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미치는 영향
Effects of Metformin on Penile Expression of Nitric Oxide Synthase in OLETF Rats
Phil Hyun Song, In Soo Bae1, Yong Woon Kim2, Ki Hak Moon From the Department of Urology, College of Medicine, Yeungnam University,
1Hanvit Urology Clinic, 2Department of Physiology, College of Medicine, Yeungnam University, Daegu, Korea
Purpose: It is well known that metformin, an oral biguanide insulin- sensitizing agent, targets AMP-activated protein kinase (AMPK), which activates endothelial nitric oxide synthase (eNOS), which may be asso- ciated with erectile dysfunction. The aim of this study was to evaluate whether metformin activates eNOS in the penile tissue of a genetically obese rat model.
Materials and Methods: We measured phospho-eNOS levels and eNOS expression in the penile tissue of Otsuka Long Evans Tokushima Fatty (OLETF) rats after 3 days of treatment with metformin (150 or 300 mg) to evaluate whether metformin activates eNOS in the penile tissue of this genetically obese rat model. Seven-month-old OLETF rats were used, and eNOS expression was analyzed by real-time polymerase chain reaction (PCR). The experimental groups were compared with use of the Kruskal- Wallis or Mann-Whitney test.
Results: Seven-month-old OLETF rats had severe visceral fat deposition and elevated serum leptin concentrations. eNOS expression analyzed by real-time PCR was lower in the penile tissue of OLETF rats than in Long Evans Tokushima Otsuka (LETO) rats. Short-term treatment with met- formin did not change visceral fat mass or serum leptin levels. However, metformin treatment increased eNOS mRNA expression in the penile tissue as determined by real-time PCR. The levels of phospho-eNOS and phospho-AMPK (pAMPK) in penile tissue revealed a dose-dependent tendency to increase with metformin treatment; however, there was no statistical difference by Kruskal-Wallis test among the experimental groups. The pAMPK level was dose-dependently elevated in the soleus by metformin treatment. There was no significant change in pSTAT3 by metformin treatment in the soleus.
Conclusions: Metformin activates eNOS mRNA expression in the penile tissue of OLETF rats. Further study on the relation between erectile function and eNOS levels is needed for clinical application. (Korean J Urol 2009;50:179-185)
Key Words: Nitric oxide synthase, AMP-activated protein kinase, Penis
Korean Journal of Urology Vol. 50 No. 2: 179-185 February 2009
DOI: 10.4111/kju.2009.50.2.179
영남대학교 의과대학
비뇨기과학교실, 1한빛 비뇨기과
2영남대학교 의과대학 생리학교실
송필현ㆍ배인수1ㆍ김용운2ㆍ문기학
Received：September 4, 2008 Accepted：October 13, 2008
Correspondence to: Ki Hak Moon Department of Urology, Yeungnam University College of Medicine, 317-1, Daemyeong- dong, Nam-gu, Daegu 705-717, Korea
TEL: 053-620-3693 FAX: 053-627-5535
E-mail: [email protected]
Ⓒ The Korean Urological Association, 2009
서 론
산화질소 (nitric oxide; NO)는 L-arginine으로부터 NO synthase
(NOS)의 작용으로 합성되며, 음경해면체 평활근의 이완과 혈 관을 확장시켜 발기를 유도하고 음경해면체의 이완을 지속 하는데 필수적인 역할을 한다.1-3 또한 해면체 신경자극에 의한 음경발기는 NOS 억제제에 의해 억제된다는 점에서
NOS와 발기와는 깊은 관련이 있는 것으로 생각한다.4,5 따 라서 NOS의 감소는 음경조직의 순환과 기능적 변화를 초 래하게 되는데, 특히 비만 동물실험 모델에서 신장, 대동맥 및 심장에서 NOS가 감소된 결과들이 보고되고 있다.6 메트폴민은 체중 감소와 혈중 렙틴 농도를 감소시킬 수 있다는 점에서 비만형 당뇨병 환자에 우선적으로 선택되고 있는 약물이다.7 메트폴민의 세포 내 작용기전은 아직 완전 히 규명되어 있지 않은 실정이지만 AMP-activated protein kinase (AMPK)를 활성화시켜 인슐린의 작용을 증가시키는 것으로 알려져 있다.8 AMPK는 세포 내 AMP/ATP 비가 증 가된 상태에서 인산화를 통하여 활성화되고 에너지를 생산 하거나 소비하게 하여 지방과 당대사를 증가시키는 역할을 한다.9 그 외에 메트폴민은 NOS를 활성화시키는 것으로 알 려져 있다.10 Kim 등11은 고지방식이 비만쥐의 음경조직에 서 메트폴민이 감소된 NOS 발현을 증가시켰다고 보고하여 메트폴민이 음경조직의 NOS 발현에도 관여한다고 하였다.
