1 mM SNP 농도를 낙석등 추출물의 효과를 확인하기 위해 사용 하였다.

2. 낙석등 추출물이 세포독성에 미치는 영향

낙석등 추출물 1, 10, 100, 1,000 μg/ml을 처치하였을 때 세포 생존율은 각각 98.04±1.52, 98.75±1.93, 100.00±1.42, 99.21±3.37%로 낙석등 추출물 처치 후

Fig. 3. Effects of Trachelospermum caulis extract (TCE) on the Nitric oxide (NO) production.

(A) Control group, (B) SNP-treated group, (C) 100 μg/ml TCE- pre-treated and 1 mM SNP-treated group, and (D) 1,000 μ g/ml TCE-pre-treated and 1 mM SNP-treated group. Results are presented as mean±standard error of the mean (SEM).

*Represents p＜0.05 compared to the control group. #Repre- sents p＜0.05 compared to the SNP-treated group.

Fig. 4. Effects of Trachelospermum caulis extract (TCE) on the expression of Cyclooxygenase-2 (COX)-2 protein.

(A) Control group, (B) SNP-treated group, (C) 100 μg/ml TCE- pre-treated and 1 mM SNP-treated group, and (D) 1,000 μg/

ml TCE-pre-treated and 1 mM SNP-treated group. Results are presented as mean±standard error of the mean (SEM).

*Represents p＜0.05 compared to the control group. #Repre- sents p＜0.05 compared to the SNP-treated group.

세포독성이 나타나지 않았다(Fig. 2).

3. 낙석등 추출물이 NO 생성에 미치는 영향

NO 생성에 대한 낙석등 추출물의 효과를 알아보기 위 해 Griess 방법을 이용하여 세포 배양액 중에 존재하는 NO를 측정하였다.

NO 농도는 대조군에서 12.14±1.29, 1 mM SNP 처치 군에서 29.02±0.79, 1 mM SNP+100 μg/ml 낙석등 추 출물 처치군에서 24.87±1.16, 1 mM SNP+1,000 μg/ml 낙석등 추출물 처치군에서 19.85±0.87 μM로 나타났다.

1 mM SNP 처치군은 대조군과 비교해 NO 생성이 현저히 증가하였으나 낙석등 추출물 전처치에 의하여 유의한 감 소를 나타내었다(Fig. 3).

4. 낙석등 추출물이 COX-2 발현에 미치는 영향

COX-2 (72 kDa) 발현을 Western blotting으로 정량 분 석한 결과, 대조군에서의 COX-2 발현을 1.00으로 하였을 때, 1 mM SNP 처치군에서 5.72±0.70, 1 mM SNP+100 μg/ml 낙석등 추출물 처치군에서 4.24±0.38, 1 mM SNP+1,000 μg/ml 낙석등 추출물 처치군에서 2.64±

0.41로 나타났다. 1 mM SNP 처치군은 대조군에 비해

COX-2 발현이 현저히 증가하였으나 낙석등 추출물 전처 치에 의하여 유의한 억제가 나타았다(Fig. 4).

5. 낙석등 추출물이 iNOS 발현에 미치는 영향

iNOS (130 kDa) 발현을 Western blotting으로 정량 분 석한 결과, 대조군에서의 iNOS 발현을 1.00으로 하였을 때, 1 mM SNP 처치군에서 1.98±0.10, 1 mM SNP+100 μg/ml 낙석등 추출물 처치군에서 1.60±0.11, 1 mM SNP+1,000 μg/ml 낙석등 추출물 처치군에서 1.27±

0.08로 나타났다. 1 mM SNP 처치군은 대조군에 비해 iNOS 발현이 현저히 증가하였으나 낙석등 추출물 전처치 에 의하여 유의한 억제가 나타았다(Fig. 4).

6. 낙석등 추출물이 TNF-α 발현에 미치는 영향

TNF-α (17 kDa) 발현을 Western blotting으로 정량

Fig. 5. Effects of Trachelospermum caulis extract (TCE) on the expression of Inducible nitric oxide synthase (iNOS) protein.

