접수일：2010년 11월 29일, 수정일：2010년 12월 12일, 승인일：2010년 12월 15일
책임저자：임 채 승 152-703 서울시 구로구 구로동길 97번지 고려대학교 의과대학 진단검사의학교실
한국인 cis-AB 혈액형의 Intron 6 유전자 염기서열의 특성
김하늬ㆍ이혜진ㆍ최계령ㆍ김명한ㆍ김장수ㆍ임채승ㆍ김영기ㆍ이갑노
고려대학교 의과대학 진단검사의학교실
= Abstract =
Characteristics of Intron 6 Nucleotide Sequences of cis-AB in Koreans
Ha-Nui Kim, Hye-Jin Lee, Gye-Ryung Choi, Myung-Han Kim, Jang-Su Kim, Chae-Seung Lim, Young-Kee Kim, Kap-No Lee
Department of Laboratory Medicine, School of Medicine, Korea University, Seoul, Korea
Backgound: The cis-AB is a very rare phenotype in the ABO blood group system. It corresponds to a special ABO allele that encodes glycosyltransferase that is capable of synthesizing both A and B antigens. Until now, the exon 6 and 7 gene sequences of cis-AB alleles are well known. In this study, we report on the intron 6 sequence structure of the cis-AB allele.
Methods: Standard serologic tests for the ABO blood group phenotypes were performed in four cis-AB samples.
Allele-separation by cloning and subsequent sequencing was carried out.
Results: The results showed that intron 6 of cis-AB is almost identical to the A101 allele except for three single nucleotide polymorphisms at nucleotide positions 163, 179 and 662, where the nucleotides of the A101 replace those of B101.
Conclusion: The intron 6 sequences of cis-AB in Koreans have both A101 and B101 blood group sequences.
(Korean J Blood Transfus 2010;21:230-5)
Key words: cis-AB, Blood typing, ABO blood group, Glycosyltransferase, Intron 6
서 론
A, B형 당전이효소를 발현하는 ABO 혈액형 유전자는 9번 염색체 장완 9q34에 위치하며 18∼
20 킬로 베이스의 크기를 보이며 7개의 exon으로 이루어져 있다.
1)ABO cDNA는 1,062개의 염기로
구성되어 있으며 354개의 아미노산을 코딩하는
것으로 밝혀져 있다.
1,2)ABO 유전자의 7개 exon
중 exon 6과 7이 전체 exon 염기의 77.5%를 차지
하고 있다. A형과 B형 대립유전자의 cDNA를 비
교해 보면 297번, 526번, 657번, 703번, 796번, 803
번 그리고 930번의 7개의 염기를 제외하고는 염
Table 1.
Primers used for ABO transferase gene amplification16)Name Primer Reference gene Position
ABOint5’dr TGATTTGCCCGGTTGGAGTCGC AY268591 19940-19960 ABOint61055dir GCTCACTGACCAGAGATAGC AY268591 20589-20608
ABOEx7dir GCCTTGCAGATACGTGGCTTTC AY268591 21301-21326
ABOEx7R-rev CCAGAGCCCCTGGCAGCCGCTC AY268591 22022-22000
ABOF63 CAGAAGCTGAGTGGAGTTTC AY268591 20020-20045
ABOR1445 CTGGTCGGTGAAGACATAGT AY268591 21390-21400
ABOF910 CTCTTAGGAATAGGTGCGG AY268591 20870-20895
ABOR1910 CGCAGTAGGTACTTGTTCAG AY268591 21860-21870
GA 16 AGAAGCTGAGTGGAGTTCCAGGTG AY268591 20020-20045
ABO-R TCACGGGTTCCGGACCGCCTGG AY268591 21990-22000
기서열이 모두 같다. 이들 7개의 염기 변화 중 아 미노산의 변화를 유발하는 것은 C526G (Arg/Gly), G703A (Gly/Ser), C796A (Leu/Met), G803C (Gly/Ala)의 네 개이다. 이 중 796번과 803번의 염 기 변화가 당전이효소의 기질 특이성에 중요한 것으로 밝혀져 있다.
1-3)따라서 ABO 혈액형의 분자생물학적인 특성은 exon 7의 cDNA 526, 703, 796, 803의 차이에 따라 결정되며, 한국인과 일본인에서 발견된 cis-AB 혈액형의 경우 네번째 염기서열이 B형의 구조를 보이고 나머지 셋은 A형의 서열을 갖는다.
4)국내에서 ABO 혈액형 아형에 대한 분자유전 학적 분석이 활발하다. 정상적인 ABO형과 cis- AB형에 대해서는 다수의 연구가 있고,
5)ABO 유 전자형 분석 후 exon 6과 7에 대한 염기서열에 대 한 연구는 있으나 intron구조의 유전자 분석에 대 해서는 국내에 이에 대한 자료가 거의 없어, 본 연구에서는 아직 잘 알려지지 않은 inton 6에서
cis-AB의 유전적 특성을 규명하고자 하였다. 염기서열분석을 통해 기존에 알려진 cis-AB혈액형 의 intron 6 부위의 ABO 혈액형 유전자의 다형성 을 살펴보고자 시행하였다.
