PREVENTION RESEARCH □ORIGINAL ARTICLE□
26 책임저자：박해룡, 631-701, 경남 마산시 월영동 449번지
경남대학교 식품생명학과
Tel: 055-249-2689, Fax: 055-249-2995 E-mail: [email protected]
접수일：2008년 3월 5일, 게재승인일：2008년 3월 20일
Correspondence to：Hae-Ryong Park
Department of Food Science and Biotechnology, Kyungnam University, 449, Wolyoung-dong, Masan 631-701, Korea
Tel: ＋82-55-249-2689, Fax: ＋82-55-249-2995 E-mail: [email protected]
대장암 세포주 HT-29에 대한 제비꽃(
Viola mandshurica
) 추출물의 세포독성 효과1경남대학교 식품생명학과, 2경남대학교 식품영양학과
조경진1ㆍ박은주2ㆍ이승철1ㆍ박해룡1
The Cytotoxic Effects of the Viola mandshurica Extracts on HT-29 Human Colon Cancer Cells
Kyung-Jin Jo1, Eunju Park2, Seung-Cheol Lee1 and Hae-Ryong Park1 Departments of 1Food Science and Biotechnology, 2Food and Nutritional Sciences,
Kyungnam University, Masan 631-701, Korea
This study was performed to investigate the cytotoxic activity from Viola mandshurica (VM) extracts.
Traditionally, VM has been used in the prevention and treatment of anti-inflammatory, diuretic. However, the cytotoxic activity of VM against cancer cells has not, until now, been elucidated. We found that the extracts of V. mandshurica (VME) have cytotoxic effects on HT-29 human colon cancer cells. As expected, VME inhibited growth of HT-29 cells in a dose-dependent manner as assessed by the MTT reduction assay, the LDH release assay, and colony formation assay. Interestingly, we also detected apoptotic bodies on Hoechst staining. These results indicate that VME contains bioactive materials with strong activity, and is a potential chemotherapeutic agent candidate against human colon cancer cells.
(Cancer Prev Res 13, 26-32, 2008)
Key Words: Cytotoxicity, Viola mandshurica, HT-29 cells, Apoptosis, Bioactive materials
서 론
최근 우리나라의 경제발전에 따른 생활수준의 향상과 외식문화의 급격한 보급으로 인해 식생활의 형태가 변 화되고 있으며 복잡한 사회생활에 따른 스트레스와 함 께 각종 질환을 가져오게 되었다.1∼3) 특히 암의 발생으 로 인한 사망률이 점차 증가하는 추세로 한국인의 암으 로 인한 사망률은 전체 사망률에 1위를 차지하고 있으며 그 중, 위암 및 간암의 발생률이 가장 높은 비중을 차지 하고 있으나 폐암, 대장암, 식도암 등의 발생빈도가 점차 증가하고 있는 실정에 있다.4∼7)
암은 복합적으로 작용하여 일어나는 multi-step process
로 발생하며 원인으로 유전적, 면역학적 등의 내적인자 와 물리ㆍ화학적 발암인자, 바이러스 등의 외적인자로 나누어 볼 수 가 있으며,8∼10) 암을 치료하더라도 50% 이 상의 암 환자들이 사망에 이르게 된다.11,12)
특히 대장암은 맹장, 결장, 직장에 생기는 악성 종양으 로서 혈관을 중심으로 많은 세포들이 덩어리진 형태로 성장하는 대표적인 고형암으로 세포의 중심부까지 약물 이 제대로 투과 하지 못하기 때문에 대장암 세포를 완전 히 제거하기란 어렵다.13∼15) 현재 진행되고 있는 대장암 치료법으로는 외과수술(surgery), 방사선 치료(radiation therapy), 및 화학요법(chemotherapy) 등이 이용되고 있는 데 조기 대장암일 경우에는 수술만으로도 좋은 생존율 이 기대되지만 전이된 환자의 경우에는 치료효과가 좋
