Effect of Doxycycline on the Acute Lung Injury Induced by Gut Ischemia/Reperfusion

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□ 원 저 □

장의 재관류로 유도된 급성폐손상에서의 Doxycyclin의 효과

대구가톨릭대학교 의과대학 생리학교실, 내과학교실^＊

이영만, 권성철, 이상채^＊

=Abstract=

Effect of Doxycycline on the Acute Lung Injury Induced by Gut Ischemia/Reperfusion

Young Man Lee, M.D., Sung Chul Kwon, M.D., Sang Chae Lee, M.D.*

Department of Physiology, Internal Medicine* Catholic University of Daegu, Daegu, Korea

Background : Phospholipase A2 (PLA2) has been known to be involved in the pathogenesis of acute lung injury (ALI) including ARDS. Since doxycycline has the property of inhibiting secretory group II PLA2, the therapeutic effect of doxycycline hyclate was investigated for gut ischemia/reperfusion (I/R)-induced ALI in Sprague-Dawley rats.

Methods : ALI was induced in Sprague-Dawley rats by clamping of the superior mesenteric artery for 60 min, followed by 120 min of reperfusion. To confirm the pathogenetic mechanisms of this ALI associated with neutrophilic oxidative stress, we measured bronchoalveolar lavage (BAL) protein content and lung MPO, and performed cyto-chemical electron microscopy for detection of free radicals, assay of PLA2 activity and cytochrome-c reduction assay.

Results : In gut I/R-induced ALI rats, protein leakage, pulmonary neutrophil accumulation, free radical production and lung PLA2 activity were all increased. These effects were reversed by doxycycline hyclate.

Conclusion : Doxycycline appears to be effective in ameliorating the gut I/R-induced ALI by inhibiting PLA2, thereby decreasing the production of free radicals from neutrophils.(Tuberculosis and Respiratory Diseases 2003, 54:532-541)

Key words : ALI, Neutrophils, Oxidative stress, Doxycyclin.

Address for correspondence:

Sang Chae Lee, M.D.

Department of Internal Medicine, Catholic University of Daegu,School of Medicine 3056-4 DaeMyung 4 Dong, Nam Gu, Daegu, 705-718, Korea.

Phone : 053-650-4039 Fax : 053-622-2072 E-mail : [email protected]

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서 론

급성호흡곤란증후군(acute respiratory distress syndrome, ARDS)은 화상, 익수, 다발성외상, 패혈 증 등의 다양한 원인에 발병하는 폐장의 염증성 폐질환이다¹. 현재까지 다양한 연구를 통해 그 병 인론이 상당히 규명되었으나 원인에 따른 정확한 병인론이 확립되어있지 않고 따라서 적절한 치료 법이 개발되지 않았다. ARDS의 병인중 장의 재관 류에 의한 병인론은 최근에 이르러 산화성스트레 스와 연관하여 다양하게 연구되었는데² 그 중 Koike 등³ 은 phospholipase A2 (PLA2)의 작용에 따른 호중구성 산화성 스트레스가 중요한 원인이 라고 주장하고 있다. 폐장에서의 산화성 스트레스 의 원인이 PLA2외에도 XO에 의한것이라는 주장 도 있으나⁴ XO든지 PLA2든지 장의 재관류에 따른 급성폐손상의 발생은 산화성스트레스와 연관이 있 다고 생각된다.

폐장의 염증성 폐부종에 관여하는 PLA2의 역할 은 주로 염증성 지질분자의 과량 생성⁵이 그 원인 이며 이중 몇가지의 염증성 지질분자는 호중구막 의 NADPH oxidase를 활성화시켜 산소기를 생성, 유리한다. 최근에 이르러 호중구막의 NADPH oxidase의 활성화에 따른 산소기의 과량 생성에 따른 산화성 스트레스는 분명히 PLA2의 활성화가 관계한다고 보지만 어떤 종류의 PLA2가 주된 원 인인지는 확실히 밝혀지지 않았다⁶. 분비형 PLA2-I(sPLA2-I) 및 분비형 PLA2-II(sPLA2-II)가 ARDS의 발병과 관계가 있다고 알려져 있으나⁷ 장 의 재관류에 따른 급성폐손상시에 관여하는 PLA2

는 분자량이 14500 dalton정도의 분비형 groupII PLA2라는 주장도 있다⁸. 한편 doxycyclin이나 minocyclin은 분비형 PLA2를 선택적으로 억제하여 항염증작용이 있다고 한다⁹. 이에 착안하여 본 연 구에서는 doxycyclin을 이용하여 분비형 PLA2를 억제하고 장의 허혈-재관류에 의한 급성폐손상에

어떤 효과가 있는지를 알아보고자 하였고 특히 분 비형 PLA2의 억제에 따른 호중구에 의한 산화성 스트레스에 어떤 영향을 미치는지를 규명하고자 하였다.

