규칙적인 저항성 운동이 IGF-1과 UCP-3 mRNA 발현에 미치는 영향
한양대학교 체육대학
오승렬ㆍ황인근ㆍ오상덕
Effects of Regular Resistance Exercise on IGF-1 and UCP-3 mRNA Expression in the Rats
Seung Lyul Oh, Ph.D., In Geun Hwang, Sang Duk Oh, Ph.D.
Department of Physical Education, Hanyang University, Seoul, Korea
This research is about the effect of 4 weeks’ resistive exercise on IGF-1 and UCP-3, where they are known for major muscle effecting genes and having effects on tissue growth & development, and body metabolism. Twenty-four male Sprague-Dawley rats were included at 10 wks of age and assigned into control group (CG) and resistance exercise group (EG). After 4-weeks of resistance exercise, the total RNA of each group was separated. And qPCR was used to analyze RNA quantitatively. After 4-weeks of regulated resistance exercise, there was statistical difference in IGF-1 and UCP-3 mRNA expression (p<0.001) in skeleton muscles between the control group and the resistance exercise group. At post-hoc, EG had significantly higher IGF-1 and UCP-3 mRNA expression than CG (p<0.01; p<0.001) and the 4th week CG (p<0.001; p<0.001). In conclusion, the resistance exercise increased IGF-1 mRNA expression in the skeleton muscle, and after the experiment there was significant increase in UCP-3 mRNA expression as well.
Key Words: Resistance exercise, Gene expression, IGF-1, UCP-3
접수: 2009년 8월 30일 승인: 2009년 11월 30일 책임저자: 오 상 덕
133-791, 서울특별시 성동구 행당동 17번지 한양대학교 체육대학
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서 론
저항성 운동은 많은 운동단위를 동원시킬 수 있어 근세포의 성장 및 근력 발달을 촉진시킨다. 특히 성장 호르몬의 분비를 자극함으로써 호르몬의 분비 빈도와 분비량을 증가시키며
1-3),
운동프로그램과 피험자의 연령 등
4-6)에 따라 다른 결과를 나타 내게 되는 것으로 보고되었다. 또한 저항성 운동은 선수들의 컨디션, 재활 그리고 일반적인 체력 프로그램의 주된 훈련 방법으로 사용되어 왔으며
7), 최근에는 일반인들의 건강과 노인들의 근력 향상을 위해서 사용되고 있다.
Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1)은 7.5 kDa의 분자량을
가진 70개의 아미노산으로 구성된 단사슬 폴리펩티드로 인슐
린 전구물(proinsulin)과 유사한 아미노산 서열을 가지고 있으
며, 조직의 성장(세포증식, 세포분화 및 근육량, 연골과 뼈의
성장)과 대사를 조절하는 중요한 역할을 수행하며, 성장 호르
몬에 의해서 조절받는다
8). 또한 태아의 성장과 발달에도 중요
한 역할을 하며, 골수 조혈에 조절작용을 하는데, 신체의 성장 으로 일어나는 적혈구의 동반증가는 성장 호르몬과 IGF-1의 작용으로 일어난다
9). 이윤서 등
10)은 24주간의 저항성 운동이 IGF-1의 유의한 증가를 야기한다고 보고하였으며, 강성훈과 여남회
11)는 근 저항운동의 다른 형태로서 12주간의 신장반사 를 통한 연구에서 IGF-1의 증가를 보고하였고, Fan et al.
12)은 장기간 저항성 운동은 성장 호르몬의 분비를 증가시키고 IGF- 1의 분비를 촉진하게 되며, 운동에 따른 근수축이 활발하게 이루어져 골격근의 성장 및 비대를 유발하는 것으로 보고하였 다. 또한 단기간의 저항성 운동에서도 IGF-1이 유의하게 증가 한다는 보고가 있다
13,14). 그러나 이와 반대로 단기간 저항성 운동 시 IGF-1 수준에 변화가 없었다는 Kraemer
15)의 보고가 있었 으며, Cappon et al.
