[특별기획(Ⅰ)] 메조포러스 물질을 이용한 나노효소반응기

서론

효소 활성의 안정화는 효소의 실질적인 활용 및 응 용을 위해서 필수적인 요건이며, 이는 효소를 이용한 바이오촉매 공정에서도 가장 먼저 해결되어야 할 선 결 과제이기도 하다. 효소의 안정성 향상은 효소의 수 명 및 효율을 증가시키고 재사용을 가능하게 하여 관 련 분야에서 더욱 실용적인 효소의 사용을 가능하게 한다. 효소 활성의 안정화를 위한 다양한 접근 방법들 중에서도 나노세공성 물질을 이용한 효소 고정화 방 법은 간단하면서도 효과적인 방법으로 각광을 받고 있다. 나노세공성 물질은 높은 표면적과 기공 부피, 다 양한 구조와 크기의 기공을 가지고 있기 때문에 촉매 의 담지체로써 널리 활용되고 있다. 1990년대 초반에 개발된 나노세공성 물질은 상대적으로 작은 기공 크 기(2~5 nm)를 가지고 있어 다양한 크기의 효소를 담지하는 데 많은 제약이 있었다. 하지만 최근에는 기 공의 크기가 다양한 (5~50 nm) 나노세공성 물질이 개발되면서 촉매의 크기에 따른 담지체의 맞춤형 기 공크기 제어가 가능해졌다. 맞춤형 나노담지체의 개발 은 효소의 담지량을 높임과 동시에 안정성을 증가시 키고 효소와 담지체 사이의 물질전달저항을 낮추는 결과를 가져왔다. 또한 기존의 실리카 물질뿐만 아니 라 탄소, 전이금속 산화물 등 다양한 종류의 나노세공 성 물질이 개발되어 효소 고정화 및 응용을 위한 나노 세공성 물질의 활용이 점차 증가하고 있다. 효소를 담 지하는 방법으로는, 효소를 기공 안으로 단순 흡착 (simple adsorption) 시켰던 초기연구에서부터 효소와 담지체간의 공유결합을 이용한 방법(covalent

attachment), 캡슐화(encapsulation), 가교 효소응집 체(cross-linked enzyme aggregation, CLEA) 접근 법 등의 다양한 고정화 방법이 있다. 본 고에서는 다양 한 나노세공성 물질 중에서도 메조포러스 물질(기공 크기 2~50 nm)을 이용한 효소의 고정화 및 안정화 방법, 그리고 그 응용에 대한 연구 결과를 소개하고자 한다.

메조포러스 물질 (Mesoporous Media) 구조규칙성을 가지고 균일한 기공크기를 가지는 나노세공물질은 높은 표면적과 큰 기공부피를 가지 는 특징이 있다. 사용환경에 따라 기공의 크기와 형 태 조절이 가능하고 표면특성을 개질할 수 있기 때 문에 촉매, 태양전지 및 연료전지 전극물질, 그리고 효소를 비롯한 다양한 물질을 담지할 수 있는 담지 체로 각광받고 있다. 나노세공 물질은 기공크기에 따라 마이크로포러스(microporous, ~2 nm), 메조 포러스(mesoporous, 2 nm~50 nm), 마크로포러스 (macroporous, 50 nm~) 물질로 분류되고, 일반적 으로 나노세공물질은 마이크로포러스와 메조포러스 물질을 의미한다.

1992년 Mobil 사에 의해 개발된 최초의 실리카 계 열의 메조포러스 물질인 MCM-41 (MCM: Mobil Composition of Matter)은 실리카로 형성된 기공이 균일한 크기를 가지고 육각채널 형태의 구조가 규칙 적으로 배열되어 있다[그림 1]. 이후 SBA, KIT, MSU 등 다양한 형태의 구조와 기공 크기를 가지는 메조포러스실리카 물질에 대한 연구가 활발히 진행되

특·별·기·획(Ⅰ)

었다. 메조포러스실리카 물질은 친수성기(hydrophilic) 와 소수성기(hydrophobic)를 동시에 지니는 계면활 성제(surfactant)나 양친성블락공중고분자(amphiphilic block-copolymer)의 자가조립을 이용하여 수열 반응 을 통해 합성된다. 수용액 내에서 형성된 마이셀 (micelle) 바깥 부분의 친수성기와 실리케이트 입자의 상호작용으로 유/무기 나노복합체가 형성되고, 계면 활성제나 블락공중고분자를 제거하면 메조포러스실 리카 물질을 얻을 수 있다.

1999년 유룡 교수 연구진과 현택환 교수 연구진이 개발한 경질 주형법(hard-templating method)은 구 조가 규칙적이고 기공의 크기가 일정한 메조포러스 탄소 물질이다. 기공이 3차원적으로 서로 연결된 메조 포러스실리카 물질을 주형(template)으로 사용한다.

