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J. Mushrooms 2018 March, 16(1):31-38 http://dx.doi.org/10.14480/JM.2018.16.1.31 Print ISSN 1738-0294, Online ISSN 2288-8853
© The Korean Society of Mushroom Science
*Corresponding author E-mail : [email protected] Tel : +82-42-821-6733 Received February 9, 2018 Revised March 22, 2018 Accepted March 22, 2018
양송이배지로부터 분리한 Pantoea rodasil 와 Burkholderia stabilis의 인산가용화능 비교
박홍신 · 염영호 · 윤민호*
충남대학교 농업생명과학대학 생물환경화학과
Comparison on phosphate solubilization ability of Pantoea rodasil and Burkholderia stabilis isolated from button
mushroom media
Hong-Sin Park, Young-Ho Yeom, and Min-Ho Yoon*
Department of Bio-Environmental Chemistry, College of Agriculture and Life sciences, Chungnam National University, Daejeon 34134, Korea
ABSTRACT: This study investigated the synergistic effect of single inoculation and co-inoculation of phosphate-solubilizing bacteria (PSB) Pantoea rodasil LH-1and Burkholderia stabilis HS-7. Phosphate-solubilizing abilities of these strains were assessed by measuring phosphorus content in culture media that were singly inoculated or co-inoculated with these strains for 7 days.
The co-inoculation of P. rodasil LH-1and B. stabilis HS-7 was found to release the highest content of soluble phosphorus (783.41 µg mL-1) into the medium, followed by single inoculation of B. stabilis HS-7B (743.90 µg mL-1) and P. rodasil LH-1 (736.59 µg mL-1). The highest pH reduction, organic acid production, and glucose consumption were also observed in the medium inoculated with both the strains, compared with that in the medium inoculated with the strain alone. Results of a plant growth promotion bioassay showed 7.7% and 15.5% higher leaf and root growth, respectively, in romaine lettuce co- inoculated with P. rodasil LH-1and B. stabilis HS-7 than those inoculated with the strain alone. However, no significant difference was observed between single inoculation and co-inoculation of these strains with respect to phosphorus release and plant growth. Although the results of the present study did remarkdly not show the synergistic effect of phosphate solubilization by co-inoculation of the PSB strains examined, these results indicate that treatment with PSB exerts a beneficial effect on crop growth.
KEYWORDS: Phosphate Solubilization, Pantoea rodasil LH-1, Burkholderia stabilis HS-7
서 론
최근 작물 재배 시 화학비료와 농약 사용의 오남용으로 인하여 토양 내의 미생물 상의 감소와 토양의 물리성이 저하되고 있다. 특히, 시설 하우스 재배지의 경우 연작에 의한 염류 집적으로 토양환경이 악화되고 병해의 다발생 으로 작물의 생산성 감소 및 품질저하 등을 초래하고 있 다(Reyes, et al, 2002; Chaiharn and Lumyong, 2009;
Khalimi, et al, 2012). 염류집적 현상은 주로 토양에 공 급된 합성 인산비료가 토양 중에 존재하는 Ca2+, Al3+ 및 Fe3+ 등의 양이온과 결합하여 불용성의 인산염 형태로 고 정화되거나 또는 유기물과 결합하여 phytin과 같은 형태 로 전환되어 작물이 이용하지 못하고 토양에 축적되거나 용탈에 의해 수질을 오염시키는 주원인이 되고 있다(EI-
Yazeid and Abou-Aly, 2011, Lee et al, 2012). 따라서 이러한 문제를 해결하기 위한 가장 바람직한 방법은 인 산가용화 미생물을 이용하여 토양 속에 다량으로 축적 되어 있는 불용성 인산태를 작물이 이용할 수 있는 유리 인산으로 전환하는 것으로 미생물을 이용한 인산 가용화 는 비료 생산에 들어가는 고비용을 보상해주는 경제적인 효과뿐만 아니라, 토양에 작물이 이용 가능한 인산을 공 급해주는 중요한 역할을 한다(Rodriquez and Frafa, 1999; Qureshi, et al, 2011; Sane and Mehta, 2015).