(A) Control group, (B) SNP-treated group, (C) 100 μg/ml TCE- pre-treated and 1 mM SNP-treated group, and (D) 1,000 μg/

ml TCE-pre-treated and 1 mM SNP-treated group. Results are presented as mean±standard error of the mean (SEM).

*Represents p＜0.05 compared to the control group. #Repre- sents p＜0.05 compared to the SNP-treated group.

Fig. 6. Effects of Trachelospermum caulis extract (TCE) on the expression of Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) protein.

(A) Control group, (B) SNP-treated group, (C) 100 μg/ml TCE- pre-treated and 1 mM SNP-treated group, and (D) 1,000 μg/ml TCE-pre-treated and 1 mM SNP-treated group. Results are pre- sented as mean±standard error of the mean (SEM).

*Represents p＜0.05 compared to the control group. #Repre- sents p＜0.05 compared to the SNP-treated group.

Fig. 7. Effects of Trachelospermum caulis extract (TCE) on the Prostaglandin (PG)E

production.

(A) Control group, (B) SNP-treated group, (C) 100 μg/ml TCE- pre-treated and 1 mM SNP-treated group, and (D) 1,000 μ g/ml TCE-pre-treated and 1 mM SNP-treated group. Results are presented as mean±standard error of the mean (SEM).

*Represents p＜0.05 compared to the control group. #Repre- sents p＜0.05 compared to the SNP-treated group.

분석한 결과, 대조군에서의 TNF-α 발현을 1.00으로 하 였을 때, 1 mM SNP 처치군에서 2.67±0.18, 1 mM SNP+100 μg/ml 낙석등 추출물 처치군에서 2.17±0.22, 1 mM SNP+1,000 μg/ml 낙석등 추출물 처치군에서 1.56±1.15로 나타났다. 1 mM SNP 처치군은 대조군에 비해 iNOS 발현이 현저히 증가하였으나 낙석등 추출물 전처치에 의하여 유의한 억제가 나타았다(Fig. 5).

7. 낙석등 추출물이 PGE2 생성에 미치는 영향

PGE2 농도는 대조군에서 49.75±0.56, 1 mM SNP 처 치군에서 103.63±7.03, 1 mM SNP+100 μg/ml 낙석등 추출물 처치군에서 82.66±3.22, 1 mM SNP+1,000 μg/

ml 낙석등 추출물 처치군에서 63.95±2.65 pg/ml로 나타 났다. 1 mM SNP 처치군은 대조군에 비해 PGE2 농도가 현저히 증가하였으나 낙석등 추출물 전처치에 의하여 유 의한 감소를 나타내었다(Fig. 7).

고찰»»»

최근 생활수준의 향상과 의학의 발달로 인하여 급성 염증성 질환은 감소하나 관절염, 당뇨, 고혈압 등의 만성 질환이 증가하고 있다. 이 중 관절염은 관절을 침범하는 모든 염증을 가리키는 일반적인 용어로 다른 근골격계 질 환과 더불어 성인에게 나타나는 가장 흔한 장애의 원인으 로 보고되고 있다^15,16). 2011년도 제5기 국민건강영양조사 결과 30세 이상 성인인구의 1.8%가 류마티스 관절염을 앓고 있었는데, 노령 인구의 증가와 생활방식의 변화로 더욱 증가될 것으로 예상된다¹⁷⁾.

관절염은 한의학적 치료에서 울체된 경락을 소통하는 것에 일차적인 목표를 두고 通經活絡 하는 약제들을 빈용 하게 되는데, 낙석등은 祛風通絡, 凉血消腫, 行瘀止血의 효능이 있어 널리 사용되었다⁹⁾. 낙석등의 주요성분으로는 Arctiin, Tracheloside, Nortracheloside, Matairesinoside, Dambonitol, Beta-sitosterol-glucoside 등이 밝혀져 있다¹¹⁾. 기존 낙석등의 연구에서는 痺症의 치료효과¹²⁾, 진통ㆍ진 정작용, 항경련ㆍ항균작용, 백혈구 유주억제 작용¹³⁾ 등이 언급되었다. 이에 본 연구자는 토끼의 활액막 세포 HIG-82 세포주를 이용한 실험적 방법으로 낙석등 추출물 의 항염증 효과를 알아보고자 하였다.

