수지 굴곡 건 손상은 유착으로 인한 기능적인 장애를 초래할 수 있으며 이러한 문제는 치유기전 및 유착방지에 대한 많은 연구에도 불구하고 여전히 해결하기 어려운 문제로 남아 있다. 결합조직 주변의 섬유모세포가 손상 된 굴곡 건의 회복 부위로 이동하여, 반흔 조직을 형성하
게 되는데, 건 손상 부위에 유착방지를 위한 잠재적인 방 어막으로 실라스틱막, 부건(paratenon), 폴리에틸렌막 등28)이 사용되었으나 대부분의 방법들이 부분적인 도움 이 되었을 뿐이다.
양막은 Davis8)에 의해 피부이식에 처음 사용되었고,
757
목 적: 닭의 굴곡 건 파열의 봉합 시에 단순 봉합한 군과 양막을 이식한 봉합군, 방사선 처리된 양막을 이식한 봉합군을 비교 분석하여 각각이 조직 유착에 미치는 영향에 대해 알아보고자 하였다.
대상 및 방법: 아홉 마리의 닭을 대상으로 하여 양측하지의 제2 굴곡 건을 절반 절단한 후 단순 봉합한 것을 A군, 봉합 후 단순 처리된 양막을 이식한 것을 B군, 동결 건조 및 25 kGy 방사선 처리된 양막을 이식한 것을 C군으로 하였다. 수 술 후 3주, 6주, 9주에 각 군마다 1마리씩 희생시켜 조직 유착 정도를 육안으로 관찰하였고 조직학적 검사를 시행해 일 반적인 조직학적 변화와 염증세포의 침윤정도, 섬유화 등을 비교 관찰하였다.
결 과: 모든 시기에 A군과 B군에 비해 C군에서 염증세포 침윤과 섬유화가 낮았다.
결 론: 닭의 굴곡 건 파열의 봉합 시에 방사선 처리된 양막 이식이 염증 및 조직 유착 감소에 효과적으로 사료된다.
색인 단어: 굴곡 건 봉합, 방사선 처리된 양막 이식, 조직 유착
Purpose:The role of the amniotic membrane with or without radiation was investigated with regard to preventing adhesion after flexor tenorrhaphy of chicken.
Materials and Methods:Nine chicken were divided into three groups. The second flexor tendon of the chicken was operated on. In group A, the flexor tendon was excised and one half and the tendon was repaired. In group B, the repaired tendon was covered with an amniotic membrane. In group C, the repaired tendon was covered with a lyophilised and 25 kGy irradiated amniotic membrane. The gross and histol- ogy findings on the level of inflammation and fibrosis of the repaired tendon were evaluated at 3, 6 and 9 weeks after surgery.
Results:Group C had the least inflammatory cell infiltration and fibroblast proliferation at any time.
Conclusion:The use of radiated amniotic membrane was effective in preventing inflammation and adhe- sion after flexor tenorrhaphy in chickens.
Key Words:Flexor tenorrhaphy, Irradiated amniotic membrane, Tissue adhesion
Departments of Orthopedic Surgery and Pathology*, College of Medicine, Dong-A University, Busan, Korea
Sung Hoo Kim, M.D., Lih Wang, M.D., Myung Jin Lee, M.D., Sung Soo Kim, M.D., and Mee Sook Roh, M.D.*
Effect of Amniotic Membrane Transplantation on Tissue Adhesion in Flexor Tenorrhaphy of Chicken
757
닭의 굴곡 건 봉합 후 양막 이식이 조직 유착에 미치는 영향
김성후ㆍ왕립ㆍ이명진ㆍ김성수ㆍ노미숙*
동아대학교 의과대학 정형외과학교실, 해부병리학교실*
757 757 통신저자 : 이 명 진
부산광역시 서구 동대신동 3가 1 동아대학교 의과대학 정형외과학교실 TEL: 051-240-5167∙FAX: 051-254-6757 E-mail: [email protected]
*본 논문은 2004년도 동아대학교 연구비의 지원을 받아 이루어졌음.
Address reprint requests to Myung Jin Lee, M.D.