인산 가용화균에 의한 불용성인산의 가용화 기작은 미 생물이 생성하는 gluconic acid, acetic acid, oxalic acid, malonic acid및 succinic acid와 같은 유기산에 의한 가 용화가 주요 기능이라고 보고되고 있다(Fernandez et al, 2007; Mundra et al, 2011; Egamberdieva, et al, 2015).
또한 인산가용화 능력은 인산가용화균의 상호 작용에 의 하여 시너지효과를 발생시키는 것으로 알려져, 인산가용 화 세균과 세균 간의(Bras and Nahas. 2012) 그리고 인 산가용화 세균과 인산가용화 곰팡이 사이의 상호작용에 의한 길항작용 또는 시너지효과에 관한 연구결과도 보고 되었다(Ahuja, et al, 2007; Walpola and Yoon, 2013;
Park et al, 2016).
본 실험에서는 두 종의 인산가용화 박테리아 Pantoea rodasil LH-1과 Burkholderia stabilis HS-7를 이용하여 배지에서 배양 시 두 균간의 인산가용화능의 상호작용을 검토하였고, 단일 접종과 동시 접종한 경우 상추 생육에 미치는 효과를 비교하였다.
재료 및 방법
인산가용화균의 분리
인산 가용화 박테리아 Pantoea rodasill 와 Burkholderia stabilis는 Park 등(2016)의 방법에 따라 충청남도 부여군 석성면 양송이 재배농가의 양송이 수확후 배지로부터 분 리하였다. 토양 1 g을 0.85% NaCl 용액 99 mL이 담긴 플라스크에 넣어 30분간 진탕한 후 진탕한 용액 1 mL을 0.85% NaCl용액이 9 mL 담긴 플라스크에 넣어 희석한 후 희석용액을 희석평판법에 의해 NBRIP (National Botanical Research Institute Phosphorus)배지(Nautiyal, 1999)에 도말 하여 균주 분리를 하였다. 도말한 배지는 40oC Incubator에 넣고 배양하였고 배지 내 투명환(Clear zone)이 형성된 Colony만을 다시 NBRIP 배지에 계대배 양하여 순수분리하였다. 이 중에서 투명환을 크고 빠르게 형성하는 Pantoea rodasill LH-1과 Burkholderia stabilis HS-7을 이용하여 분리하여 진행하였다.
미생물 배양
전배양을 위해 분리한 인산가용화 박테리아의 단일 colony를 NB(Nutrient Broth)배지 25 mL이 담긴 100 mL
Flask에 접종하여150 rpm, 30oC으로 48시간 진탕배양하 였다. 본배양은 전배양액 1 mL을 NBRIP액체배지 200 mL가 담긴 500 mL Erlenmeyer Flask에 각각 접종하였 다. 그리고 두 종의 인산 가용화 박테리아의 시너지효과 를 확인하기 위하여 P. rodasill LH-1와 B. stabilis HS-7 을 배양한 전 배양액을 각각 0.5 mL씩 합이 1 mL이 되 도록 동시 접종하였고, 균을 접종하지 않은 멸균한 NBRIP 액체배지를 대조군으로 설정하였다. 본 배양한 NBRIP액체배지는150 rpm, 30oC에서 7일간 진탕 배양하 며 1일, 3일, 5일, 7일차 간격으로 pH, 배지내 잔류당, 가 용화된 인의 함량, 유기산 생성분석을 하였다. 처리구는 control, P. rodasill LH-1, B. stabilis HS-7 그리고 P.
rodasill LH-1와 B. stabilis HS-7 동시접종으로 3회 반복 실험하였다.
