V o l u m e 9 , N u m b e r 1 , A p r i l , 2 0 0 6
닭의 굴곡건 봉합 후 양막이식과 헤파린이 조직유착에 미치는 영향
동아대학교 의과대학 정형외과학교실 김성수∙이명진∙정일권∙고만석
= Abstract =
Effect of Amniotic Membrane Transplantation and Heparin on Tissue Adhesion in Flexor Tenorrhaphy of Chicken
Sung Soo Kim, M.D., Myung Jin Lee, M.D., IL Kwon Chung, M.D. and Man Seok Ko, M.D.
Department of Orthopedic Surgery, Medical School, Dong-A University, Busan, Korea
Purpose: The role of the amniotic membrane with or without heparin was investigated with regard to the prevention of adhesion formation following flexor tenorrhaphy of chicken.
Materials and Methods: We classified twelve chickens into four groups of three chickens. In group A, the flexor tendon was partially cut and the tendon was repaired. In group B, The repaired tendon was covered with heparin. In group C, the repaired tendon was covered with amniotic membrane. In group D, the repaired tendon was covered with amniotic membrane and heparin. Histologic and gross findings of the repaired tendon were evaluated at postoperative 3, 6 and 9 weeks.
Results: In group D, there were less inflammatory cell infiltration and fibroblasts proliferation in all stages.
At postoperative 9 weeks of all groups, there were less inflammation and fibroblasts proliferation than those in postoperative 3 and 6 weeks.
Conclusion: The use of amniotic membrane transplantation and heparin is effective in the prevention of inflammation and adhesion formation following flexor tenorrhaphy of chicken.
Key Words: Amniotic membrane, Heparin, Tenorrhaphy
※ 통신저자: 이 명 진
부산광역시 서구 동대신동 3가 1 동아대학교 의과대학 정형외과학교실
TEL: 051) 240-5167 FAX: 051) 254-6757 E-mail: [email protected]
서 론
수지 굴곡건 손상 후 야기되는 건의 유착은 기 능적인 장애를 초래할 수 있어 술후 유착을 감소 시키는 것이 기능 회복에 중요한 요소이다. 이러
한 유착을 억제하기위해 여러 잠재적인 방어막인 복막, 실라스틱막, 부건(paratenon), 폴리에틸 렌막23), 근막(fascial graft) 등이 사용되고 있으 며, 반흔 조직내의 교원조직에 영향을 주어 반흔 을 감소시키는 cis-hydroxyproline, lathyro-
gen, penicillamine 등의 약물에 대한 보고가 있으나 대부분 부분적으로 도움이 되는 방법들이다.
Davis5)에 의해 피부이식에 양막이 처음 사용되 었고, 1940년 De Rotth6)가 양막과 융모막이 붙 어 있는 생태아막(live fetal membrane)을 결 막 표면 재건에 적용한 이후 유착을 억제하고 상 처부위를 보호하며14), 상피의 세포자멸사(apop- tosis)을 억제함으로써 상피화를 촉진시킬 뿐 아
니라2,3,8,24) 조직상피 형질을 보전하고 염증과 신생
혈관 생성을 감소시켜 반흔 생성을 줄여주는 효과 가 있는 것으로 알려져 최근 안과 영역뿐만 아니 라, 일반외과, 산부인과, 성형외과 영역에서의 사 용 및 연구가 점차 확대되고 있다.
헤파린은 antithrombin III에 작용하여 항응 고 작용을 하고, fibroblast growth factor에 붙어 작용하거나 직접 plasminogen activator 에 작용하여 유착 방지 및 상처 회복에 도움을 주 는 것으로 알려져 최근 유착 방지에 대한 활발한 연구가 진행되고 있다16).
이에 저자들은 양막 및 헤파린이 건의 유착에 미치는 영향을 알아보기 위해 건봉합만 시행한 경 우, 헤파린을 사용한 경우, 양막을 이식하는 경 우, 양막이식 및 이식부위에 헤파린을 첨가한 경 우를 서로 비교해 보았다.