지 못한 실정이다.16,17) 또한 대장암 치료에 사용하고 있 는 항암제는 암세포뿐만 아니라 정상세포에도 영향을 미쳐 다양한 부작용을 야기하고 있는데 대표적인 예로 는 탈모나 구토 등을 초래하며, 지속적인 항암제 사용으 로 인한 약재 내성 및 암세포 증식에 영향을 미치게 된
다.18∼21) 따라서 정상세포에 대해 독성이 없으며 암세포
에만 특이적으로 작용하는 항암물질을 개발하기 위하여 예로부터 질병의 예방 및 치료에 사용되어온 천연물로 부터 항암 성분을 찾으려는 연구가 활발히 진행되고 있 는 실정이다.22,23)
본 연구팀에서는 국내ㆍ외에서 자생하고 있는 약용 식물을 대상으로 대장암 세포주의 성장을 효과적으로 저해하는 천연추출물의 탐색을 시도하였다. 그 결과 제 비꽃(Viola mandshurica) 추출물로부터 대장암 세포주에 대 한 세포독성을 확인 할 수 있었다. 본 연구에 사용된 제 비꽃은 다년생 초본으로 줄기가 없고 잎은 뿌리로부터 총생하며 엽병이 길고 날개가 있으며 성분으로는 flavo- noid, 배당체, orientin, isoorientin 등이 함유되어 있다.24) 제 비꽃은 청열, 소종, 소염 등의 약리작용과 적리균, 황색 포도상구균, 폐렴구균, 피부진균, 결핵균 등이 억제되는 항균 및 항진균 작용 등이 알려져 있지만 항암활성에 관 련된 연구는 아직 초보적인 단계에 불과하다.25) 따라서 본 연구에서는 천연자원으로부터 항암활성을 가지는 물질을 탐색하기 위한 목적으로 제비꽃 추출물 을 대장암 세포주에 처리하여 세포독성을 확인함으로써 제비꽃이 가지는 항암활성 효과를 밝히고자 하였다.
재료 및 방법 1. 시약 및 실험재료
본 실험에 사용한 제비꽃은 경상남도 산청군 지리산 근처에서 채집하여 음건, 추출하여 실험에 사용하였다.
대장암 세포주 배양을 위해 필요한 RPMI1640 medium, fetal bovine serum (FBS) 및 penicillin-streptomycin 등은 Gibco- BRL (Grand Island NY, USA)에서 구입하였고, 암세포의 세포독성 효과를 실험하기 위한 시약으로 MTT(3-[4,5- dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)는 Sigma Chemical Co. (St Louis, Mo, USA)로부터 구입하였으며, LDH (Lactate Dehydrogenase) release assay kit는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan)로부터 구입 하였다.
그 외의 연구에 사용된 여러 가지 용매 및 시약은 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다.
2. 추출물 및 분획물 제조
제비꽃 10 g에 acetone 용매 200 ml을 가하여 상온에서 3일 동안 정치시켜 추출한 후, 여과지(5C. 110 mm, Ad- vantec, Tokyo Roshi Kaish, Ltd., Tokyo, Japan)로 여과하였 다. 여과된 추출여액은 회전감압농축기(EYELA N-1000, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 40oC에서 감압 농축하여 용매 추출물을 얻었다. 제비꽃 acetone 추 출물을 50 mg/ml DMSO (dimethyl sulfoxide)에 녹여 적당 한 농도로 희석하여 실험에 사용하였고 1% DMSO가 되 도록 처리하였다.
3. 암세포 배양
제비꽃의 세포독성을 실험하기 위해 한국세포주은행 (KCLB, Seoul)으로부터 인간 대장암 유래의 세포주 HT- 29를 분양받아 본 실험에 사용하였다. 세포배양을 위해 RPMI1640 medium에 10% fetal bovine serum (FBS) 및 100 unit/ml의 penicillin, 100μg/ml의 streptomycin을 첨가하여 사용하였고, 95%의 습도가 유지되는 37oC, 5% CO2 incu- bator (MOC-18AIC, SANYO, Osaka, Japan)에서 배양하였다.
4. 암세포의 형태학적 변화 관찰
제비꽃 acetone 추출물에 대한 HT-29 세포주의 형태학 적인 변화를 관찰하기 위해 6 well plate에 2×105 cells/ml로 2 ml씩 첨가하여 24시간 동안 배양하고 100, 250, 500μg/
ml의 농도로 추출물을 24시간 처리한 후, phase-contrast microscope (Nikon, Japan)를 이용하여 변화된 HT-29 세포 주의 형태학적 특징을 촬영하였다.