가용화된 인의 함량분석 배지의 pH측정
배지 내 가용화된 인의 함량분석은 Phospho-molybdate blue color method(Murphy and Riley 1962)를 참고하여 분석하였다. NBRIP배양액을 1.5 mL, Tube에 1.5 mL 취 하여 Centrifuge를 이용하여 13000 rpm, 4oC에서 3분간 원심분리 후 상등액을 50 mL Volumetric Flask에 0.1 mL 넣었다. 그 다음 Ammonium para-molybdate를 8 mL 넣 어 증류수를 Volumetric Flask의 50mL 표시선까지 채운 후 10분간 방치하였다. Spectrophotometer(GENESYS 10S UV-VIS. Thermo, USA) 를 이용하여 660nm에서 흡 광도를 측정하여 가용화된 인을 분석하였다.
배지 내 pH 및 잔류 당 분석
pH는 배지가 오염되지 않도록 멸균된 pipet으로 일정 량 덜어 pH meter를 이용하여 측정하였다. 배지 내 잔류 당 분석은 DNS(3,5-dinitrosalicylic acid)법을 이용하여 측정하였다. 시험관(18 mmФ × 150 mmH)에 배양액 시 료 1 mL과 DNS 시약 3 mL를 차례로 첨가 후 100oC의 물이 있는 수조에서 15분간 반응시킨다. 실온에서 냉각 한 후 Spectrophotometer(GENESYS 10S UV-VIS. Thermo, USA)를 이용하여 550 nm 파장에서 흡광도를 측정하 였다.
HPLC에 의한 유기산 분석
배지내 존재하는 균이 생성한 유기산 생성을 정성적, 정 량적으로 분석하기 위하여 1260 series HPLC(Agilent Technologies, CA, USA)을 사용하여 분석하였다. 칼럼은 Inertsil ODS-3V column (150 × 30 mm I.d. particle size 3µm)을 사용하였으며, 칼럼온도는 40oC, 검출파장 (Detection wavelength)은 210 nm로 설정하였다. 이동상 용매는 0.008 N H2SO4 를 100% 로 사용하였고 시료는 자동 주입기를 이용하여 10.0 µl 주입하였고, 유량(flow rate)은 0.2 mL min-1 로 20분간 분석하였다.
상추재배 실험
인산가용화균 P. rodasill LH-1와 B. stabilis HS-7 각각 접종하였을 때와 동시 접종하였을 경우에 식물생장에 미 치는 효과를 비교하기 위해 포트 재배실험을 하였다. 작 물은 상추로 하였고, 묘목상태로 구입을 하여 2016년 2월 29일부터 2016년 3월 28일 까지 총 4주간 충남대학교 농 업생명과학대학의 온실에서 재배하였다. 화분에 상토를 담은 후 (NH2)2CO 320mg Kg-1, KCl 160 mg Kg-1 를 각 포트 당 처리해 주었으며 인은 Ca3(PO4)2 를 350mg Kg-1 처리 해주었으며 처리조건은 접종하지 않은Control, Control + TCP (Tri-Calcium phosphate), P. rodasill LH- 1처리군, P. rodasill LH-1 + TCP 처리군, B. stabilis HS- 7 처리군, B. stabilis HS-7+ TCP 처리군, P. rodasill LH- 1 + B. stabilis HS-7 처리군, P. rodasill LH-1 + B.
stabilis HS-7 + TCP 처리군 총 8개의 처리군으로 나누었 다(n=3). 1주일 간격으로 인산가용화 박테리아를 추가로 접종해 주었다. 배양액은 25 mL NB 배지에 배양하여 각 포트당 배양액1 mL을 물에 10배 희석하여 고르게 관주하 여 접종하였고, 수확 후 엽장과 뿌리 길이를 측정하여 생 장 차이를 비교하였다.
결과 및 고찰
분리균의 동정
NBRIP배지에 희석평판법을 이용하여 계대배양한 선발 균주들 중 투명환의 크기가 큰 두 균주(LH-1 과 HS-7)를 최종 선발하여 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하였고, NCBI Genbank System을 이용하여 염기서열을 확인한 결과, LH-1은 Pantoea rodasill 와 98.28%, HS-7는 Burkholderia stabilis 와 99.93%의 상동성을 보였다(Fig. 1).