16)과 Hellenius et al.
17)도 운동자극이 IGF-1 수준을 조절하는 것은 아니라고 제시하였다. 또한 Raastad et al.
18)도 고강도와 중강도의 저항 운동 모두에서 IGF-1 농도가 감소하는 경향은 보였으나, 유의한 발현의 차이는 없었다고 보고하였다. 이와 같은 선행 연구들을 종합해 보면, 장기간의 저항성 운동은 IGF-1의 증가를 유도하는 것으로 나타났지만, 단기간의 운동에서는 다른 연구결과를 보이고 있다. 또한 선행 연구들 대부분은 채혈을 통한 방사면역측정법(RIA; radioim- munoassay)으로 IGF-1을 분석하였다.
한편 Uncoupling Protein (UCP)은 갈색지방의 미토콘드리아 내막에 존재하여 열 생성을 증가시키고 미토콘드리아의 양성 자 누출에 대해 적절한 세포 내 ATP를 유지하는데 중요한 역할을 한다. 이들 UCP는 3가지 아형으로 발현되는데, UCP-1은 갈색 지방세포에 특이적인 반면, UCP-2는 대부분의 세포에서 발현 되고 UCP-3는 주로 갈색지방과 골격근에서 발현되는 것으로 알려져 있다
19,20). UCP-3 유전자는 6개의 exon과 5개의 intron으 로 구성되어 있으며, 에너지 생산 조절에 있어서 중요한 역할을 수행하기 때문에
20), 식이와 운동에 의한 유전자 발현의 변화 양상이 관측되어 많은 연구자들의 주목을 받아왔다
21). 윤혜연 등
22)은 일회성의 트레드밀 운동은 운동 중 UCP-3 mRNA 발현을 저하시키지만, 운동직후 1시간 후에는 10배 정도 상승하며, 이러한 효과는 6시간까지 지속된다고 보고하였다. Cortright et al.
23)은 쥐를 대상으로 2시간의 달리기 운동을 실시한 결과 휴식 1시간 시점에서 UCP-3 mRNA 발현량이 증가된 것을 보고 하였고, Schrauwen et al.
24)은 20대 남성을 대상으로 2시간의 에르고미터 운동을 실시한 결과 휴식 4시간 시점에서 UCP-3
mRNA 발현량이 최대치를 보였다고 보고하였다. 그리고 Gong et al.
25)은 UCP-3 mRNA가 48시간 금식 시 발현이 증가되었고, 그 이유는 금식으로 인해 순환 유리 지방산이 증가하였기 때문이라고 보고하였다. 반면에 Boss et al.
26)은 쥐를 대상으로 8주간의 지구성 운동을 시킨 결과 UCP-3 mRNA의 발현이 감소되었다고 보고하였다. 이러한 UCP-3 mRNA 발현의 감소 는 반복적인 장기간 운동수행에 따른 근조직의 대사적 효율성 증가에 의해 발생되었다고 하였다. 이와 같이 UCP-3 관련 선행 연구들은 운동기간과 운동 형태에 따라 다른 양상을 보이는 것으로 나타났으며, 대부분의 연구들은 지구성 운동에서의 UCP-3 mRNA 발현 변화를 분석하였다.
따라서 본 연구는 흰쥐를 대상으로 4주간의 규칙적인 저항성 사다리 운동을 실시한 후 조직의 성장과 대사에 중요한 역할을 하는 IGF-1과 에너지 생성과 소비 조절에 관여하는 UCP-3 mRNA 발현의 변화를 규명하고자 한다.
대상 및 방법
1. 대 상
본 연구에서의 실험동물은 10주령 된 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐 24두를 사용하였다(Samtako, INC.). 실험동물은 통 제 집단(control group; CG) 16두와 저항성 운동 집단(exercise group; EG) 8두로 임의 배정하였으며, 모든 실험동물은 일주일 동안 식이 및 동물 실험실 환경 적응기간을 가진 후, 11주령에 노화 통제 집단은 식이 및 동물 실험실 환경 적응기간을, 저항 성 운동 집단은 운동 적응 기간을 추가로 일주일씩 더 가졌다.