그러나 고지방식이 유도 비만쥐에서의 이러한 메트폴민 효 과가 유전적인 비만 모델에서도 나타날지에 관해서는 보고 되지 않았다. 또한 NOS 발현이 메트폴민의 단기간 투여에 의하여 유도되는지와 활성화된 NOS로 볼 수 있는 인산화 된 NOS (phospho-eNOS)의 증가가 동반되는지에 관한 확인 도 필요하다.
이에 본 연구에서는 유전적인 비만 쥐인 Otsuka Long Evans Tokushima Fatty rat (OLETF)을 사용하여 3일간 메트 폴민을 처치한 후 음경조직의 AMPK량과 NOS 발현 및 단 백량 변화를 측정하여 메트폴민이 유전적인 비만 모델에서 음경의 NOS에 어떠한 영향을 미치는지를 조사하였다.
대상 및 방법 1. 실험 쥐의 관리와 실험군의 분류
OLETF 쥐를 오츠카 제약회사 (일본)로부터 제공받아 사 용하였다. 이유직후인 4주차에 수컷들만 제공받아 6개월을 영남대학교 의과대학 동물 사육사에서 키운 후 7개월령에 실험을 시작하였다. 쥐들은 오전 7시를 기준으로 12시간씩 밤과 낮이 반복되게 하였으며 23°C를 유지하였다. 실험군 은 생리식염수처치군 (n=6), 메트폴민 150 mg 처치군 (n=4), 메트폴민 300 mg 처치군 (n=7)으로 구분하였다. OLETF 쥐 에서 eNOS의 발현 변화를 확인하기 위하여 정상 대조군으 로 동일한 연령의 Long Evans Tokushima Otsuka (LETO) 쥐 (n=4)를 사용하였다.
7개월령의 OLETF 쥐 중 요당 검사에 음성인 쥐를 실험에 사용하였으며, 실험쥐들은 식이제한을 가하지 않아서 공복 시 혈당은 측정할 수 없었다. 식이제한을 하지 않은 상태의
혈당 (mM/l)은 LETO 쥐 14±0.7, 생리식염수처치 OLETF 쥐 15±3.3, 메트폴민 150 mg 처치 OLETF 쥐 14±0.4, 그리고 메트폴민 300 mg 처치 OLETF 쥐는 17±2.3으로 각 군 간에 유의한 차이는 나타나지 않았다.
2. 메트폴민 처치
메트폴민 (글루코파지, 대웅제약)은 150과 300 mg/kg의 농도를 생리식염수 1 ml에 녹여서 피하로 주사하였고, 생리 식염수처치군에는 같은 양의 생리식염수를 주사하였다. 메 트폴민은 3일간 처치하였는데, 이는 체중의 변화를 동반하 지 않고 메트폴민의 효과를 관찰하고자 하였기 때문이었 다. 메트폴민 300 mg/kg 용량은 메트폴민이 골격근에 작용 하여 의미 있는 효과를 나타내는 결과를 참고하였으며, 150 mg/kg 용량은 농도의존성을 관찰하기 위하여 사용하였다.12
3. 혈액, 음경, 가자미근 (soleus muscle)의 채취 및 복강 내 지방량 분석
실험동물을 Tiletamine와 Zolazepam (각각 50 mg/kg, ZoletilⓇ, Virbac, Carros, France)과 xylazine hydrochloride (8 mg/kg)를 복 강 내 주사하여 마취시킨 후 혈액을 채취하고 음경을 절제 하였으며, 오른쪽 뒷다리에서 가자미근을 절제하였다. 절제 한 음경과 가자미근을 액체 질소로 즉시 냉동시키고 분석 때까지 −80°C에서 냉동보관하였다. 음경은 해면체가 포함 된 부분을 절단하여 일부는 eNOS mRNA 발현분석에 사용 하고 다른 일부분은 단백질 분석에 사용하였다. 복강 내 지 방량은 복강에서 후복막강 지방 (retroperitoneal fat), 부고환 지방 (epididymal fat)과 신주위 지방 (perirenal fat)을 절제하 여 무게를 측정한 값으로 산출하였다.