가용화된 인의 함량분석
Ca3(PO4)2을 함유하고 있는 NBRIP액체배지에 분리균을 접종하여 배양기간에 따른 배지내 가용화된 인의 함량을 측정하였다. 가용화된 인의 함량은 배양 7일차에서 B.
stabilis HS-7와 P. rodasill LH-1을 동시 접종한 배지가 783.41 μg mL-1로 가장 높았으며, 단일 접종한 배지는 5 일차에서 P. rodasill LH-1가 752.13 μg mL-1, B. stabilis HS-7는 745.53 μg mL-1로 최대값을 나타내었다. 결과적 으로 인산가용화 박테리아를 단일 접종한 경우보다 동시 접종한 경우에서 인산가용화능이 향상되었지만 유의수준 의 시너지 효과는 없는 것으로 확인되었다(Fig. 2).
배지 내 pH의 변화
배양기간에 따른 pH 변화는 인산가용화균이 생성하는 유 기산에 의해 pH가 감소하는데, 가용화된 인의 함량 변화와 pH값의 변화는 대체적으로 음의 상관관계를 보였다. P.
rodasill LH-1 단일접종 배지는 배양5일차에 초기 pH 7.0에서
pH 4.37로 가장 낮은 값을 나타내었지만, B. stabilis HS-7 단 일접종 배지와 두 균을 동시 접종한 배지는 배양 3일차에서 각각 pH 4.32 와 pH 4.29로 가장 낮은 pH값을 보였다(Fig. 3).
Fig. 1. Phylogenetic tree showing the position of isolate phosphate solubilizing bacterial strains LH-1 and HS-7 wit respect to related species. The scale bar indicates 0.00 substitutions per nucleotide position and accession number are given in parenthesis.
Fig. 2. Comparison of phosphate solubilization during singl and co-inoculation of Pantoea rodasill LH-1 and Burkholderi stabilis HS-7. Values given here are the means of thre replicates (n=3).
Fig. 3. Comparison of pH change during single and coinoculation of Pantoea rodasill LH-1 and Burkholderia stabilis HS-7. Values given here are the means of three replicates (n=3).
Fig. 4. Comparison of residual glucose content. during single and co-inoculation of Pantoea rodasill LH-1 and Burkholderia stabilis HS-7. Values given here are the means of three replicates (n=3).
Fig. 5. HPLC profiles of organic acid from the medium cultured during 7days a) eight standard of organic acid; b) P. rodasill LH-1 7days; c) B. stabilis HS-7 7days; d) co-inoculation 7 days.
Peak number: 1, gluconic acid; 2, oxalic acid; 3, malic acid; 4, lactic acid; 5, acetic acid; 6, ctric acid; 7, succinic acid; 8, malic acid- β.
배지 내 잔류당 변화
배지 내 남아 있는 glucose 함량의 변화는 배양 5일 후 단일 접종 배지에서 P. rodasill LH-1 은 6.83 mg mL-1, B. stabilis HS-7는 4.63 mg mL-1, 그리고 동시접종구는 3.78 mg mL-1으로 나타나 배양기간에 따라 배지 내 glucose 함량이 계속해서 낮아저 배양 7일 후 총 감소율 은 P. rodasill LH-1은 31.7%, .B. stabilis HS-7은 53.7%, 동시 접종구는 87.1%으로 유의수준의 큰 차이를 보였다 (Fig. 4).