실험동물은 스틸 게이지를 이용하여 3마리씩 사육하였으며, 사육실의 온도는 22±1℃, 습도는 상대습도의 50±2%로 일정하 도록 조절하였고, 12시간(08:00-20:00)을 주기로 명암을 조절 하였다. 선정된 실험동물은 실험기간 동안 시판되는 고형사료 (단백질 22.5%, 지방 3.5%, 저섬유 7.0%, 회분 9.0%, 칼슘 0.7%, 인 0.5%; 삼양사)와 고압 증기로 멸균한 물을 충분히 공급하였다.
2. 저항성 운동방법
본 실험은 동일한 시간대에 저항성 운동인 사다리 운동을
자체 제작한 쥐 전용 사다리(100×12 cm, 2 cm grid, 85° incline)
를 이용하여 실시하였다. 저항성 운동 방법은 사다리 운동
Table 1. Primer sequences for amplification of qPCR
Gene Forward primer sequences Reverse primer sequences Product size(bp)
GAPDH gggtgtgaaccacgagaaat atggcatggactgtggtcat 146
IGF-1 aagcctacaaagtcagctcg ggtcttgtttcctgcacttc 114
UCP-3 accctgttttggttgcaaag gagtccatcctgtccttcca 176
방법
27-32)을 변형하여 사용하였다. 첫 일주일은 운동 적응 기간
으로 동일 시간대에 저항 없이 사다리를 오르는 훈련에 적응시 킨 다음, 부하를 달고 사다리를 오르는 운동을 주당 3일, 1일 10회씩 점진적인 과부하 하에서 저항성 운동을 실시하였으며, 모든 운동은 최대 12회를 넘기지 않도록 통제하였다. 저항성 운동 부하는 최대중량의 50%(최초 체중의 50%)부터 시작하여 매회 마다 처음 지정된 무게에서 15%씩 부하를 증가시켰으며, 반복 간 2분간의 휴식 시간을 가졌다.
3. 측정항목 및 분석방법 1) 시료채취
실험 시료로써의 조직 채취는 운동 전과 운동 4주 후에 실시하였으며, 저항성 운동과 고형사료는 조직 채취 하루 전에 모두 중단하고 물만 공급하였다. 조직 채취는 동물용 마취제인 Zoletil (50 mg/㎏)과 Rompun (5-10 mg/kg)을 5:1의 비율로 혼합 하여 복강 내 주입시켜 마취시킨 후 사다리 운동에서 주동근
27-30)
으로 작용하는 장무지굴근(flexor hallucis longus; FHL)의 양측 동일한 부위를 적출하였다.
2) Total RNA 분리
적출한 골격근을 최대한 빠른 시간에 액화질소(liquid nitro- gen)로 동결시킨 후 BioPulverizer (Biospec 59013N, U.S.A.)를 이용하여 최대한 분쇄 시켰다. 조직 50-100 mg 당 1 ㎖의 Tri Reagent (Molecular Research Center, Inc)를 첨가하여 inverting 한 후 1 ㎖씩 소형원심분리 튜브(microcentifuge tube)에 분주 하고 상온에서 5분간 방치하여 균질화 시켰다. RNA 추출 (extraction)을 위해 200 ㎕의 chloroform (Sigma)을 첨가하여 15초간 고루 섞어 준 후 상온에서 5분간 방치한 다음 원심분리 (4℃, 12,000×g, 15 min) 한 후 상층액을 새로운 소형원심 분리 튜브에 옮겼다. RNA 침전(precipitation)을 위해 분리한
상층액에 동량(약 500 ㎕)의 isopropanol (Sigma)을 첨가한 후 고르게 섞어 상온에서 10분간 방치한 다음 원심분리(4℃, 12,000×g, 15 min) 하였다. 다음은 RNA 세척(wash) 단계로 75% ethanol 1㎖를 첨가하여 원심분리(4℃, 7,500×g, 5 min) 하였다. 끝으로 상층액을 버린 후 상온에서 5분간 pellet을 건조시키고, 여기에 Nuclease- free water 30 ㎕를 첨가하여 55-60℃에서 10분간 incubate를 통해 용해시킨 후 Spectropho- tometer (NanoDrop, U.S.A.)를 이용하여 260 ㎚와 280 ㎚의 파 장에서 흡광도(absorbance; A)와 정제도(purity)를 측정하였 다. 또한 2% agarose gel를 이용해서 전기영동을 실시하고, UV transilluminator (Bio Rad, U.S.A.)를 통해서 total RNA의 quality를 측정하였다. 또한 보다 양질의 total RNA를 얻기 위해 RNeasy Mini Kit (Quiagen)을 이용해서 Clean-up을 실시 하였으며, 정제된 total RNA는 BeadChip 분석과 qPCR에 쓰일 때까지 -70℃에 냉동 보관하였다.