경질주형법을 이용하여 메조포러스 탄소를 만들기 위 해서는 1) 실리카 물질과 탄소전구체의 나노복합체를 합성하고 2) 고온에서 탄화과정을 거친 후 3) 실리카 주형의 제거-과정을 거친다. 주형으로 사용되는 실리 카 물질의 나노구조를 다양화함으로써 원하는 모양의 기공을 가지는 탄소물질을 합성할 수 있다.

메조포러스 탄소를 합성하는 또 다른 방법으로는 양친성블락공중고분자를 이용하는 연질 주형법 (soft-templating method)이 있다. D. Zhao 그룹은 ethyleneoxide(EO)와 propylene oxide(PO)의 단량 체로 이루어진 상용 블락 공중고분자 P123(EO20PO70

EO20) 또는 F127(EO106PO70EO106)를 구조유도체로 사용하여 메조포러스 탄소 합성에 대한 연구를 보고 하였다. 상용블락공중고분자를 이용한 경우, 최종적으 로 얻은 메조포러스 탄소의 기공 크기에 제한이 있기 때문에 polystyrene-b-polyethlyene oxide (PS-b- PEO) 또는 polyisoprene-b-polyethlyene oxide (PI- b-PEO)를 구조유도체로 이용하는 연구가 진행되고 있다. 블락공중고분자를 이용할 경우 분자량조절이 가능하므로 메조포러스 탄소물질의 기공크기를 자유 자재로 조절할 수 있는 장점이 있다. [그림 2]에 경질 주형법으로 합성되는 대표적인 메조포러스 탄소물질 인 CMK-3와 MSU-F 탄소, 연질 주형법을 통해 합 성된 메조포러스 탄소합성에 대한 모식도와 투과전자 현미경(TEM)사진을 나타내었다.

메조포러스 물질을 이용한 효소 고정화

메조포러스 물질에 효소를 고정화하는 방법들이 다 양하게 연구되고 있다[그림 3].

그림 2. 경질주형법 및 연질 주형법을 통한 메조포러스 탄소 합성에 대한 모식도와 TEM 사진.

그림 1. MCM-41의 전자현미경 사진 [Nature 359 (1992) 710].

1) 단순흡착 (simple adsorption)

단순 흡착법은 효소를 물질내부로 효소를 담지하기 위한 가장 간단한 방법으로 메조포러스 물질 기공 내 부의 벽면과 효소 사이에서 작용하는 약한 물리적 흡 착력으로 담지하는 방법이다. 이 방법은 매우 간단하 지만 효소의 안정성이 떨어지고 흡착력이 매우 약해, 반응 및 세척과정에서 많은 양의 효소가 손실된다. 이 런 문제점을 해결하기 위하여 버퍼 용액의 pH를 바꾸 고, 메조포러스 기공벽에 다아미노 그룹이나 카복실 그룹을 붙여 효소와 기공 벽 사이의 전기적 인력을 높 이거나, 소수성 개질 등을 통해 효소의 안정성을 높이 는 연구가 진행되고 있다.

2) 공유결합 (covalent attachment)

단순 흡착법의 단점인 효소와 담지체 사이의 약한 결합력을 극복하기 위해 개발된 방법으로 원자와 원 자 사이의 결합인 공유결합(covalent bond)은 매우 강력한 결합이다. 메조포러스 물질의 기공벽에 작용 기를 붙인 후, 이를 효소에 있는 작용기와 공유 본드 로 결합시켜 효소를 담지한다. 일반적인 효소보다

3) 캡슐화 (encapsulation)

캡슐화 방법은 간단하게 많은 양의 효소를 담지할 수 있는 단순흡착 방법의 장점을 활용하면서 효소 손 실을 막기 위한 방법이다. 효소를 기공 안에 담지한 후 기공의 안과 밖을 연결하는 출입구를 적당히 막아, 크기가 커다란 효소는 빠져나가지 못하고, 그보다 크 기가 작은 반응물과 생성물은 출입이 가능하도록 한 다. 이 방법은 복잡한 공정의 최적화가 매우 어렵다는 것이 단점이다.

4) 가교효소응집체(cross-linked enzyme aggregation, CLEA) 기공 안에 효소를 간단하게 담지한 후에, 기공 안에 서 효소끼리 반응을 시켜 묶는 방법이다(ship-in-a- bottle method). 기공안에서 가교된 효소는 서로 뭉쳐 서 크기가 커지므로, 들어왔던 입구로는 나갈 수가 없 다. 따라서 효소 손실이 매우 줄어들고, 단순 흡착법처 럼 쉽게 효소를 기공 안에 주입할 수 있다. 또, 효소들 이 서로 뭉치기 때문에 같은 부피의 기공 안에 더 많 은 양을 담지할 수 있고, 효소간의 cross-linking 덕분 에 효소의 반응활성도 안정적이다. 많은 양의 효소가, 넓게 aggregation 될수록 효과적이므로, 주 기공과 그 것들을 연결하는 window, 두 가지의 기공을 동시에 가지고 있는 mesocellular foam(MCF) 형의 메조포 러스 물질이 이 방법에 많이 이용된다.