5. MTT 분석을 통한 세포 생존율 측정
제비꽃 acetone 추출물의 세포독성을 측정하기 위하여 MTT reduction assay를 실시하였다. 세포주를 1×105 cells/ml 로 맞추고 96 well plate 에 각각 100μl씩 첨가하여 24시 간 동안 37oC, 5% CO2 incubator에서 배양한 후, 100, 250, 500μg/ml 의 농도로 제조하여 HT-29 세포주에 처리하였 다. 24시간 동안 배양한 후, 각 well에 PBS 완충용액에 녹 인 MTT (5 mg/ml) 용액을 10μl씩 첨가하여 다시 1시간 동안 배양 시킨다. Formazan 형성을 확인한 후, 배지를 완전히 제거하고, well 바닥에 형성된 formazan을 녹이기 위해 100μl의 DMSO를 첨가한 후, ELISA reader (Model 680, BioRad, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측 정하여 제비꽃 acetone 추출물을 처리하지 않고 배양시킨 대조군 세포를 100%로 하였을 때의 상대적인 세포성장 억제율로 나타냈다.
Fig. 1. Analysis of morphological changes resulting from acetone extract of Viola mandshurica (VME) in HT-29 cells. The cells were exposed to various concentrations of VME, and morphological changes were monitored for 24 h. (A) Control, (B) 100μg/ml, (C) 250μg/ml, and (D) 500μg/ml. The pho- tographs were taken with a phase-contrast microscope at
×100 magnification. The results are representative of two independent experiments.
6. LDH 측정에 의한 세포독성 확인
제비꽃 acetone 추출물의 세포독성을 측정하기 위한 방 법으로 LDH release assay를 실시하였다. HT-29 세포주를 1×105 cells/ml로 맞춘 후, 100μl씩 96 well plate에 분주하 여 CO2 incubator에서 24시간 동안 배양한 뒤, 100, 250, 500μg/ml의 농도로 제조한 제비꽃 acetone 추출물을 세 포주에 처리하였다. 다시 24시간 동안 배양한 후, 배양액 을 새로운 96 well plate에 50μl 분주하고, 이 배양액에 LDH reagent를 50μl씩 첨가하여 상온에서 정치시킨 후, 20분간 반응하였다. 반응이 완료되면 stop solution인 1N HCl을 100μl씩 첨가하여 반응을 중지시킨 후, ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 살 아남은 세포의 LDH 측정을 위해 배양액을 제거한 후, 0.5% triton X-100용액을 50μl 첨가하여 40 rpm으로 10분 동안 shaking시켜 세포벽 깨트린 다음, 같은 방법으로 LDH reagent 50μl를 첨가하여 반응 시키고, 반응이 끝나 면 반응 정지액을 넣은 뒤, 540 nm에서 흡광도를 측정하 였다. LDH에 의한 세포독성의 백분율은 배양액과 살아 있는 세포에서 유리된 총 LDH에 대한 배양액으로부터 유리된 LDH의 값으로 계산하여 무처리 대조군과 비교 한 값을 나타냈다.
7. Colony formation assay 통한 세포독성 확인
HT-29 세포주를 24 well plate에 5×104 cells/ml로 plating 하여 배양시킨 후 제비꽃 acetone 추출물을 100, 250, 500 μg/ml의 농도로 처리하고 다시 24시간 반응시킨 후 새 로운 배지로 희석하여 6 well plate에 1×103 cells/ml이 되도 록 replating 하여 7∼8일 동안 37oC, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 형성된 colony는 10% formaldehyde로 고정하 고, 0.01% crystal violet으로 염색하여 counting 하였다. 세 포 생존율은 무처리 대조군의 값을 100%로 두고 계산하 여 얻을 수 있었다.
8. Hoechst 33342 staining
6 well plate에 2×105 cells/ml로 24시간 동안 배양하여 제 비꽃 acetone 추출물 100, 250, 500μg/ml의 농도로 처리한 후, PBS 완충액으로 2회 세척하고 10% formalin을 처리하 여 4시간 고정한 후 다시 PBS로 세척하고 Hoechst 33342 (Sigma, MO, USA)로 30분 동안 염색하였다. 염색 후 PBS 로 세척하고 형광 현미경 하에서 400배로 관찰하였다.