Department of Orthopedic Surgery, College of Medicine, Dong-A University, 3-1 Dongdaesin-dong, Seo-gu, Busan 602-715, Korea
Tel: +82.51-240-5167, Fax: +82.51-254-6757 E-mail: [email protected]
1940년 De Rotth9)가 결막의 유착과 결손에 적용한 이 후 유착을 억제하고 상처부위를 보호하며17), 상피의 apo- ptosis를 억제함으로써 상피화를 촉진시킬 뿐 아니라4,5,11) 조직상피 형질을 보전하고 염증과 신생혈관 생성을 감소 시켜 반흔 생성을 줄여주는 효과가 있다고 알려져 있다.
담도 및 골반 수술 후 유착 방지1,18), 피부 궤양 및 화상의 치료2), 결막의 유착 방지6)를 위한 사용에 이르기까지 그 영역이 점차 확대되고 있으며 최근에는 멸균 및 이식 거 부 반응을 줄이기 위해 방사선 처리과정을 거친 양막이 개발되어 사용 중이다25). 이에 저자들은 건 봉합만 시행 한 경우, 단순 처리된 양막을 사용한 경우와 방사선 처리 한 양막을 사용한 경우의 유착 방지 효과를 서로 비교해 보고자 하였다.
연구대상 및 방법
1. 연구대상
체중 1.5-2.0 kg인 건강하고 성숙한 닭을 사용하였고 실험동물은 실험 1주일 전부터 동일한 온도와 습도의 사 육실에서 동일 배합사료로 사육하여 환경에 적응시켰다.
아홉 마리 18다리를 대상으로 하였고, 하지부의 내측부 위에 피부 및 피하절개 후 제2 굴곡 건을 절반 절단하여 단순 건 봉합한 것을 A군이라 하고, 봉합 후 단순 처리된 양막 이식한 것을 B군, 봉합 후 동결건조 및 방사선 처리 된 양막 이식한 것을 C군으로 하여 각각 3마리씩 배당하 였다. 수술 후 3주, 6주, 9주에 각 군당 1마리씩 희생하 여 유착정도를 육안으로 관찰하였고 조직학적 검사를 시 행하여 일반적인 조직학적 변화와 염증세포의 침윤정도, 섬유화 등을 비교 관찰하였다.
2. 방법 1) 실험방법
양막을 체취전 HIV, hepatitis B, C, syhphilis 등을 포함한 질병의 전염을 막기 위해 제왕절개술을 받은 산모 에 대해 screening test를 시행한 후 양막을 태반에서 분리하여 항생제가 첨부된 0.9% NaCl에 여러번 세척하 고 nitrocellulose paper에 부착한 후 DMEM (Dul- becco modified eagle medium)과 glycerol이 1:1로 혼합된 보존액에 넣어 -80℃에서 보관하였다가 사용 전 실온에서 10분간 녹인 다음 생리식염수로 세척 후 0.5×
1.0 cm 크기로 잘라 사용했다. C군에 사용된 양막은 동
일한 세척과정을 거친 후 수분의 함량을 최소화하여 양 막의 보존 및 사용을 용이하게 위해 동결 건조하였고25) 25 kGy radiation 처리 과정이 첨가되었다. 마취를 위 해 닭에 kg당 50 mg의 ketamine hydrochrolide와 0.15 cc의 xylazine을 근육 주사하였으며 3배율의 확대 경을 이용하여 수술하였다. 모든 닭의 하지 부 내측부위 에 피부 및 피하절개 후 제2 굴곡 건 직경의 반을 절개하 고 5.0 nylon으로 단순 봉합하였고, 양막은 상피세포층 이 모두 건 표면의 반대 측을 향하게 하고 7.0 nylon으 로 봉합 후 피부 봉합하였고 부목은 사용하지 않았다. 세 균감염을 방지하기 위해 수술 중에 cefazolin 100 mg 을 근육주사 하였다.
2) 육안관찰 및 조직학적 검사
수술 3, 6, 9주에 각 군마다 1마리씩 총 3마리를 도살 후 실험 당시와 동일한 술식에 의해 절개를 가한 후, 봉 합 부분의 건의 유착정도, 절개한 건의 치유정도 등을 육 안으로 확인하고 광학현미경 관찰을 위해 봉합부위를 포 함한 주위 조직을 손상 없이 적출하고 압설자에 건의 양 쪽 끝을 핀으로 고정하여 길이를 유지시킨 상태에서 10%
중성 포르말린 용액에 48시간 동안 고정하였다. 통상적 인 parafin 포매를 하여 hematoxylin-eosin (H&E) 염색과 건 치유과정에서의 교원질 생성도를 보기 위한 Masson-trichrome 염색을 시행하였다.