HPLC 분석에 따른 유기산 분석
배양여액 중에서 생성된 유기산 생성 분석결과, HPLC 분석에 의하여 8종의 표준유기산 glutamic acid, gluconic acid, oxalic acid, malic acid, lactic acid, citric acid,
succinic acid 중 gluconic acid, lactic acid, malic acid, acetic acid 및 citric acid가 검출되었다(Fig. 5). Gluconic acid는 1일차에서만 동시접종 배지와 두 종의 단일접종 배지에서 검출되었지만 이후에는 검출되지 않았다. Citric acid는 세 처리구의 주요 생성 유기산으로 모든 배지에서 검출되었으며, 7일차에 최대로 생성되었으며 동시 접종 배지가 단일 접종 배지보다 높은 농도 값을 보였다.
Malic acid의 경우 P. rodasill LH-1와 동시접종 배지에서 만 일부 검출이 되었고, B. stabilis HS-7에서는 검출이 되 지 않아 malic acid는 P. rodasill LH-1의 생성물임을 알 수 있었다(Table 1).
상추생육효과
상추 포트 재배실험을 통한 생육효과를 조사하기 위하 Table. 1. HPLC analysis of organic acid by single and co-inoculation of Pantoea rodasill LH-1 and Burkholderia stabilis HS-7.
Values given here are the means of three replicates (n=3). ND = not detected
Gluconic aicd (mg mL-1) Succinic acid (mg mL-1)
Day 1 Day 3 Day 5 Day 7 Day 1 Day 3 Day 5 Day 7
LH-1 0.97
(± 0.37) ND ND ND ND ND ND ND
HS-7 0.69
(± 0.10) ND ND ND ND ND ND ND
LH-1+HS-7 0.93
(± 0.36) ND ND ND ND ND ND ND
Malic acid (mg mL-1) Lactic acid (mg mL-1)
Day 1 Day 3 Day 5 Day 7 Day 1 Day 3 Day 5 Day 7
LH-1 0.32
(± 0.23)
0.06 (± 0.02)
0.03 (± 0.02)
0.12 (± 0.02)
0.05 (± 0.01)
0.09 (± 0.01)
0.03
(± 0.01) ND
HS-7 ND ND ND ND 0.21
(± 0.17)
0.23 (± 0.23)
0.24 (± 0.22)
0.27 (± 0.19) LH-1+HS-7 0.30
(± 0.21)
0.17 (± 0.03)
0.09 (± 0.02)
0.17 a (± 0.08)
0.04 (± 0)
0.01b (± 0)
0.01a (± 0)
0.01a (± 0) Acetic acid (mg mL-1) Citric acid (mg mL-1)
Day 1 Day 3 Day 5 Day 7 Day 1 Day 3 Day 5 Day 7
LH-1 0.06
(± 0.04)
0.11 (± 0)
0.10 (± 0.09)
0.25 (± 0.02)
0.09 (± 0.01)
0.27 (± 0.06)
0.22 (± 0.06)
0.23 (± 0.06)
HS-7 0.03b
(± 0.02)
0.10 (± 0.12)
0.09a (± 0)
0.11 (± 0.09)
0.07 (± 0.06)
0.21 (± 0.15)
0.17 (± 0.12)
0.34 (± 0.03) LH-1+HS-7 0.05
(± 0.03) ND ND ND 0.10
(± 0.02)
0.31 (± 0.16)
0.71 (± 0.17)
0.96 (± 0.24) Oxalic acid (mg mL-1)
Day 1 Day 3 Day 5 Day 7
LH-1 ND ND ND ND
HS-7 ND ND ND ND
LH-1+HS-7 ND ND ND ND
an=1 Even 3 repetitions were analysed, detected in only sample.
bn=2 Even 3 repetitions were analysed, detected in only sample.