3) Real-time quantitative PCR (qPCR)
RNA를 정량 분석하기 위하여 SYBR Green을 이용한 qPCR 을 실시하였다. qPCR에 사용되는 각 유전자의 최적의 primer set는 하버드 대학의 primerBank에서 탐색하여 합성하였으며, 합성한 primer set와 cDNA 샘플을 SYBR Geen supermix와 혼합하여 iCycler를 이용하여 qPCR을 실시하고 정량 분석하였 다. qPCR data는 housekeeping gene 인 Gapdh와 비교한 상대적 인 수치(dCt=gene-Gapdh)를 이용하여 normalization한 Gapdh 대비 상대적인 유전자 발현의 비율(2ndCt)을 의미한다.
구체적인 qPCR 방법은 iQ SYBR Green Supermix (Bio Rad, U.S.A.)를 이용하여 total volume이 50 ㎕ (iQ SYBR Green Super- mix, Primer 1, Primer 2, Sterile water, DNA template)가 되게 만들었다. 또한 qPCR 반응 조건은 denaturation (95℃, 40s), annealing (58℃, 40s), extension (70℃, 40s)으로 실시하였다.
qPCR을 실시한 유전자의 primer sequence는 Table 1과 같다.
Fig. 1. Expression of IGF-1 mRNA. Fig. 2. Expression of UCP-3 mRNA.
Table 2. Expression of IGF-1 and UCP-3 mRNA
Gene CG† Pre exercise CG† Post 4wks EG‡ Post 4wks F-value IGF-1 0.0094±0.00034 0.0083±0.00026 0.0124±0.00223 20.719***
UCP-3 0.0308±0.00160 0.0504±0.00516 0.1151±0.02071 101.994***
Value are Mean±SD, ***Significant at p<0.001, †CG: Control Group, ‡EG: Exercise Group
4. 자료처리
모든 측정치에 대한 평균(M)과 표준편차(SD)를 산출하였 으며, 저항성 운동에 따른 운동 전과 운동 4주 후에서의 IGF-1, UCP-3 유전자 발현 변화에 대한 유의성 검증은 일원변량분석 (one-way ANOVA)을 적용하였다. 사후검증(post-hoc.)은 Scheffe 검정법으로 하였으며, 이상 결과 자료에 대한 통계치 검증은 SPSS 15.0 for Windows 프로그램을 이용하였고, 모든 통계치의 유의수준은 p<0.05로 설정하였다.
결 과
1. IGF-1와 UCP-3 mRNA 발현 변화
4주간 규칙적인 저항성 사다리 운동을 실시한 후 통제집단 과 저항성 집단에서의 IGF-1과 UCP-3 mRNA 발현량을 살펴본 결과 Table 2, Fig. 1, 2와 같이 나타났다.