H&E 염색에서 염증세포의 침윤정도를 광학현미경으 로 관찰한 결과 연속된 6개의 고배율시야(×400)에서 평균 염증세포의 수를 20개 이하, 21-30개, 31개 이상 으로 분류하고 각각을 경도, 중등도, 고도로 나누고 수술 3주, 6주, 9주에 각 군별로 비교하였다. 또 섬유화 정도 를 관찰하기 위해 proliferating cell nuclear antigen (PCNA) label 및 -smooth muscle actin (SMA) 항 체를 이용한 면역조직 화학염색을 시행하였는데 연속된 6개의 고배율 시야(×400)에서 양성 세포가 평균 10%
이하를 차지한 경우는 1점, 11-30%는 2점, 31-50%는 3점, 51-70%는 4점, 71% 이상은 5점으로 하여 각 군별 로 비교하였으며 결과는 한명의 병리학 전문의에 의해 판독되었다.
3) 통계
통계학적 처리는 Kruskal Wallis검정을 이용하였으
며 p값이 0.05 이하인 경우를 통계학적 유의성이 있는 것으로 하였다.
결 과
1. 육안 관찰
수술 후 3주에는 세 군 모두에서 봉합을 시행한 절단면 의 주위로 전반적인 부종과 육아조직 덩어리가 건초 및 건 조직 주변에 관찰되었으며 건의 복원이 진행되는 양 상이 관찰되었다. 유착은 세 군에서 모두 관찰되었으며 C군에서 그 정도가 다소 경미하였고 B군과 C군에서 양 막의 비후 소견이 관찰되었다. 수술 후 6주 및 9주에는 모든 군에서 3주와 비교해 건주위의 육아조직의 감소와 유착의 감소가 관찰되었고 특히 C군의 감소 소견이 뚜렷 하였다.
2. 조직학적 소견 1) H&E 염색
H&E 염색에서 염증세포의 침윤정도를 광학현미경으
로 관찰한 결과 모든 시기에서 C군의 염증세포 침윤정도 가 A군과 B군에 비해 상대적으로 적은 것으로 관찰되었 으며 이는 통계학적인 유의성이 있었다(p=0.003<0.05) (Table 1, Fig. 1).
2) Masson-trichrome 염색
근육조직은 붉은색으로 염색되고 섬유화가 진행된 조 직은 청색으로 염색되었다. 수술 후 3주, 6주에 A군과 B군에 비해 C군의 섬유화 정도가 경미한 것으로 관찰되 었고 모든 군에서 9주에는 별다른 차이가 없었다.
3) 면역조직 화학염색 (1) PCNA
수술 후 3주째에 A군과 B군은 평균 5점, C군은 3점이 었으며 6주, 9주째에 각각 A군은 4점과 2점, B군은 3점 과 2점, C군은 2점과 1.5점으로 모든 시기에서 C군의 섬 유아세포로의 분화 정도가 상대적으로 적은 것으로 관찰 되었으나 통계학적인 유의성은 없었다(p=0.109>0.05) (Table 2).
(2) SMA
수술 후 3주째에 A군과 B군은 평균 5점, C군은 1점이 었으며 6주, 9주째에 각각 A군은 4.5점과 2점, B군은 4.5점과 1.5점, C군은 모두 1점으로 모든 시기에서 C군
Numbers of inflammatory cells 3 weeks 6 weeks 9 weeks
Group A ≥31 21-30 ≤20
Group B 21-30 21-30 ≤20
Group C ≤20 ≤20 ≤20
Table 1.Comparison of the mean number of inflammatory cells on 6 consecutive high power (×400) fields
Fibroblast scores*
3 weeks 6 weeks 9 weeks
Group A 5.0 4.0 3.0
Group B 5.0 3.0 2.0
Group C 3.0 2.0 1.5
Table 2.Comparison of the mean PCNA fibroblast score according to the positive cell percentage on 6 consecutive high power (×400) fields
scores*: positive cell percentage ≤10%=1, 11-30%=2, 31-50%=3, 51-70%=4, ≥71%=5.