9. 통계처리
모든 자료의 처리는 SPSS-PC＋ 통계 package를 사용하
여 처리하였다. 각 항목에 따라 백분율과 평균치±표준 편차(SD)를 구하고 각 추출물의 세포독성 정도를 비교하 기 위해 one-way 분산분석(ANOVA)을 시행하여 F값을 구 하고 Scheffe's test를 이용하여 대조군과 각 구간의 유의성 차이를 검증하였다. 통계적 유의성은 5% 수준에서 평가 하였다.
결 과
1. 대장암 세포주 HT-29에 대한 제비꽃 추출물의 세 포독성 효과
대장암 유래의 세포주에 제비꽃 추출물의 세포독성을 확인하기 위해 각 용매별로 제비꽃 추출물을 다양한 농 도로 제조하여 대장암 세포주에 처리하고 추출물을 처 리하지 않은 대조군과 비교하여 대장암 세포 성장 억제효 과를 확인 하였으며 그 중 acetone 추출물을 처리한 세포 주에서 가장 높은 세포사멸이 나타났다(data not shown).
제비꽃 acetone 추출물의 대장암 유래의 세포주인 HT- 29에 대한 세포독성을 조사하기 위해 형태학적 관찰과 MTT reduction assay, LDH release assay를 이용하여 확인한 결과는 Fig. 1과 Fig. 2와 같다. 제비꽃 acetone 추출물이 HT-29 세포주에 대한 형태학적 변화에 미치는 영향을 알아보기 위해 위상차 현미경을 이용하여 무처리한 대 조군과의 비교를 통해 세포의 형태를 관찰하였다. 제비
Fig. 3. VME-induced cell death in HT-29 cells. The cells were exposed to the indicated concentrations of VME for 24 h. After colony formation, the survival rate (means±S.D of triplicate determinations) was calculated by setting each of the control survival rates. After 7∼8 days, the formed colonies were fixed with 10% formaldehyde, stained with 0.01% crystal violet, and counted. ***significant vs. control untreated cells (p＜0.001).
Fig. 2. Effects of VME on cell viability and cytotoxicity in HT-29 cells. The cells were exposed to the indicated concentrations of VME for 24 h. Cell viability and cell death were measured with the MTT reduction assay (A) and LDH release assay (B), respectively. The data (mean±S.D of triplicate determinations) are representative of at least three independent experiments. **:
p＜0.01; ***: p＜0.001.
꽃 acetone 추출물을 100, 250, 500μg/ml의 농도별로 각각 처리한 결과, 무처리한 대조군과 비교하였을 때, 전체적 인 세포의 수가 적을 뿐 만 아니라 그 형태가 응축되어 있으며 불규칙적인 형태를 가지면서 세포사멸이 나타난 것이 관찰되었다(Fig. 1). 형태학적 변화에 따라 제비꽃 acetone 추출물의 세포독성에 대한 결과는 Fig. 2와 같다.
먼저 HT-29 세포주에 세포독성 효과를 알아 보기위해 MTT reduction assay 방법을 이용해 아무것도 처리하지 않 은 대조군과 제비꽃 acetone 추출물의 농도별 처리한 실 험군을 비교하였다. Fig. 2A와 같이 제비꽃 acetone 추출 물을 100, 250, 500μg/ml로 세포주에 처리하였을 때 68.6%, 57.7%, 51.9% 농도 의존적으로 세포독성 효과를 확인할 수 있었다. 또한 동일한 조건하에 세포 손상 정도 를 확인하기 위하여 배양액 중 들어있는 LDH (lactate dehydrogenase)의 방출량을 측정한 결과 Fig. 2B와 같이 제 비꽃 acetone 추출물을 100, 250, 500μg/ml 처리했을 때 14.7%, 21.1%, 58.6% 증가하였다.
세포 독성 효과를 좀 더 정확하게 알아보기 위해 세포 의 damage에 대한 세포의 복구 능력을 확인하기 위한 colony formation assay를 이용한 결과 Fig. 3과 같다. HT-29 세포주에 제비꽃 acetone 추출물을 100, 250, 500μg/ml 농 도별로 처리한 결과 100μg/ml에서 50% 정도 HT-29 세 포주에 성장억제 효과를 나타냈으며 250, 500μg/ml에서 90% 정도의 세포사멸을 유도 하는 것 을 알 수 가 있다.
이상의 결과로부터 제비꽃 acetone 추출물이 HT-29 세 포주에 대해서 강력한 세포독성 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다.