대상 및 방법
연구대상은 2006년부터 2007년까지 고려대학 교 안산병원과 고려대학교 의료원에 내원한 환자 중 ABO 혈액형 검사에서 cis-AB 혈액형이 의심 되는 4명의 혈액을 대상으로 분석하였다. 이들은 모두 비혈연자로 ABO 혈액형 혈청학적검사는 슬라이드 및 튜브법으로 시행되었으며, 모든 검 체에 대해서는 BioRad사의 ABO 젤 카드법이 추 가적으로 시행되었다. 항 혈청학적 검사만으로 아형 판정이 어려웠던 일부 환자에 대해서는 항 -H 렉틴검사, 흡착해리시험, 혈청 중의 B형 물질 검사, 타액 검사, 혈청 A 및 B 당전이효소검사 활 성도 측정을 활용하였다. 혈액형 아형의 분류는 Yamaguchi 등의 분류를 참고하였다.
6)1. ABO 유전자의 분자유전학적 분석
채혈된 전혈로부터 DNA 추출 키트(InstaGeneTM
Matrix)를 이용하여 DNA를 추출한 뒤 분석 시까
지 −70℃에 보관하였다. Cis-AB 혈액형 핵산 검
체에 대해 ABO 유전자의 exon 6과 intron 6, exon
7를 모두 포함하는 부위의 PCR 시발체(primer)를
사용하여(Table 1, Fig 1), PCR 반응액은 10 pmol
Fig. 1. PCR strategy for analysis ABO alleles, including the cis-AB allele on genomic DNA.
Fig. 2. Intron 6 nucleotide polymorphisms of cis-AB of Korean.
의 forward primer와 reverse primer (Bioneer Cor- poration, Daejeon, Korea), 5 μL의 10×Taq PCR buffer (Promega, Madison, WI, USA), 2.5 U Taq DNA polymerase (Promega, Madison, WI, USA)를 포함하여 최종 20 μL 반응으로 시행하였다.
PCR은 두 반응 모두 초기 denaturation 95
oC, 5분 후 denaturation (95
oC, 20초), annealing (60
oC, 20 초), extension (72
oC, 20초)을 30 cycle을 시행하고 최종 extension으로 72
oC, 5분의 조건으로 GeneAmp PCR system 9600 (Perkin Elmer, 미국)에서 중합 효소반응을 시행, ABO 아형 유전자를 증폭하였다.
반응산물의 검출 및 확인은 중합 연쇄반응의 반 응 산물 10 μL를 2% agarose gel에 전기영동 시 킨 뒤 ethidium bromide로 염색하여 예상 size에서 보이는 DNA 분획을 확인한다. PCR 반응산물을 1.2% agarose gel에 전기영동하여 확인하고, QIAEXII gel extraction kit를 사용하여 agarose gel 로부터 추출한 뒤 Topo pCR2.1 TA cloning kit (Invitogen, 미국)을 이용하여 cloning을 시행한다.
Cloning 시행 후 플라스미드 정제를 실시하여 se- quencing용 plasmid를 유전자별로 확보하였다.
증폭된 DNA의 염기서열 결정은 ABI PRISMTM
Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction
Kit (Perkin Elmer)를 사용하여 반응액 20 μL당
Terminator Ready Reaction Mix 8 μL, 1 μM primer
3.2 μL와 30∼100 ng template을 첨가하고 mineral
oil을 가하여 thermal cycler로 25회 주기로 증폭하
였다. 증폭에 사용하는 주기는 96
oC 30초, 50
oC
15초, 60
oC 4분이며 첫번째 주기는 96
oC 5분을 사
용하고, 증폭 종료 후에는 위 반응액을 3M So- dium acetate (pH4.6) 2 μL, 95% ethanol 50 μL와 혼합하여 얼음위에 10분간 방치한뒤 11,000 rpm 에서 20분간 원심분리하고 침전물을 70% ethanol 250 μL 로 세척한 후 진공건조 시킨 뒤 6 μL loading buffer (deionized formamide 5 μL, 25 mM EDTA (pH8.0) containing 50 mg/mL blue dextran 1μL)에 용해하였다. Loading 직전에 90
oC에서 2분간 변 성시킨 후 1.5 μL씩 4% polyacrylamide sequencing gel에서 3,000 V로 전기영동하고 ABI PRISMTM377 DNA Sequencer로 염기서열 결과를 판독하였다.
결과는 위 반응에서 얻어진 cis-AB 유전자의 염 기서열을 Proseqv 2.0 program을 이용하여 염기서 열을 align한 후 분석하였다.