4. Real time polymerase chain reaction (PCR) 쥐 음경에서의 eNOS 발현을 분석하기 위하여 real time PCR법을 사용하였다. RNA는 Chomczynski 와 Sacchi13의 방법 으로 추출하였으며 RNA 농도는 260 nm에서의 흡광도로 계 산하였다. 분리한 RNA 1μg을 70°C에서 5분 반응 시킨 뒤, M-MuLV Reverse Transcriptase와 dNTP, oligo (dT) primer를 넣 어 (First Strand cDNA Synthesis Kit, Fermentas) 42°C에서 60 분, 70°C에서 10분 반응시켜 cDNA를 만든다. 이후 FastStart Taq DNA plymerase (LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I, Roche)와 3 mM MgCl2, 0.4μM primer를 이용하여 LightCycler 1.5 Instrument에서 증폭시킨다. Internal standard로 는 β-actin을 사용하였다. Primer가닥은 Table 1에 나타냈다.
5. 단백질 분석
음경의 중간 부위에서 단백질을 추출하고 eNOS와 phospho-
Table 2. Body weight and total visceral fat mass of the experimental groups
Body weight (g) Total visceral fat (g) Initial Final
OLETF rats Normal saline Metformin 150 mg Metformin 300 mg LETO rats
Normal saline
639±27.7 645±54.8 646±26.0
519±42.8
620±27.2 621±54.0 623±24.1
515±41.6
56.9±3.44 50.6±7.22 48.8±4.30
16.2±2.76 Values are mean±SEM
Fig. 1. The expression of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) of penile tissues in Long Evans Tokushima Otsuka (LETO) and Otsuka Long Evans Tokushima Fatty (OLETF) rats. LETO; n=4, OLETF; n=4, Bars are mean±SEM of four experimental cases. a: p＜0.05.
Table 1. Primer sequences used for real-time PCR
Sequences Tm
(°C) Product
(bp) eNOS
Sense Anti-sense β-actin Sense Anti-sense
TCC GAT TCA ACA GTG TCT CCT ACA GAA GTG CGG GTA TGC TC
TAC TGC CCT GGC TCC TAG CA TGG ACA GTG AGG CCA GGA TAG
56
60 152
101
PCR: polymerase chain reaction, eNOS: endothelial nitric oxide synthase, Tm: melting temperature
Fig. 2. Changes in AMP-activated protein kinase (AMPK) and phospho-AMPK (pAMPK) in soleus muscle measured by Western blot in Otsuka Long Evans Tokushima Fatty (OLETF) rats.
pSTAT3: phospho-signal transducer and activator of transcription 3, GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.
eNOS를 분석하였다. 또한 AMPK와 pAMPK를 분석하였다. 메 트폴민의 효과가 잘 나타나는지를 확인하기 위한 reference조 직으로 사용한 가자미근에서는 렙틴 신호의 세포 내 초기신 호전달에 관여하는 signal transducer and activator of trans- cription 3 (STAT3)와 pSTAT3, AMPK와 pAMPK를 분석하였다.
Internal standard로는 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 사용하였다. 항체들은 Cell Signaling사 (Danvers, USA) 제품을 사용하였으며 ECL kit로 밴드를 발현하여 Scion Image software (NIH, USA)를 사용하여 분석하였다.
6. 자료의 분석
성적은 평균과 표준오차로 표시하였으며 OLETF와 LETO 간의 비교는 Mann-Whitney test로 하였으며, OLETF 쥐에서 pAMPK 단백량, phospho-eNOS 단백량 및 eNOS mRNA 발현 의 세 군 (생리식염수처치군, meformin 150mg 처치군, 메트 폴민 300 mg 처치군) 간의 유의성은 Kruskal-Wallis test로 검 정하였으며, 각 군 간 차이의 사후검정은 ANOVA의 다중비 교 (Tukey 방식)를 이용하였고, 통계 프로그램은 SPSS 15.OK를 사용하였다. 성적차이의 유의성은 p값이 0.05 미만 인 경우 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.
결 과 1. OLETF 쥐의 신체적인 특성
생리식염수처치군, 메트폴민 150 mg 투여군과 메트폴민 300 mg 투여군의 체중 (g)은 실험 시작 시 각각 639±27.7, 645±54.8, 646±26.0이었으며, 3일간의 메트폴민 또는 생리 식염수 주사 후에는 각각 620±27.2, 621±54.0, 623±24.1이었 다. 복강 내 지방량 (g)은 생리식염수처치군이 64.6±5.2, 메 트폴민 150 mg 투여군이 55.5±14.5, 메트폴민 300 mg 투여
Fig. 4. Changes in endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and AMP-activated protein kinase (AMPK) expression in penile tissue by Western blot in Otsuka Long Evans Tokushima Fatty (OLETF) rats. GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.