2. 제비꽃 acetone 추출물의 apoptosis 유도 효과
Apoptosis는 다세포생물에서의 programmed cell death를 일컫는 용어로 세포의 죽음에 관련되어 능동적으로 일 어나는 세포의 죽음 과정 중 하나이다.26) Apoptosis가 일 어나면 세포는 면역반응을 일으켜, 핵의 condensation 및 DNA가 일정한 크기로 조각나는 형상을 비롯하여 세포 질속 세포소기관 및 세포막 등에서의 변화가 발생하여 세포가 사멸하게 되는 것으로 알려져 있다.27) 일반적으
Fig. 4. Analysis of apoptotic body of VME in HT-29 cells. The cells were collected for various experiments of apoptosis induction. The morphological features of HT-29 cells treated with various concentration of VME. (A) Control, (B) 100μg/ml, (C) 250μg/ml, and (D) 500μg/ml. The arrow indicates the apoptotic cell. The results are representative of at least two independent experiments.
로 암세포들은 이러한 apoptosis 경로가 불활성화 되어져 계속해서 증식하게 되는 것이다. 본 논문에서는 제비꽃 acetone 추출물이 가지는 세포독성 효과의 기전 연구를 위하여 HT-29 세포주의 apoptosis 활성 여부를 확인하였 다. Apoptosis의 형태학적 특징 중의 하나인 핵의 변화를 관찰하기 위해서 핵 내 DNA에 특이적으로 결합하는 형 광 염색제인 Hoechst 33342를 사용하여 핵을 염색하고 형광 현미경으로 관찰하였다(Fig. 4). 제비꽃 acetone 추출 물 100, 250, 500μg/ml 농도별로 처리한 후 HT-29 세포 주의 핵의 변화를 관찰해 본 결과 대조군은 타원형의 온 전한 핵 모양을 나타낸 반면 500μg/ml을 처리한 세포의 핵은 condensation과 fragmentation으로 인한 apoptotic body 가 핵 주변에 나타나는 전형적인 apoptosis 특징을 나타내 었다.
이러한 결과는 제비꽃 추출물에 의한 세포독성 효과 가 apoptosis에 기인함을 나타낸다고 할 수 있다.
고 찰
암의 조직은 자율적인 과잉 성장이며, 정상조직에 대 하여 파괴적인 것이라고 정의하고 있으며 그 발생원인 과 기전이 명백히 밝혀져 있지 않은 질병이므로 현대사 회에서 심각한 문제로 대두되고 있다.28) 치료요법으로는 수술요법, 방사능요법, 화학요법과 면역요법 등이 주로 활용되고 있는데 그 중 화학요법의 이용 빈도가 높으나
많은 부작용이 초래하고 있으며 대표적인 예로는 오심ㆍ 구토, 탈모 및 피부손상 등이 발생을 한다.18∼21) 따라서 효과적인 항암제 개발을 위하여 천연물로부터 항암 성분 을 찾으려는 연구가 체계적으로 진행되어지고 있다.22,23) 제비꽃(Viola mandshurica)은 다년생 초본으로 성분으로 는 orientin, isoorientin 등이 함유되어 있으며 약리 작용으 로는 청열, 소염, 항균 및 항진균 작용 등이 알려져 있으 나 제비꽃의 항암활성을 비롯한 생리활성에 관련된 연 구는 아직 초보적인 단계에 불과하다.24,25)
본 연구에서는 제비꽃 acetone 추출물의 세포독성 효과 를 알아보기 위해 인간 대장암 유래의 세포주인 HT-29 에 실험한 결과 100, 250, 500μg/ml의 농도에서 세포독 성 효과가 나타났다(Fig. 2, 3). 그리고 제비꽃 acetone 추 출물을 농도별로 처리한 후 대조군과 비교했을 때 전체 적인 세포 수가 적을뿐만 아니라 그 형태가 응축되어 있 으며 불규칙적인 형태로 세포사멸이 나타났다(Fig. 1).