본 연구에서 SNP가 세포독성과 NO 생성을 나타내는지 를 확인하기 위하여 MTT assay와 NO assay를 실시하였 다. SNP는 농도 의존적으로 세포 생존율을 감소시켰으며, 농도 의존적으로 NO 생성을 증가시켰다. 이에 본 연구자 는 1 mM SNP를 선택하여 낙석등 추출물의 효과를 검증 하는 농도로 사용하였다.

COX는 arachidonic acid를 prostanoid로 전환시키며 COX-1과 COX-2의 두 가지 동종 효소가 존재하는 것으로 알려져 있다¹⁸⁾. 그중에 COX-2는 arachidonic acid를 PG 로 전환시키는 효소로서 PGE2를 생성시켜서 염증의 여러 병리과정에 관여한다고 보고되고 있다¹⁹⁾. 높은 COX-2 농 도는 관절염 병인과 관련되며, specific COX-2 억제제는 염증 증상을 감소시키는 역할을 한다²⁰⁾.

낙석등 추출물이 SNP에 의해 유도된 염증의 지표인 COX-2 발현과 PGE2 합성에 미치는 영향을 관찰한 결과, 1 mM SNP에 의해 COX-2 발현과 PGE2 합성이 증가되었 으며, 낙석등 추출물은 농도 의존적으로 COX-2 발현과 PGE2 합성을 억제하였다. 이러한 결과는 SNP에 의해 활

액막 세포에 염증반응이 유발된다는 의미하며, 낙석등 추 출물에 의해 염증상태를 완화할 수 있다는 것을 의미한 다.

NO는 nitric oxide synthase synthase (NOS)의 작용에 의하여 L-arginine으로부터 L-citrulline이 만들어지면서 생 성된다. NOS는 endothelial NOS (eNOS), inducible NOS (iNOS), 및 neuronal NOS (nNOS)의 3종류가 밝혀져 있 다²¹⁾. 그 중에 iNOS는 cytokine이나 성장인자 등의 자극 에 의하여 발현이 유도되는 형태(inducible NOS)이나 eNOS와 nNOS는 세포 내에서 아무런 자극이 없이도 NO 를 생성시키는 형태(constitutive NOS)이다. NO는 세포의 증식, 염증반응, 세포사멸 등 생체 내에서 중요한 작용을 한다²²⁾. NO의 생성은 NOS 중에서 iNOS에 의한 생성이 많으며, 이렇게 생성된 NO는 박테리아를 제거하는 역할²³⁾ 을 하지만 과도한 NO의 형성은 염증을 유발시켜 조직의 손상, 유전자 변이, 신경 손상 등을 유발한다²⁴⁾. 즉 iNOS 는 외부자극에 반응하여 생체를 방어하려는 목적으로 단 시간에 과량의 NO를 생성하게 된다^25,26).

iNOS의 억제는 관절염치료의 중요한 타겟이 되고 있는 데 관절염 염증부위에 iNO의 발현이 증가하는 것으로 알 려져 있다. iNOS는 reactive oxygen species (ROS)의 일 종인 NO를 생성하는데, NO는 세포 내 2차 신호전달자로 서 염증작용을 하는 것으로 알려져 있다. 특히 생체 내 고농도의 NO 생성은 숙주세포의 파괴, eosinophil의 증 가 유도, shock에 의한 혈관확장, 염증유발에 의한 조직 의 상해를 초래할 수 있다. iNOS 발현 증가는 혈관투과 성의 증가를 유도하여 산화스트레스를 증가시켜 염증에 의한 조직 손상을 가속화시킨다^8,27). iNOS에 의한 NO의 과생성은 순환쇼크, 염증, 종양발생에서 발생한다^28-30). 또 한 iNOS는 주로 자극된 대식세포에 의해 생산되어 NO의 염증 조건을 제공한다. 특히 대식세포에서 과도한 NO 생 산이 세포독성, 염증, 암 발생, 자가면역질환들을 초래할 수 있다는 점에서 NO 생산과 iNOS 발현의 억제가 염증 질환을 예방할 수 있다는 것을 뒷받침 하고 있다^31,32).