Fig. 3. Quantitative comparisons of phospho-AMP-activated protein kinase (pAMPK) expression by Western blot of soleus muscle in Otsuka Long Evans Tokushima Fatty (OLETF) rats. Bars are mean±SEM. Values that do not share a common superscript are significantly different at p＜0.05. GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.
Fig. 5. Quantitative comparisons of phospho-AMP-activated protein kinase (pAMPK) (A) and phospho-endothelial nitric oxide synthase (eNOS) (B) expressions by Western blot of penile tissue in Otsuka Long Evans Tokushima Fatty (OLETF) rats. Bars are mean±SEM.
GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.
군이 53.4±11.8로 각각 체중의 9.2, 8.1, 7.8%가 복강 내 지방 이었다 (Table 2).
2. 음경 eNOS mRNA 발현
음경의 eNOS mRNA 발현을 real time PCR로 분석하여 LETO와 비교한 결과 OLETF 쥐에서 LETO에 비하여 35±
17.9%로 유의한 감소를 나타냈다 (p＜0.05)(Fig. 1).
3. 골격근의 AMPK와 STAT3 신호
대표적인 서근인 가자미근에서 메트폴민에 의한 변화를 분석하기 위하여 AMPK와 STAT3뿐만 아니라 활성화된 형 태인 pAMPK와 pSTAT3를 Western blot으로 분석하였다. 인 산화된 AMPK는 메트폴민에 농도 의존적으로 증가하였으 나 pSTAT3는 각 군 간에 유의한 변화가 없었다 (Fig. 2, 3).
4. 음경의 pAMPK와 phospho-eNOS 단백량
OLETF 쥐의 음경 pAMPK와 인산화된 eNOS는 메트폴민 주사에 의하여 농도 의존적으로 증가하는 경향을 나타내었
Fig. 6. Changes in endothelial nitric oxide synthase (eNOS) expression by real-time polymerase chain reaction (PCR) in penile tissue. Bars are mean±SEM. Values that do not share a common superscript are significantly different at p＜0.05.
지만 비모수 다중회계분석 결과 통계적인 유의성은 나타나 지 않았다 (Fig. 4, 5).
5. 음경의 eNOS mRNA 발현
Real time PCR로 분석한 음경의 eNOS mRNA expression 은 대조군에 비하여 메트폴민 150 mg군에서 350%, 메트폴 민 300 mg군에서 270%로 증가하였다 (Fig. 6).
고 찰
성인형 비만의 모델로 사용되는 OLETF 쥐는 뇌의 chole- cystokinin-A (CCKA) 수용체에 결함이 발생하여 위장관으로 부터의 포만신호를 받아들이는데 장애가 발생하여 과식을 하게 되어 비만이 발생하는데, 주로 복강 내 지방 축적을 특징으로 하고 있다.14 본 연구에서도 7개월령의 OLETF 쥐 는 복강 내 지방이 체중의 약 7.8-9.2%에 이르는 심한 복부 비만을 나타냈다. 또한 혈중 렙틴 농도는 20 ng/ml가 고렙틴 증을 나타냈다. OLETF 쥐는 복부의 심한 지방축적으로 인 하여 제2형 당뇨병이 발생하는 것으로 알려져 있으나 본 연구에 사용한 7개월령의 쥐는 소변에 당뇨가 나타나지 않 는 상태로 나타나서 유전적인 비만 모델로 간주하여 실험 에 사용하였다.15 본 연구는 이와 같은 복부비만 모델에서 메트폴민이 음경의 eNOS를 증가시킬 수 있는지와 eNOS의 증가가 pAMPK의 증가와 관련이 있는지를 규명하고자 하 였다.
Kim 등11의 연구는 고지방식이로 유도한 비만 쥐 모델에 서 음경 NOS의 발현이 감소하였으며 4주간의 메트폴민 처 치로 회복되는 것을 관찰하였다. 그러나 장기간의 메트폴
민 투여로 인한 체중감소에 따른 효과를 배제하지 못하였 으며 NOS의 활성도를 반영하는 phospho-eNOS의 단백량을 분석하지 않은 제한점이 있었다. 본 연구에서는 메트폴민 을 단기간 사용하여 체중의 감소를 동반하지 않게 하고 메 트폴민의 농도를 150 mg과 300 mg의 두 농도를 사용하였으 며 eNOS의 발현뿐 아니라 phospho-eNOS의 단백량을 측정 하여 비만 음경에서의 NOS에 대한 메트폴민의 효과를 분 석하였다. 또한 고지방식이 비만쥐처럼 후천적인 비만 모 델뿐 아니라 OLETF 쥐처럼 유전적인 소인을 가진 비만 모 델에도 메트폴민이 효과를 나타내는지를 관찰한 점이 본 연구의 의의로 생각한다.