A
B
C
Fig. 1.An inflammatory cell infiltration in three groups. The left column shows the surgical site 3 weeks after surgery and the right column at 6 weeks. The first row is group A the second row is group B and the third row is group C. In the epithelial layer (black arrow) of the amnion on 3 weeks, there were fewer inflam- matory cells than in the stromal layer (white arrow). Group C had the lowest number of inflammatory cells at any time. After 6 weeks, there are fewer inflammatory cells than at 3 weeks in all groups (H&E, ×400).
3 weeks 9 weeks
의 근섬유 모세포로의 분화 정도가 적은 것으로 관찰되 었으며 통계학적인 유의성이 있었다(p=0.005<0.05) (Table 3, Fig. 2).
고 찰
건 손상 또는 수술적 재건술 후 건 운동을 제한하는 주 위의 유착은 해결하기 어려운 문제이며, 이는 반복적인 수술, 거친 수술수기, 과도한 출혈, 봉합사의 조직반응, 수술 후 염증 등에 의해 발생하는 것으로 알려져 있으며 수술에 따른 창상치유 자체로도 유착이 일어나므로 그 발생을 완전히 방지하는 것은 어렵다. 따라서 수술시 적 절한 절개, 정확한 조직 층의 박리, 출혈방지, 무균수술, 봉합사의 적절한 선택 및 이로 인한 이물반응의 최소화, 단단한 봉합으로 고정기간을 줄여 유착을 최소화하는 것 이 중요한 것으로 알려져 있다17,26).
수술적 방법 외에 유착의 발생을 최소화하기 위한 약물 요법으로 반흔 조직 내 교원질의 생합성 억제제인 cis- hydroxyproline과 교원조직의 교차 연결을 방해하는 lathyrogen 등에 대한 보고가 있으나3,7)임상적인 적용 을 할 수 없는 상태이다. 건막의 봉합은 그 자체가 정상 적인 건의 환경을 회복시킨다는 개념에 근거해 이상적이 라 할 수 있으나, 건의 미끄러짐을 위한 공간을 협소하게
만들 뿐 아니라, 건막의 일부분이 결손될 가능성이 높고 이로 인해 효과적으로 복원되지 못할 가능성이 있기 때 문에 유착을 막기는 힘들다. 이러한 이유 때문에 유착을 막기 위해 다양한 방법이 사용되어지는데 이는 파열된 건을 외부의 환경으로부터 분리하는 물질의 삽입이다. 이 러한 삽입물은 생물학적일 수도 있고 합성일 수도 있다.
외벽측 복막24), 근막성 패취19), 신근지대12,23) 등은 정상 조직의 절제가 필요하며 기능구조의 소실이 초래된다. 또 이전에 사용된 합성 매개체로 만들어진 삽입물은 새로운 막을 형성하여 건의 활주운동을 용이하게 하나 외부물질 에 대해 이물반응의 부작용이 있다28).
본 실험에서 사용된 인간의 양막은 효과적인 생물학적 삽입물이며 이것은 값이 싸고, 쉽게 구할 수 있으며 여러 논문에서 부작용이 없다고 증명된 바 있다6,10,15,21). 양막 은 태반의 가장 안쪽에 있는 0.2-0.5 mm의 얇은 막으 로 태아를 둘러싸고 있어 모체로부터의 각종 감염, 면역 반응으로부터 태아를 보존하는 장벽의 역할을 한다13,14). 양막의 상피 표면은 평탄하고 유착성이 없으며 반면 내 부 실질은 거칠고 유착성이 있다. 이러한 이유로 양막은 건막을 대신하는 대체물로 사용되기보다 건의 외부표면 을 덮는 덮개로 사용되어졌다10). 또한 평활근세포, 신경, 림프관 및 혈관과 major histocompatability complex (MHC)의 결핍으로 이종, 동종간 거부반응이 거의 없다 고 알려져 있다21). 지금까지 임상적으로 알려진 양막의 역할은 정상적인 상피세포의 특성은 유지시키고 상피세 포 성장을 촉진하며 항염증 작용과 신생혈관 억제 작용 및 반흔 형성 억제 작용을 하는 것이다21). 이는 양막 자체 가 IL-1, IL-8, PMN elastase 등을 하향조정해 항염 증작용을 나타내고, 염증세포를 흡착하고, 염증세포의 apoptosis를 유발시켜 염증세포가 창상조직에 침투하지 못하도록 하는 것과 관련이 있으며 TGF- 신호전달 체
Anti- smooth muscle actin scores*
3 weeks 6 weeks 9 weeks
Group A 5.0 4.5 2.0
Group B 5.0 4.5 1.5
Group C 1.0 1.0 1.0
Table 3.Comparison of the mean anti- smooth muscle actin scores according to the positive cell percentage on 6 con- secutive high power (×400) fields
scores*: positive cell percentage ≤10%=1, 11-30%=2, 31-50%=3, 51-70%=4, ≥71%=5.