낙석등 추출물이 SNP에 의해 유도된 염증의 지표인 iNOS 발현과 NO 생성에 미치는 영향을 관찰한 결과, 1 mM SNP에 의해 iNOS 발현과 NO 생성이 증가하였으며, 낙석등 추출물은 농도 의존적으로 iNOS 발현과 NO 생성 을 억제시켰다. 이러한 결과는 낙석등 추출물에 의한 iNOS 발현 억제는 NO 생성의 억제를 유도하였음을 의미

한다.

TNF-α는 17 kDa의 염증성 cytokine으로 생체 내에서 는 50 kDa의 trimer 형태로 존재한다. TNF-α는 주로 단 핵구나 대식세포에서 생성되지만 자연살해세포나 T 세포, B 세포에서도 생성될 수 있으며, p55와 p75 두 종류의 수용체에 결합하여 그 작용을 나타낸다. 류마티스 관절염 환자의 혈청과 활액에서 TNF-α가 증가되어있고, TNF- α의 농도와 적혈구 침강속도 및 활액의 백혈구 수가 비 례한다고 보고되었다^33,34).

TNF-α는 관절염 환자의 혈장과 활액에서 증가되며³⁴⁾, 염증을 일으키는 데 매우 중요한 역할을 한다. 또한 여기 에 관련된 cytokines들은 관절염의 병리과정에서 매우 중 요한 역할을 하고 파골세포를 활성화시킬 뿐만 아니라 matrix metalloproteinase의 생성을 야기 시켜 연부조직과 뼈에 심각한 손상을 일으키는 것으로 알려져 있다³⁵⁾. 이 러한 이유로 TNF-α 억제제는 관절염의 치료에 널리 사 용되고 있다^36-38).

낙석등 추출물이 SNP에 의해 유도된 proinfla mMatory cytokine인 TNF-α 발현에 미치는 영향을 관찰한 결과, 1 mM SNP에 의해 TNF-α 발현이 증가하였으며, 낙석등 추출물은 농도 의존적으로 TNF-α 발현을 감소시켰다.

이와 같이 낙석등 추출물은 COX-2, iNOS, 그리고 TNF-α의 발현을 억제하였고 PGE2 합성과 NO 생성을 감소시켜 항염증 효과를 발휘한다는 것을 확인하였다. 본 연구의 결과로 낙석등 추출물이 관절염과 같은 염증성 질 환의 염증반응을 개선하는데 도움을 줄 수 있을 것으로 생각된다.

결론»»»

토끼의 활액막 세포 HIG-82 세포주에서 sodium nitro- prusside (SNP)로 염증반응을 유도한 후 낙석등 추출물의 항염증 효과에 대하여 실험하여 다음과 같은 결과를 얻었 다.

1. SNP로 처치하였을 때 농도 의존적으로 세포 생존율 을 감소시켰으며, 농도 의존적으로 NO 생성을 증가시켰 다. 낙석등 추출물로 처치하였을 때는 세포 생존율을 감 소시키지 않았다.

2. 낙석등 추출물이 COX-2 발현과 PGE2 합성에 미치

는 영향을 관찰한 결과, SNP에 의해 COX-2 발현과 PGE2

합성이 증가되었으며, 낙석등 추출물은 농도 의존적으로 COX-2 발현과 PGE2 합성을 억제하였다.

3. 낙석등 추출물이 iNOS 발현과 NO 생성에 미치는 영향을 관찰한 결과, SNP에 의해 iNOS 발현과 NO 생성 이 증가하였으며, 낙석등 추출물은 농도 의존적으로 iNOS 발현과 NO 생성을 억제시켰다.

4. 낙석등 추출물이 TNF-α 발현에 미치는 영향을 관 찰한 결과, SNP에 의해 TNF-α 발현이 증가하였으며, 낙 석등 추출물은 농도 의존적으로 TNF-α 발현을 감소시켰 다.

이상의 결과를 종합하여 볼 때, 낙석등 추출물이 항염 증 효과를 발휘하여 관절염과 같은 염증성 질환의 염증반 응을 개선하는데 도움을 준다는 것을 알 수 있다.

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