연구 대상 및 방법 1. 연구대상
본 연구에서 사용된 실험 동물은 체중 1.5-2.0 kg인 건강하고 성숙한 닭을 사용하였고 실험동물 은 실험 1주일 전부터 동일한 온도와 습도의 사육 실에서 동일 배합사료로 사육하여 환경에 적응시 켰다. 12마리 24다리를 대상으로 하였고, 하지부 의 내측부위에 피부 및 피하절개 후 제 2 굴곡건 을 부분 절단하여 단순 건봉합한 것을 A군이라 하고, 헤파린 첨가군을 B군, 양막 이식군을 C군, 양막이식과 헤파린을 첨가한 군을 D군으로 분류 하였다. 각 군마다 3마리씩 정하여 실험 후 3주, 6주, 9주에 각각 한 마리씩 도살하여 유착의 정도 를 육안 관찰하였고 조직학적 검사를 시행하여 일 반적인 조직학적 변화와 염증세포의 침윤정도, 섬
유화 등을 비교 관찰하였다.
2. 방법
1) 양막의 채취 및 보관
인체면역결핍 바이러스, B형 간염바이러스, C 형 간염바이러스, 매독이 없는 산모의 제왕절개 후 얻은 태반을 항생제가 첨가된 0.9% NaCl에 혈병 등을 세척한 후 양막과 융모막을 분리하여 양막을 nitrocellulose paper에 부착하여 3×3 cm 크기로 잘라 DMEM(Dulbecco modified eagle medium)과 glycerol이 1:1로 혼합된 보 존액에 넣어 -80 ℃에서 보관하였다가 사용 전 실 온에서 녹인 다음 수술 부위에 알맞게 잘라 사용 했다.
2) 실험방법
보관중인 양막을 상온에서 10분간 해동하여 생 리식염수로 세척 후 봉합 부위에 이식하기 위하여 0.5×1.5 cm 크기로 잘랐다.
실험 동물의 마취를 위해 닭에 kg당 50 mg의 ketamine hydrochloride와 0.15cc의 xylazine 을 근육 주사하였으며, 일반적인 수술시의 처치와 조작하에 3배율의 확대경을 이용하여 수술하였다.
모든 닭의 하지부 내측부위를 삭모하고 피부 및 피하절개 후 제 2 굴곡건 직경의 반을 절개하고 5-0 nylon으로 단순 봉합 후, 봉합부위 상부에 양막을 위치하도록 하였으며, 이식한 양막 상부의 건막을 상피세포층이 모두 건의 반대측을 향하게 하고 7-0 nylon으로 봉합 후 피부 봉합하였고, 헤파린은 1,000IU로 0.5cc를 건 절개부위에 피 복시켰으며 부목은 사용하지 않았다. 세균감염을 방지하기 위해 수술 중에 cefazolin 100 mg을 근육주사하였다.
3) 육안관찰 및 조직학적 검사
수술 3, 6, 9주에 각 군마다 1마리씩 도살 후 실험 당시와 동일한 술식으로 절개를 가한 후, 절 개한 건의 치유정도와 봉합 부분의 유착정도 등을 육안적으로 확인하고 광학현미경 관찰을 위해 봉 합부위를 포함한 주위 조직을 손상없이 적출하고 압설자에 건의 양쪽 끝을 핀으로 고정하여 길이를
유지시킨 상태에서 10% 중성 포르말린 용액에 48시간 동안 고정하여 횡 절개 및 종 절개로 슬라 이드를 재작하였다.