본 연구의 결과는 OLETF 쥐에서 메트폴민 투여가 대조조 직으로 사용한 가자미근 뿐만 아니라 음경에서도 pAMPK의 농도를 증가시키는 것으로 나타났다. 이는 본 연구에 사용 한 메트폴민의 피하 주사가 효과가 있음을 의미하는 것이 다. 메트폴민은 골격근과 간에 작용하여 AMPK를 인산화 시킴으로써 활성화시켜 다음 단계의 대사과정을 이끌어가 는 것으로 잘 알려져 있다.16 또한 증가된 pAMPK는 eNOS 를 활성화 시킬 수 있음이 알려져 있는데,17 음경에서의 pAMPK와 eNOS의 발현에 관여하는지는 Kim 등11이 처음 으로 규명하였다. 그러나 본 연구에서는 pAMPK의 증가가 eNOS mRNA의 발현 뿐 아니라 phospho-eNOS 단백량의 증 가로도 이어짐을 확인하였다. Phospho-eNOS는 eNOS의 활 성화된 상태로 eNOS의 활성도를 나타내는 지표로 사용되 고 있음으로 phospho-eNOS의 증가는 NO의 증가를 의미하 는 것으로,18 실제로 발기능을 측정하지는 못하였지만 비만 으로 인한 발기부전을 개선시켜 줄 수 있을 것으로 생각한다.
그러나 메트폴민 처치에 의한 eNOS mRNA 발현과 phospho- eNOS 단백량의 증가와는 달리 음경의 eNOS 단백량 자체는 변화하지 않았는데, 이러한 실험결과의 상이점은 추후 연구 가 되어야 할 부분으로 생각한다.
메트폴민의 AMPK 활성화 기전은 아직 잘 알려져 있지 않 아서, 본 연구에서는 메트폴민의 AMPK를 활성화과정과 대 사적 신호전달의 초기 단계에서 활성화되는 물질인 STAT3 와의 관계를 분석하고자 가자미근에서 STAT3와 pAMPK를 측정하였다. 그러나 메트폴민 처치는 pAMPK을 증가시킴에 도 불구하고 pSTAT3는 유의한 변화를 나타내지 못하여 메 트폴민의 효과와 관련하여서는 AMPK와 STAT3가 서로 상 관이 없는 것으로 생각한다. 시상하부에서도 렙틴과 인슐 린이 STAT3와 AMPK 모두를 통하여 신호를 전달하고 있으
나,19,20 STAT3와 AMPK가 직접 관련되어 있다는 증거는 제
시되지 않은 점과, 골격근에서도 STAT3와 AMPK가 서로 관련이 되지 않는다는 결과와도 일치하는 것이다.21 여러 연구에서 비만쥐의 근육 세포 내 AMPK가 감소할
뿐 아니라,22 혈관내피세포의 기능부전이 나타나고 메트폴 민이 혈관내피세포에서 AMPK를 증가시켰다고 보고되고
있으며,23,24 α-리포산 역시 AMPK를 활성화시켜서 혈관 내
피세포부전을 방지하는 것으로 보고되고 있다.25 따라서 위 의 연구들과 Kim 등11의 연구결과 및 본 연구결과를 종합하 면 비만에서 발생하는 발기부전은 비만에 의한 NOS 발현감소 로 인한 음경내피세포의 기능부조화 (endothelial dysfunction)와 관련이 있는데, 이때 메트폴민이 AMPK 활성화를 통하여 eNOS를 활성화 시켜서 음경의 발기에 관여할 수 있음을 유 추할 수 있겠다. 따라서 개발된 지 50년 이상 되었으나 아직 당뇨병환자에 많이 처방되는 약물로 안전성이 입증되어 있 는 메트폴민이 이러한 연구결과를 바탕으로 하여 비만과 관련된 발기부전에 적용될 수 있기를 기대한다. 그러나 임 상적용을 위하여 실제 발기능과의 관련에 관한 연구가 뒷 받침이 되어야 할 것으로 생각한다.
결 론
메트폴민의 음경 eNOS 활성화는 메트폴민이 OLETF쥐 에서도 eNOS mRNA의 발현을 증가시킴을 의미하고, 여러 가지 비만 모델에 공통적으로 작용할 수 있음을 의미한다.
추후 임상적용을 위하여 직접적인 발기력 분석 연구가 필 요할 것으로 생각한다.
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