통제 집단에서의 IGF-1의 상대적인 발현량은 운동 전 0.0094
±0.00199, 4주 후 0.0083±0.00026로 나타났으며, 운동집단에서 는 운동 4주 후 0.0124±0.00223로 나타났다. 집단 간 IGF-1의 상대적인 발현량에서 유의한 차이가 나타났다(p<0.001). 이에 대한 사후검증(post-hoc) 결과, 통제집단 운동 전과 저항성
운동 집단 4주차(p<0.01)에서, 통제집단 4주차와 저항성 운동 집단 4주차(p<.001)에서 의미 있는 차이가 나타났다(Fig. 1).
그리고 통제집단에서의 UCP-3의 상대적인 발현량은 운동 전 0.0308±0.00160, 4주 후 0.0504±0.00516로 나타났으며, 운동 집단에서는 운동 4주 후 0.1151±0.02071로 나타났다. 집단 간 UCP-3의 상대적인 발현량에서 유의한 차이가 나타났다(p
<0.001). 이에 대한 사후검증(post-hoc) 결과, 통제집단 운동 전과 통제집단 4주차(p<0.05)에서, 통제집단 운동 전과 저항성 운동 집단 4주차(p<.001)에서, 통제집단 4주차와 저항성 운동 집단 4주차(p<0.001)에서 의미 있는 차이가 나타났다(Fig. 2).
고 찰
IGF-1은 근육 조직에 강한 동화 작용을 갖고 있으며, 근육
조직을 강화 시켜주며, 단백질 합성을 촉진시키고 지방 산화를
통해 에너지를 공급한다
33). 또한 IGF-1은 골격근 섬유의 증식
및 분화양상 전반에 관여하는 것으로 알려져 있으며
34), 근아세
포(myoblast)의 apoptosis를 억제할 뿐만 아니라, 이의 증식
및 근관(myotube)으로의 분화와 비대를 촉진하여 골격근 비대
에 중요한 영향을 미치는 것으로 알려졌다
35). Adams and
Haddad
36)는 IGF-1가 근세포에 근비대의 반응을 촉진하며, 근
비대가 일어나는 근육 조직에서 증가된 IGF-1 농도를 보고하 였다. 또한 일반적으로 장기간의 저항성 운동은 IGF-1의 합성 을 촉진시키며, 운동에 따른 근수축 운동이 활발하게 이루어져 골격근의 성장 및 비대를 유발한다
12). 소재무와 서진희
37)는 8주간의 저항성 운동 후 IGF-1의 농도가 증가하는 양상을 확인하였으며, 이윤서 등
10)도 24주간의 저항성 운동에 의한 IGF-1의 농도변화 양상을 분석한 결과 IGF-1의 증가를 보고하 였다. 그리고 Heinemeier et al.
38)도 쥐를 대상으로 저항성 운동 을 실시한 결과 IGF-1 mRNA 발현이 증가하였음을 보고하였 다. 4주간의 저항성 운동을 실시한 본 연구에서도 장기간 또는 단발적인 저항성 운동에서 나타난 결과와 같이 IGF-1 mRNA가 증가하는 경향을 나타내었다. 뿐만 아니라 동일 연령대에서도 운동 집단이 비운동 집단 보다 IGF-1 mRNA 발현이 유의하게 높은 것으로 나타났다. 이는 4주간의 저항성 운동이 골격근의 성장 인자를 자극하여 이에 따른 IGF-1 mRNA 발현을 야기한 것으로 사료되며, 저항성 운동은 IGF-1 mRNA 전사의 증가를 통해서 IGF-1 단백질의 생합성을 증가시켜 이로 인해 근섬유 의 비대 및 증식을 통한 신체조성의 유익한 변화를 초래할 수 있을 것으로 사료된다.