Hematoxylin-eosin(H-E) 염색에서 염증세포 의 침윤정도를 광학현미경으로 관찰한 결과 연속 된 6개의 고배율시야(×400)에서 평균 염증세포 의 수를 각각 더하고 평균을 낸 다음 3주, 6주, 9 주에서 각군을 비교하였다. Masson-trichrome 염색에서 건의 치유과정에서 보이는 교원질의 침 착과 섬유화의 생성정도를 교원질 섬유 점수(col- lagen fiber score)라고 정의하였으며, 임의로 고배율 시야(×400)당 50% 이하, 51~80%, 81% 이상으로 분류하고 각각을 경도, 중등도, 고 도로 나누고 3주, 6주, 9주에서 각 군별로 비교 분석하였다. 또 섬유아세포로의 분화 정도를 관찰
하기 위한 proliferating cell nuclear anti- gen(PCNA) label 및 근섬유아세포의 분화를 알 아보기 위한 α-smooth muscle actin(SMA) 항 체를 이용한 면역조직 화학염색을 시행하였는데 분화 정도가 고배율 시야(×400)당 20% 이하, 20~50%, 51% 이상으로 분류하고 각각을 경도, 중등도, 고도로 나누고 3주, 6주, 9주에서 각 군 별로 비교 분석하였다. 결과는 세명의 병리학 전 문의에 의해 판독된 각각의 결과로 통계적 처리를 하였다.
4) 통계적 처리
Kruskal-Wallis 검정을 사용하여 관찰 시기에 따른 염증세포의 침윤 정도를 통계적 분석을 하였 으며, 카이제곱 검정을 사용하여 관찰 시기에 따
Fig. 1. Inflammatory cell infiltration in 4 groups. Left column is showing the operation site at postoperative 3 weeks and right column at postoperative 9 weeks. First row is group A, second row is group B, third row is group C and fourth low is group D. In group B and D, there are lesser inflammatory cells than in group A and C. Nine weeks after operation, there are lesser inflammatory cells in all groups than in 3 and 6 weeks (H-E stain, × 100). (▲: inflamatory cell)
른 교원질의 침착과 섬유화의 생성정도, 섬유아세 포로의 분화 정도, 근섬유아세포의 분화 정도를 경도, 중등도, 고도로 나누어 이들의 분포를 이용 하여 통계적으로 분석하였다. P<0.05를 통계적 유의성이 있는 것으로 평가 하였다.
결 과 1. 육안 관찰
술 후 3주에는 네 군 모두에서 봉합을 시행한 절단면의 주위로 전반적인 부종과 육아조직 덩어 리가 건초 및 건 조직 주변에 관찰되었으며 건의 복원이 진행되는 양상이 관찰되었다. 유착은 네 군에서 모두 관찰되었으며 D군에서 그 정도가 다
소 경미하였고 C군과 D군에서 양막의 비후 소견 이 관찰되었다. 술 후 6주 및 9주에는 모든 군에 서 3주와 비교해 건 주위의 육아조직의 감소와 유 착의 감소가 관찰되었고 특히 D군의 감소 소견이 뚜렷하였다.
2. 조직학적 소견
1) H-E 염색
H-E 염색에서 건 봉합 상부 조직에서 염증세포 의 침윤정도를 광학현미경으로 관찰한 결과 술 후 3주, 6주, 9주 기간이 증가 할수록 염증 세포의 침윤 정도는 감소하는 것을 볼 수 있으며, B군과 D군에서 3주, 6주, 9주 모두에서 A군과 C군에 비하여 염증세포의 침윤의 정도가 유의하게 적은
Table 1. Comparison of the mean inflammatory cell numbers on 6 consecutive high power fields (×400) in H-E stain
Numbers of inflammatory cells
3 weeks 6 weeks 9 weeks
Group A 35.2 29.7 23.1
Group B* 20.1 17.3 14.7
Group C 26.4 23.2 20.5
Group D* 18.5 15.7 13.2
*: P<0.05
Fig. 2. Comparison of the collagen fiber scores between the four groups in Masson-trichrome stain.