나노효소반응기의 응용

메조포러스 물질에 효소를 고정화한 나노효소반응 그림 3. 메조포러스 물질을 이용한 효소 고정화 방법.

기는 다양한 분야에서 응용되고 있으며, 일례로 효소 의 전기화학적 응용의 확인을 위해 전기전도성물질에 고정화된 포도당 산화효소(glucose oxidase, GOx)의 효소 반응을 이용한 바이오센서에 대한 연구가 보고 되었다. MCF(mesocellular foam)형태의 물질은 약 30 nm 크기의 주기공이 약 20 nm 크기의 기공으로 연결되어 있고 큰 기공과 기공사이에는 약 5.6 nm의 보조채널이 존재하여 원활한 기질 전달이 가능하다 [그림 4 (A)]. 포도당 산화효소는 크기가 3차원적으 로 5×6×7 nm³ 정도이기 때문에 3~5 nm 정도의 크기를 가지는 구조 규칙성을 가지는 탄소 물질 안에 는 들어갈 수가 없으나, 기공의 크기가 큰 MCF- C(carbon)에는 40 wt% 가까이 담지가 된다. GOx를 MCF 탄소에 단순 흡착시킨 후 효소전극을 만들어 사용을 한 결과 MCF-C/GOx 양이 증가할수록 포도 당 센서의 감도가 크게 증가하였다.

효소 단순흡착의 경우에도 메조포러스 물질의 구조 및 기공 특성에 따라 흡착량이 달라지고, 효소의 양이 증가할수록 촉매반응 속도는 증가하게 된다. 또한, 메조 포러스 물질을 변형하면 전기전도성 향상 및 외부 자장 을 이용하여 전체 시스템을 조절할 수 있는 on-off 시 스템 구축 등 상승적 효과를 기대할 수 있다[그림 4].

자성 나노입자를 결합한 메조포러스 탄소물질에 포 도당 산화효소를 담지하고 glutaraldehyde(GA)를 이용하여 CLEA를 형성한다. 작은 크기의 세공들로

연결된 구조를 가진 기공들이 효소의 유출을 방지함 으로써 효소활성을 획기적으로 안정화 할 수 있고, 동 시에 자성 입자에 의해 나노효소반응기 전체가 외부 자장에 쉽게 반응할 수 있다. 그 결과, 22일 동안 초기 활성의 절반 정도가 유지되는 단순흡착 시스템에 비 해 초기활성의 90% 이상 유지되어 효소의 안정성이 크게 증가하였다. 또한 외부 자장에 의한 on-off 상태 가 반복되었을 때, on 상태에서만 선택적으로 촉매반 응에 의한 전류가 흐르며 반복과정에서도 효소의 활 성이 유지되는 것을 알 수 있다[그림 5].

결론

지금까지 메조포러스 물질의 종류와 효소를 담지하 는 방법, 또한 실제 응용한 예에 대해 살펴보았다. 메

특·별·기·획(Ⅰ)

그림 4. (A) Magnetically switchable bio-electrocatalytic system의 작동 원리, (B) 외부자장에 의해 분리되는 Mag-MCF [AngewandteChemie International Edition 44 (2005) 7427].

그림 5. 외부 자장에 의한 전류의 switching [Angewandte

Chemie International Edition 44 (2005) 7427].

서론

효소는 식품, 의약품, 화학변환, 바이오센서, 바이오 연료 등의 분야에서 중요한 역할을 하는 나노 크기 수 준의 강력한 생촉매이다. 그러나 이들 효소들은 불안 정한 활성도 때문에 항상 이용에 제약을 받고 있으며 현장에서 실제적으로 활용되기가 어려운 것이 현실이 었다. 하지만 최근에 나노기술이 발전함에 따라, 나노 입자, 나노섬유, 다공성의 실리카, 캡슐화를 위한 솔- 겔 구조 등의 나노재료들이 개발되었고, 이들을 통해,

효소를 안정화 시킬 수 있는 전략들이 보고 되면서 새 로운 관심을 받게 되었다. 본 기고는 효소 안정화 시 스템 개발과 관련한 소개로서 나노재료를 이용하여 효소의 흡착, 공유결합, 캡슐화 등의 기술에 대해 주로 서술하고 있다. 특히 이들 재료들은 다양한 위치에서 효소와 상호 결합을 통해 단백질의 변성을 감소시키 고, 동시에 효소의 안정성을 증가시키는 결과를 낳게 한다. 반응할 수 있는 표면적이 넓어진 장점은 더 많 은 효소가 교차 결합되어 결정체를 이루고, 뭉쳐져 코

나노재료 표면 위의 효소코팅을 통한 효소 안정화 시스템 개발

황이택, 구만복*

고려대학교 생명과학대학 {ethwang, *mbgu}@korea.ac.kr

그림 1. 전기방사법에 의한 고분자 나노파이버 생산 [ACS symposium series (2007)].