한편 골격근에서 UCP-3 유전자의 발현에 미치는 운동의 효과에 관한 여러 연구 결과가 보고되었는데, 윤혜연 등
22)은 일회성 트레드밀 운동이 골격근의 UCP-3 mRNA 발현에 미치 는 영향을 조사한 결과, 운동직후 발현량이 감소하다가 회복 후 1시간에 최대 감소폭을 나타낸 후 24시간 후에야 정상 수준을 회복한 것으로 나타났다고 보고하였다. 이와 유사한 결과는 쥐를 이용한 실험에서도 역시 관찰되었는데, 양대승 등
39)은 12주간 지구성 운동 후 골격근에서 mRNA 변화 양상을 분석한 결과 UCP-3 mRNA의 약간의 감소를 보고하였으며, 권태동 등
40)은 운동부하에 따른 골격근 내 UCP-3 단백질 발현 양상을 분석한 결과, 저강도 유산소 운동에서는 유의한 변화가 나타나 지 않았지만, 고강도 유산소 운동에서는 단백질 발현이 유의하 게 감소된 것으로 나타났다고 보고하였다. 이러한 결과들은 지구성 운동에 필요한 골격근의 적응전략으로 ATP의 낭비를 줄여 효율적인 근 수축을 위한 기전으로 UCP-3 mRNA의 하향 조절이 이루어지는 것으로 생각된다. 하지만 이러한 UCP-3 mRNA 농도의 감소가 모든 연구에서 나타난 것은 않았으며, 본 연구 결과와 같이 오히려 mRNA 농도의 상승을 보고한 연구도 있는데, Cortright et al.
23)는 9주에 걸친 유산소 운동이
쥐 골격근에서 mRNA 농도의 증가를 보고하였고, Hildebrandt et al.
41)도 각각 저강도와 고강도의 유산소 운동을 수행한 후 UCP-3 mRNA 발현 양상을 분석한 결과 저강도 운동군의 경우 UCP-3 mRNA가 회복 후 1시간에 증가하여 24시간까지 지속되 는 반면에 고강도 운동군의 경우에는 운동 직후부터 회복 후 4시간까지 증가하는 양상을 나타내었다고 보고하였다. 이와 유사하게 본 연구 결과에서는 4주간에 걸친 저항성 운동에 의해 UCP-3 mRNA 발현의 유의한 증가가 나타났을 뿐만 아니 라, 동일 연령대에서도 저항성 운동 집단이 비운동 집단 보다 유의하게 증가하는 경향을 나타내었다. 본 연구에서 이와 같은 발현의 증가 양상을 나타낸 이유는 분명치 않으나, UCP-3 knockout mouse를 대상으로 한 실험에서 UCP-3 유전자의 결핍 이 근육에서 산화적 스트레스의 증가를 나타냈다는 보고에
비추어
42,43), 저항성 운동에 의한 산화적 근 손상의 증가가 UCP-
3 mRNA 발현의 증가를 초래했을 것으로 사료된다. 또한 최근 쥐의 근 세포주를 이용한 in vitro 연구에서 UCP-3 유전자가 핵 내 전사 조절 인자인 MRF (myogenic regulatory factor)인 myoge- nin과 myoD와 같은 전사인자에 의한 자극에 의해 mRNA 전사 가 증가 한다는 사실이 알려졌는데
44), 본 연구에서는 4주간의 저항성 운동에 의한 UCP-3 mRNA 발현의 증가는 저항성 운동 에 의한 성장과 비대가 골격근 섬유에서의 위성세포(satellite cell)의 활성을 촉진시킨 결과 위성세포의 핵 속에서 myoD나 myogenin과 같은 전사 인자가 증가된 결과에 기인한 것으로 사료된다.
이상의 결과를 종합해 보면 4주간의 규칙적인 저항성 사다 리 운동은 골격근 내 IGF-1 mRNA 발현량을 증가시키는 것으 로 나타났으며, 이에 따라 근육의 성장과 발달에 긍정적인 영향을 주는 것으로 판단된다. 또한 4주간 규칙적인 저항성 운동으로 인한 UCP-3 mRNA 발현량의 현저한 증가를 보였으 며, 이는 인체의 에너지 소비를 조절하고 조직의 성장과 발달 에 전반적으로 긍정정인 영향을 미치는 것으로 사료된다.
참 고 문 헌