Fig. 2.Collagen fiber scores*: ≤50%=Low, 51~80%=Moderate, >81%=High Fig. 2.*: P<0.05
것을 관찰 할 수 있었다(P<0.05) (Table 1) (Fig. 1).
2) Masson-trichrome 염색
건 봉합 상부 조직에서 교원질 생성 및 섬유화 가 진행된 조직은 청색으로 염색되었다. 술 후 3 주에는 C군 및 D군에서, 6주에는 D군에서 교원 질 생성 및 섬유화의 진행정도가 타군에 비해 의 미있게 적었으나(P<0.005), 9주에서는 그 차이가 통계적 유의성이 없었다(Fig. 2,3).
3) 면역조직화학염색
(1) proliferating cell nuclear antigen (PCNA)
건 봉합 상부의 조직에서 섬유아세포로의 분화
정도는 D군에서 술 후 3주, 6주, 9주에 다른 군 에 비해 의미 있게 적은 것으로 관찰 되었다 (P<0.05)(Fig. 4,5).
(2) α-smooth muscle actin(SMA)
건 봉합 상부의 조직에서 근섬유모세포의 분화 정도는 D군에서 술 후 3주, 6주, 9주에 나머지 모든군에 비해 의미 있게 적은 것으로 관찰 되었 다(P<0.05). B군에서는 술 후 6주, 9주에 A군과 C군에 비해 의미 근섬유모세포의 분화가 의미 있 게 적은 것으로 관찰 되었다(P<0.05)(Fig. 6,7).
고 찰
건 치유 과정을 살펴보면 건 손상 후 손상된 건 사이에는 섬유소 응괴가 차게 되지만 장력은 생기
Fig. 3. Fibrosis in 4 groups. Left column is showing the operation site at postoperative 3 weeks, and right column at postoperative 9 weeks. First row is group A, second row is group B, third row is group C and fourth low is group D. In group D, there are lesser fibrosis than group A, B and C in 3 weeks. After 9 weeks, no significant difference of fibrosis between groups (Masson-trichrome stain× 100).
지 않으며 손상 후 약 5일부터 건 주위 조직으로 부터 섬유아세포가 건 사이를 메우게 된다21). 이 섬유아세포를 동반한 혈관들이 손상 부위의 영양 을 공급하고, 섬유아세포에서 형성되는 교원조직 이 손상된 건 사이를 채우게 되는데 교원섬유의 침착은 약 5일에서 21일 사이에 최고에 달하여 이 기간동안 반흔 조직의 장력이 급격히 증가한다
10,25)
. 손상 후 약 21일 이후에는 교원 섬유의 생 성은 없지만 재정렬은 계속되며 약 4개월 이상까 지 지속된다.
건 손상후 유착을 방지하는 여러 가지 방법이 있으며 수술적 방법으로 건 손상 또는 건 재건 수 술시 적절한 절개, 정확한 조직층의 박리, 출혈방 지, 무균수술, 봉합사의 적절한 선택 및 이로 인 한 이물반응의 최소화, 단단한 봉합으로 고정기간 을 줄여 유착을 최소화할 수 있다14,22). 그러나 건 막의 봉합은 그 자체가 정상적인 건의 환경을 회 복시킨다는 개념에 근거해 이상적이라 할 수 있으 나, 건의 미끄러짐을 위한 공간을 협소하게 만들 뿐 아니라, 건막의 일부분이 결손될 가능성이 높 고 이로 인해 효과적으로 복원되지 못할 가능성이 있으며, 또한 수술 후 건 활차 운동 제한으로 주 위 조직과 유착이 발생하는 것을 완전히 막기는 어려운 현실이다.