결 과
4명의 cis-AB 환자로부터 총 2,088 bp 크기의 유전자 염기서열을 얻었으며 exon 6, 7 부위 염기 서열은 과거에 보고된 cis-AB 염기서열과 일치하 였다(Fig. 2). Intron 6 부위 31개 중에서 240 b 중 163, 179, 662의 3개 부위는 B101을 보이는 single nucleotide polymorphism이 네 환자에서 모두 나타 났으며 그 외 나머지 28개의 부위는 A101형 유전 자 서열을 따르는 것으로 확인되었다(Fig. 2).
고 찰
현재까지 전세계적으로 약 100여 개의 ABO 혈 액형 아형 대립 유전자가 밝혀져 있고, 국내 ABO 혈액형 아형에 대한 정확한 빈도 조사는 아직 없 지만 전체조사대상 중에서 혈액형 변이형이 0.009%
라는 보고가 있었다.
7)광주혈액원 헌혈자 혈액 204,273건 중 ABO 아형이 109예로 그 빈도가 0.009∼0.053%로 보고되었는데, 전라도라는 지역
적 특성을 감안하였을 때 cis-AB형으로 추정되는 A
2B
3가 이 중 81예라고 한다.
8)최근 ABO 유전자의 염기서열 분석도 이루어 짐에 따라 ABO혈액형의 발생기전에 대한 추정 이 가능하게 되었다.
1-11)A1과 B 유전자 간에는 7 곳에서의 염기서열 차이가 있으며 이 중 4곳(526, 703, 796, 803번)의 차이로 인해 아미노산의 차이 가 생기게 되고, 결과적으로 합성된 A 또는 B 당 전이효소의 기질 특이성을 나타내게 되는데 이 중에서도 마지막 796번과 803번의 차이가 가장 중요하다.
1-7,9)한국인과 한국인 cis-AB형 분석에 서는 exon 7의 cDNA 526, 703, 796, 803의 차이에 따라 혈액형이 결정되며, 한국인과 일본인에서 발견된 cis-AB 혈액형의 경우 네번째 염기서열이 B형의 구조를 보이고 나머지 셋은 A형의 서열을 갖는다.
9)최근에는 베트남인에서 526, 703, 796번 염기는 B 유전자와 동일한 염기서열을, 803번 염기는 A 유전자와 동일한 염기서열을 가지면서 표현형은
cis-AB 형으로 나타난 보고가 있었는데,7)이는
cis-AB 형의 발생에 796번과 803번 유전자가 중요하다는 가설을 뒷받침해주고 있다. 국내에서도 한국인 특성에 맞는 ABO 유전형검사가 개발되 어 ABO 아형의 확진 및 ABO 불일치의 해결 등 에 활용되고 있는데,
12-14)새로운 ABO 대립유전 자(allele)가 최근까지도 보고되고 있어, ABO 유 전형 검사의 결과 해석에 주의가 필요하다.
10)현 재까지 보고된 cis-AB는 cis-AB01에서 cis-AB06 이다.
15)본 연구에서는 기존에 연구가 집중된 exon 7
뿐 아니라 intron 6 부위에서 유전자 염기 서열 분
석을 시행하였고 그 결과 cis-AB 형에서는 A형과
B형의 차이를 보이는 31개의 염기서열 변위 위치
중 3개는 B형을, 28개는 A형 유전자 서열을 따르는
것이 확인되었다. 이는 exon 7뿐 아니라 intron 6
에서도 cis-AB 형은 A와 B 유전자의 재조합의 특 성을 갖는다는 것을 의미하며 이를 기초로 cis- AB 혈액형의 유전자 검사에 활용 가능성이 있을 것으로 생각된다.
요 약
배경: Cis-AB 혈액형은 ABO 혈액형군에서 희 귀한 표현형으로 이는 A와 B형 항원을 모두 합성 할 수 있는 당전이효소를 부호화하는 특이 ABO 염색체의 존재로 인해 발생한다. Cis-AB 염색체 exon 6과 7에 대한 염기서열에 대해서는 잘 알려 져 있으며, 본 연구에서는 아직 잘 알려지지 않은 intron 6에서의 cis-AB의 유전적 특성을 규명하고 자 하였다.
방법: ABO 혈액형 검사에서 cis-AB 혈액형이 의심되는 4명의 혈액을 대상으로 표준화된 혈청 학적인 검사를 시행하였다. ABO 유전자의 분자 유전학적 분석을 위해 ABO 대립유전자 분리 및 염기서열분석을 시행하였다.
결과: Cis-AB에서의 intron 6의 31개 부위 중 163, 179, 662의 3개 부위는 B101을 보이는 single nucleotide polymorphism이 발견되었으며 나머지 28개의 부위는 A101형 유전자 서열을 보였다.
결론: 한국인에서의 cis-AB의 intron 6 염기서열 에는 A101과 B101 모두가 존재하는 것으로 확인 되었다.
참고문헌