A
Fig. 2.The expression of -smooth muscle actin in the three groups. The left column is shows the operation site on 3 weeks after surgery, the middle column at 6 weeks and the right column at 9 weeks. First row is group A second row is group B and third row is group C. Group C had the lowest number of fibroblasts showing a strong positive reaction at any time (Immunohisto- chemical stain for -smooth muscle actin, ×400).
3 weeks 6 weeks 9 weeks
B
C
계를 억제시켜 섬유 모세포의 활동을 제한하고 근섬유 모 세포로의 분화를 억제하여 반흔 형성을 줄이는 것과도 연관이 있는 것으로 보인다29). 또한 양막은 간엽 줄기세 포와 유사한 표현형을 가지고 있어 여러 세포로 분화가 가능하여 세포치료나 이식에 잠재력이 있어 활발한 연구 가 진행되고 있다27).
그러나 여러 양호한 양막 이식의 효과에 대한 보고와 달리 Ozeren 등20)은 토끼의 난소에 대한 수술 후 유착 에 관한 실험에서 양막이 섬유소 접착제보다 효과적이지 못하다고 하였으며 이 등16)은 토끼의 아킬레스건 봉합 후 단순 처리된 양막 이식 결과 2주 후부터는 오히려 염증이 증가되었다고 보고하였고 본 실험에서도 역시 단순한 양 막 이식이 대조군과 비교하여 조직 유착 방지에 큰 효과 가 없었다. 인간의 양막은 MHC가 결핍되어 있으므로21) 본 실험에서 단순한 양막 이식군이 방사선 처리된 양막 이식군에 비해 염증, 유착이 심했던 것은 이종간의 거부 반응이라기 보단 양막 처리과정 중 virus와 미생물에 의 한 오염에 기인한다고 보인다. Yousof30)는 산모의 sc- reening test 및 양막 세척처리 과정이 많은 부분에서 오염을 막지만 방사선 처리라는 최종적인 살균 과정을 거쳐야 virus와 미생물의 침입을 최대한 억제한다고 하 였으며, Pelkar 등22)은 동결처리 후 방사선 처리된 양막 이 우수한 살균 능력을 가지며 기존의 양막에 비해 사용 하기가 매우 용이하다고 하였다.
본 실험에서도 SMA 항체를 이용한 면역조직 화학 염 색에서 모든 시기에 방사선 처리된 양막을 이식한 군에서 단순 봉합군과 양막 이식군에 비해 통계학적으로 유의하 게 근섬유 모세포로의 분화 정도가 적었고 염증 세포가 감소된 것은 방사선 처리과정을 거친 양막이 멸균에 효과
적이며22,25,30)이것으로 인한 이식부의 염증 감소와 이로
인한 유착 감소가 좋은 결과를 유발한 것으로 추측된다.
그리고 본 실험에서는 건의 부분 봉합 후 석고 고정을 하 지 않아 고정으로 인한 유착의 발생도 일부 억제되었을 것으로 생각된다.
결 론
닭의 굴곡 건 파열의 봉합 시에 방사선 처리된 양막 이식 이 염증 및 조직 유착 감소에 효과적이며 향후 양막 이식 이 치유 건의 강도에 미치는 영향에 대한 추가 연구가 필 요할 것으로 사료된다.
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