유착을 방지하기위해 수술적 술기외에 유착의
발생을 억제하기 위한 다양한 방법이 사용되고 있 다. 그중 외부의 환경으로부터 분리하는 방법으로 외벽측 복막21), 근막성 패취16), 신근지대9,19) 등의 사용은 정상 조직의 절제가 필요하여 기능 및 구 조의 소실이 초래될 수 있고, 이전에 사용된 합성 매개체로 만들어진 삽입물은 새로운 막을 형성하 여 건의 활주운동을 용이하게 하나 생체적합성이 좋지 않아 이물반응을 야기하는 부작용이 있다7). 또한 약물요법으로 반흔 조직내 교원질의 생합성 억제제인 cis- hydroxyproline과 교원조직의 교 차 연결을 방해하는 lathyrogen, penicillamine 등에 대한 보고가 있으나1,4) 아직 임상적인 적용을 할 수 없는 상태이다.
본 실험에서 사용된 인간의 양막은 태반의 가장 안쪽에 있는 0.2~0.5 mm의 얇은 막으로 태아 를 둘러싸고 있어 모체로부터의 각종 감염, 면역 반응으로부터 태아를 보호하는 장벽의 역할을 한
다10,11). 양막의 상피 표면은 평탄하고 유착성이 없
으며 반면 내부실질은 거칠고 유착성이 있다. 이 러한 이유로 양막은 건막을 대신하는 대체물로 사 용되기 보다 건의 외부 표면을 덮는 덮개로 사용 되었다7). 또한 평활근세포, 신경, 림프관및 혈관 과 major histocompatability complex (MHC)의 결핍으로 이종, 동종간 거부반응이 거 의 없다고 알려져 있다. 지금까지 임상적으로 알
Fig. 4. Comparison of the PCNA positive fibroblast scores between the four groups in PCNA labeling.
Fig. 4. Fibroblast score*: ≤20%=Low, 21-50%=Moderate, >50%=High Fig. 4. *: P<0.05
Fig. 5. Expression of fibroblast in 4 groups. Left column is showing the operation site at postoperative 3 weeks and right column at postoperative 9 weeks. First row is group A, second row is group B, third row is group C and fourth low is group D. In group D, there are lesser fibroblasts with strong positive PCNA stain than group A, B and C in all periods (Immunohistochemical stain for PCNA, × 100).
A
B
려진 양막의 역할은 정상적인 상피세포의 특성은 유지시키고 상피세포 성장을 촉진하며 항염증 작 용과 신생혈관 억제 작용 및 반흔 형성 억제 작용 을 하는 것이다18). 본원에서는 임상적으로 몇 예 에서 건 절단 후 유착이 일어난 경우 건 봉합이나 건 이전 수술에서 양막 이식을 적용하여 우수한 유착방지 효과를 경험할 수 있었다.
Ozeren 등17)은 토끼의 골반 수술 후 유착을 방 지하는데 양막이 섬유소 접착제보다 못하다고 하 였으며, 이 등12)은 토끼의 아킬레스건 봉합 후 양 막 이식이 1주에는 염증을 다소 억제하였으나 2 주부터는 오히려 증가하는 소견을 보고하였다. 그 러나 Fahir와 Napehan7)은 닭의 굴곡건 봉합후 양막 이식이 다른 대조군에 비해 유착방지에 도움 을 주는 것으로 보고하였다. 본 실험에서는 헤파 린 첨가군과 양막이식과 헤파린을 첨가한 군에서 대조군에 비해 3주, 6주, 9주에 염증의 정도는 적 었다. 이는 염증세포에 의한 섬유아세포의 활성을 줄여줌으로써 건의 유착을 억제하는 역할을 한다 고 볼 수 있다.