여 P. rodasill LH-1 와 B. stabilis HS-7를 단일 및 동시 접종한 후 2주 후 접종구간의 상추의 생육 차이를 조사하 였다. 조사항목은 처리구 별 잎의 길이와 뿌리길이의 변 화를 조사하였다 (Table 2). TCP(Tri-calcium phosphate) 무처리구에서는 대조구에 비해 잎과 뿌리의 길이에서 P.
rodasill LH-1접종구는 2.5% 와 3.9%, B. stabilis HS-7 접종구는 1.1%와 4.8%, 동시 접종구에서는 7.7%와 15.5%의 생육증진효과를 보였다. 또한 TCP처리구에서는 대조구에 비해 P. rodasill LH-1 가 9.9%와 4%, B.
stabilis HS-7은 6.5%와 6.8%, 동시접종구는 15.6%와 14.5%의 생육효과를 보임으로서 접종구가 대조구에 비해 인산가용화능 및 상추생육효과를 촉진시키는 것을 확인할 수 있었으며, 동시접종구가 단일접종구보다 상추생육효과 를 향상시키는 것으로 나타났다.
적 요
양송이 수확후 배지에서 분리한 Pantoea rodasill LH-1 와 Burkholderia stabilis HS-7간의 단일 접종 및 동시접 종에 따른 인산가용화능과 상추생육효과를 조사하였다.
NBRIP액체 배지에 분리균을 접종하고 배지에 함유된 인 산칼슘으로부터 해리된 가용인산(soluble phosphorus)함 량을 측정한 결과, P. rodasill LH-1는 736.59 μg mL-1, B.
stabilis HS-7은 743.90 μg mL-1, 그리고 B. stabilis HS-7 와 P. rodasill LH-1을 동시 접종한 배지는 783.41 μg mL-1로 가장 높았지만 유의수준의시너지 효과는 나타나지 않았다. 배지 내pH는 초기 pH 7.0에서 배양 3일 후 모든 접종구에서 pH 4.3수준으로 감소하였으며, 또한 배지 내 잔류 당 감소율은 P. rodasill LH-1 31.7%, B. stabilis HS-7은 53.7%, 동시 접종한 배지에서는 87.1%로 가장 높은 감소율을 나타냈다. 분리균에 의해 생성한 배지 내 유기산을 분석한 결과, gluconic acid, lactic acid, malic acid, acetic acid, citric acid 이 검출되었으며, 이 중 citric
acid가 주요 유기산으로 동시 접종한 배지에서 0.96 mg mL-1로 가장 높은 함량을 나타내었다. 상추 재배 실험결 과 동시 접종구가 대조구에 비해 잎의 길이는 7.7%, 뿌리 길이는 15.5% 생육증진효과를 보였다. 이 결과들을 바탕 으로 B. stabilis HS-7 와 Pantoea rodasill LH-1이 동시 접종에 의해 유의수준의 인산가용화 시너지 효과는 관찰 되지 않았지만, 무 접종구에 비하여 배지 내 인산가용화 능과 작물의 생장이 크게 촉진되는 결과를 보임으로서 인 산가용화균을 이용한 미생물 비료의 공급으로 염류집적토 양의 인산가용화능과 작물의 생육을 향상시킬 수 있다고 생각된다.
감사의 글
본 연구는 충남대학교 학술연구비 지원으로 수행한 결 과 입니다.
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rodasill LH-1 and Burkholderia stabilis HS-7 on shoot length and root length of Lactuca sativa. Values given are the means of replicates (n=5)
Treatment Shoot length (Cm Plant-1)
Root length (Cm Plant-1)
Control 13.80±0.17 22.42±0.84
Control+TCP 13.23±0.53 23.04±2.34
LH-1 14.15±0.95 23.30±1.99
LH-1+TCP 14.55±0.41 23.94±2.60
HS-7 13.95±0.62 23.50±1.12
HS-7+TCP 14.09±0.64 24.60±1.78
LH-1+HS-7 14.86±1.28 25.90±3.47
LH-1+HS-7+TCP 15.30±0.88 26.38±2.69
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Fig. A. Figure of phosphate solubilizing bacterial formed clear zone in medium a), Pantoea rodasill LH-1; b), Burkholderia stabilis HS-7.
Fig. B. Comparison growth change of Lactuca sativa growth each treatment groups. a), Control; b) Pantoea rodasill LH-1;
c), Burkhold.
Appendix A Appendix B