제비꽃 acetone 추출물이 가지는 세포독성 효과의 기전 연구를 위하여 HT-29 세포주의 apoptosis 유도를 확인하 는 실험을 하였다. Apoptosis는 조직이 상해를 입었거나 바이러스 등에 감염되어 잠재적으로 위험한 세포가 생 긴 경우 이들을 제거하여 생물체가 최적의 상태로 있기 위한 방어기작으로 조직, 개체의 분화, 발생, 생리현상 등에도 관여를 한다. 따라서 apoptosis는 몸의 효율적인 생존을 위한 세포의 능동적 사망기전으로 유전자 제어 를 통해 지배되는 programmed cell death으로 인식 되고
있다.29,30) Apoptosis의 형태학적 변화는 chromatin conden-
sation, cell shrinkage, 그리고 nuclear fragmentation 등이 일 어나는 것으로 Fig. 4에서도 apoptotic body가 형성되는 것 을 알 수 있었다.
이상의 결과를 바탕으로 제비꽃 acetone 추출물의 세포 독성 효과는 apoptosis 경로의 활성화에 의해 일어나는 것 으로 생각된다.
결 론
본 연구는 제비꽃(Viola mandshurica) 추출물의 세포독성 효과를 확인하기 위한 연구로서 제비꽃을 acetone으로 추 출한 뒤, 인간 대장암 유래의 세포주인 HT-29에 농도별 로 처리하여 대조군과 비교 하였다. 먼저 현미경에서 관 찰한 결과 대조군에 비하여 암세포주의 수축 및 형태학 적 변화가 두드러지게 나타났다. MTT reduction assay, LDH release assay 및 colony formation assay를 실시한 결과 500μg/ml에서 51.9%, 58.6%, 2.8%로 높은 세포독성 효과 를 보였다. 그리고 Hoechst 33342 staining을 통하여 HT-
29 세포주의 shrinkage 및 chromatin condensation이 형성되 어 apoptosis를 유도하고 있다는 것을 확인할 수 있었다.
이상의 결과로부터 제비꽃(Viola mandshurica) acetone 추출 물이 인간 대장암 세포에 효과적인 항암활성 소재로 사 용될 수 있는 가능성을 제시하였다.
감사의 글
이 연구결과물은 2007학년도 경남대학교 학술연구장 려금 지원에 의한 것이며, 이에 감사드립니다.
참 고 문 헌
1) Ham SS, Cui CB, Choi HT, Lee DS. Antimutagenic and cytotoxic effects of Allium victorialis extracts. Korean J Food Preserv 11, 221-226, 2004.
2) Weisburger JH. Causes, relevant mechanism and prevention of large bowel cancer. Seminers in Oncology 18, 316-336, 1991.
3) Kweon YM, Kim BK, Rhee SH, Park KY. Anticancer effects of sorghum fractions in vitro using SRB assay. Cancer Pre Res 12, 136-142, 2007.
4) Doll R, Peto R. The causes of cancer: quantitative estimates of avoidable risks of cancer in the United States today. J Natl Cancer Inst 66, 1191-1308, 1981.
5) Kim EJ, Jung JI, Lee HS, Kang IJ, Khachik F, Park JHY.
Effect of carotenoids on the growth of HT-29 human colon cancer cells. J Korean Soc Food Sci Nutr 33, 428-436, 2003.
6) Cha JY, Jeon BS, Moon JC, Yoo JH, Cho YS. Cytotoxic effect of Inonotus obliquus composition in HCT-15 human colon cancer cells and AGS gastric cancer cells. J Korean Soc Food Sci Nutr 33, 633-640, 2004.
7) Choi WY, Park C, Kim KM, Han MH, Choi YH, Lee WH.
Induction of G2/M arrest by Genistein in human AGS gastric carcinoma and SK-MEL-2 melanoma cells. Cancer Prev Res 11, 311-320, 2006.
8) Cha MR, Kim JY, Hwang JH, Park HR. Cytotoxic activity of the Inula japonica extracts against several human cancer cell lines in vitro. Kor J Pharmacogn 37, 130-135, 2006.
9) Joo HZ, Lee HS, Lee TS. A clinical study of 5-year survival rate of stomach cancer according to postoperative anticancer chemotherapy. J Korean Cancer Assoc 24, 140-148, 1992.
10) Park KJ, Kim EH, Eun YA, Kang BJ, Sung HJ. Cytotoxic effect of Korean traditional prescriptions on the human gastric cancer cell lines. Kor J Phamacogn 28, 233-238, 1997.