Masson-trichrome 염색은 건의 치유과정에서 보이는 교원질의 침착과 섬유화의 생성정도를 특 징적으로 나타내는데 이 등12)의 실험에서는 1주,
2주, 3주, 4주에 양막이식군이나 대조군에서 교 원질 생성 및 섬유화의 정도는 유의한 차이를 관 찰 할 수 없었다. 본 실험에서 초기 3주에서 양막 이식 및 양막이식과 헤파린을 첨가한 군에서, 6주 에서는 양막이식과 헤파린 첨가한군에서 다른군에 비해 교원질 생성이 낮았다. 9주에서는 각군에서 전반적인 교원질 생성 및 섬유화는 증가되어 유의 한 차이는 없었다. 본 실험에서는 9주에 이식 건 상부 조직에 교원질 생성 및 섬유화의 정도가 양 막이식과 헤파린을 첨가한 군에서 60%정도 였 고, 나머지 다른 군에서는 65~75%정도로 큰 차 이는 없었으나 다른 군에 비하여 적은 증가 소견 을 관찰할 수 있었다.
Proliferating cell nuclear antigen(PCNA) 항체를 이용한 면역조직 화학염색은 섬유아세포로 의 분화 정도를 특징적으로 나타낸다. 특히 양막 이식과 헤파린을 첨가한 군에서 3주, 6주, 9주 모 두에서 분화의 정도가 가장 적은 것을 볼 수 있었 다. 또한 본 실험에서는 이 등13)의 실험과 달리 양막이식군에서도 좋은 결과를 보인 것은 관찰 기 간이 길었고, 실험동물의 차이로 이종간의 면역거 부 반응이 차이가 있었다고 보이며, 건의 부분 파 열 봉합후 석고 고정을 하지 않아 유착방지에 도
Fig. 6. Comparison of the αsmooth muscle actin expression scores between the four groups in αsmooth muscle actin labeling.
Fig. 6.Anti-αsmooth muscle actin score*: ≤20%=Low, 21~50%=Moderate, >50%=High Fig. 6.*: P<0.05 Compared with group A, B and C
Fig. 6.�: P<0.05 Compared with group A and C
움이 되었던 것으로 생각되어진다.
유착억제 약물로 잘 알려져 있는 헤파린은 fibroblast growth factor에 붙어 작용하거나 직접 plasminogen activator에 작용하여 상처 회복에 도움을 준다. 본 실험에서 헤파린만 사용 한 군에서 대조군에 비해 초기 3주, 6주, 9주에 염증세포의 침윤이 적었다. 그리고 α-smooth muscle actin (SMA) 항체를 이용한 면역조직 화학염색에서 6주와 9주에 대조군보다 근섬유모 세포로 분화의 정도가 적은 것을 볼 수 있었다.
Mehmet 등15)에 따르면 토끼의 술후 복막 유착의 방지하는 실험에서 헤파린은 상처 회복뿐 아니라 양막의 작용에 상승작용을 하는 것으로 보고하고 있다. 본 실험에서도 역시 양막이식과 헤파린을 첨가한 경우 가장 우수한 결과를 보였으며 이는 양막의 작용에 헤파린을 첨가함으로써 효과를 상 승 시켰다고 볼 수 있을 것이다.
이상과 같이 양막 이식과 헤파린의 첨가는 굴곡 건의 손상 후 반흔 조직의 유착을 감소시켰다. 그 러나 본 실험에서는 건의 봉합시 주위 조직간의
Fig. 7. Expression of α-smooth muscle actin in 4 groups. Left column is showing the operation site at postoperative 3 weeks, middle column at postoperative 6 weeks and right column at postoperative 9 weeks. First row is group A, second row is group B, third row is group C and fourth low is group D. In group D, there are lesser fibrob- lasts with strong positive reaction for α-smooth muscle actin than group A, B and C in all periods (Immuno- histochemical stain for α-smooth muscle actin, × 400).
유착에 중점을 두고 실험을 하여, 건의 복원시 장 력의 감소 여부 및 건 자체의 조직학적 변화에 대 한 추가적 연구가 필요하리라고 생각한다.
결 론
닭의 굴곡건 봉합 후 양막 이식 및 이식부위에 헤파린을 첨가하는 것이 염증 및 조직 유착 방지 에 가장 우수한 것으로 사료된다.
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