11) Andresen TL, Jensen SS, Madsen R, Jorgensen K. Synthesis and biological activity of anticancer ether lipids that are specifically released by phospholipase A2 in tumor tissue. J Med Chem 48, 7305-7314, 2005.
12) Xu F, Zhang SH, Shao RG, Zhen YS. Anticancer activity of sodium caffeate and its mechanism. Acta Phamacol Sin 26,
1248-1252, 2005.
13) Cha MR, Yoon MY, Kim JY, Hwang JH, Park HR. The cytotoxic effect of the Gleditsiae Semen extracts on human colon carcinoma cells. J Korean Soc Appl Bio Chem 49, 248-253, 2006.
14) Kim KH, Park HY, Nam JH, Park JE, Kim JY, Park MI, Chung KO, Park KY, Koo JY. The inhibitory effect of curcumin on the growth of human colon cancer cells (HT-29, WiDr) in vitro. Korea J Gastroenterol 45, 277-284, 2005.
15) Jo KJ, Yoon MY, Lee MR, Cha MR, Park HR. The anticancer effect of extracts Vitex rotundifolia on human colon carcinoma cell lines. J Korean Soc Appl Biol Chem 50, 228-232, 2007.
16) Hurwitz H, Fehrenbacher L, Novotny W, Cartwright T, Hainsworth J, Heim W, Berlin J, Baron A, Griffing S, Holm- gren E, Ferrara N, Fyfe G, Rogers B, Ross R, Kabbinavar F.
Bevacizumab plus irinotecan, fluorouracil, and leucovorin for metastatic colorectal cancer. N Engl J Med 350, 2335-2342, 2004.
17) Saltz LB, Meropol NJ, Loehrer PJ SR, Needle MN, Kopit J, Mayer RJ. Phase II trial of cetuximab in patients with refractory colorectal cancer that expresses the epidermal growth factor receptor. J Clin Oncol 22, 1201-1208, 2004.
18) Yang JH. The effect of foot reflexology on nausea, vomiting and fatigue of breast cancer patients undergoing chemo- therapy. J Korean Acad Nurs 35, 177-185, 2005.
19) Ryu BH, Park BG, Song SK. Antitumor effects of the hexane extract of Stachys Sieboldii MIQ. Korean J Biotechmol Bioeng 17, 520-524, 2002.
20) Fojo AT, Ueda K, Salmon DJ, Poplack DG, Gottesman MM, Pastan I. Expression of a multidrug-resistance gene in human tumors and tissues. Proc Natl Acad Sci 84, 265-269, 1987.
21) Chung HW, Choi JY, Lee WY. Cell size heterogeneity due to anticancer durg which might indicate resistance. J Korean Public Health Assoc 14, 35-46, 1988.
22) Liu WK, Xu, SX, Che CT. Anti-proliferative effect of ginseng saponins on human prostate cancer cell line. Life Sci 67, 1297-1306, 2000.
23) Ng ML, Yap AT. Inhibition of human colon carcinoma development by lentinan from shiitake mushrooms (Lentinus edodes). J Altern Complement Med 8, 581-589, 2002.
24) Ko WC, Shin MK. Experimental study on the analgesic and antiphlogisitic effect of Herba Violae. J of Herbology 6, 17-24, 1991.
25) Yook CS, Moon CK. Studies on the flavonoid glycoside of the leaves of Viola diamantiaca. Kor J Pharmacogn 16, 40-41, 1985.
26) Ko WG, Kang TH, Lee SJ, Kim YC, Lee BH. Rotundifuran, a labdane type diterpene from Vitex rotundifolia, induces apoptosis in human myeloid leukaemia cells. Phytother Res 15, 535-537, 2001.
27) Sen S, D'Incalci M. Apoptosis. biochemical events and relevance to cancer chemotherapy. FEBS Lett 307, 122-127, 1992.
28) Han DS, Han JH, Yu H, Kim JJ, Kang KU, Baek SH. The
cytotoxicity and antitumor activity of palsun brewing water.
Yakhak Hoeji 43, 173-179, 1999.
29) Lipponen PK, Aaltomaa S. Apoptosis in bladder cancer as related to standard proginstic factors and prognosis. J Pathol
173, 333-339, 1994.
30) Zhivotovsky B, Samali A, Gahm A, Orrenius S. Caspases:
their intracellular localization and translocation during apop- tosis. Cell Death Differ 6, 644-651, 1999.