대상 및 방법 1. 시약 및 실험동물

Enflurane(아리레인^Ⓡ)은 일성신약주식회사, xylazine 은 Haver사 (New York, NY, USA), PLA2의 활성 도 검사를 위해 사용한 palmitoly-2 (9,10(N)-³H) plamitoyl)-phosphatidylcholine(³H-DPPC)은 NEN life science product (Boston, MA, USA)에서 구입 하였고 그 위의 모든 시약은 Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

실험동물은 체중 300 g 내외의 Sprague-Dawley 종 흰쥐, 수컷을 사용하였다.

2. 흰쥐에서의 급성폐손상의 유도

장의 허혈-재관류에 의한 급성폐손상을 유발하기 위하여 체중 300 g 내외의 Sprague-Dawley종 흰 쥐에 ketamine hydrochloride (60 mg/kg) 및 xylazine (6 mg/kg)을 복강으로 주사하여 마취한 후 개복술을 시행하여 상장간동맥 (superior me󰠀

senteric artery)을 bulldog clamp로 60분간 clamp 하였다. 그후 clamp를 풀고 120분간 재관류를 시 켜 급성 폐손상을 유발하였다. 분비형 PLA2의 억 제제인 doxycyclin은 상장간동맥 Clamp 60분전에 doxycyclin hyclate (10mg/kg)를 복강내로 주사하 였다. 그후 폐장을 적출하기 위하여 흰쥐를 Harvard제 (Harvard Apparatus, UK) rodent-ven󰠀

tilator에 연결한 후 개흉술을 시행하고 polye󰠀

thylene catheter를 폐동맥에 삽관한 뒤 Masterflex perfusion pump (Cole-Parmer, USA)에 연결한 뒤

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생리적 식염수로 관류하여 폐장내 혈액을 제거한 뒤 적출하였다. 적출된 폐장은 무게를 측정한 후 즉시 액체질소에 담근 뒤 -70℃에 냉동보관 하였 다.

3. 폐세척액내의 단백함량의 측정

장의 재관류 후 급성폐부종이 유발된 것을 확인하 기 위하여 폐세척액내의 단백함량을 측정하였다.

즉 상장간동맥 재관류 120분 후에 흰쥐에 keta󰠀

mine hydrochloride (60 mg/kg) 및 xylazine (6.0 mg/kg)을 경정맥을 통해 주사하여 치사시킨 후 기관절개술을 시행하여 삽관후 8.0ml의 생리적 식 염수를 이용하여 폐세척을 시행하였다. 이때 얻어 진 6.0ml의 폐세척액은 즉시 2,000 rpm으로 상온 에서 10분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 이 상 등액을 이용하여 Brown등의 방법¹⁰에 따라 단백질 을 정량하였다.

4. 폐장내 myeloperoxidase (MPO) 활성도의 측정

장의 재관류후 나타나는 급성 폐부종이 호중구의 침윤에 따른 respiratory burst와 관계가 있는지를 확인하기 위하여 폐장내 MPO의 활성도를 Gold󰠀

blum등의 방법¹¹에 따라 측정하였다. 즉 동결보존 된 폐장을 20 mM potassium phosphate용액 (pH 7.4) 4.0ml에 담근 다음 Polytron (Swizland)분쇄기 로 균질하게 분쇄하였다. 그 뒤 40,000 g, 4℃에서 30분간 원심분리후 상등액은 버리고 침전층은 0.5% hexadecyl tetramethyl ammonium bromide 가 함유된 50 mM potassium phosphate 용액 (pH 6.0)에 재부유 시켰다. 이 용액을 90초간 soni󰠀

cation(Vibracell, USA) 한 뒤, 60℃ 항온수조에서 120분간 incubation하였다. 그 뒤 조직분쇄액 1.0ml 를 12,000 rpm, 상온에서 2분간 원심분리한 뒤 상

층액 0.1ml를 분리하여 o-dianisidine 0.0168 g이 함유된 5×10^-4 M의 과산화수소 2.9ml와 반응시켜 파장 460 nm에서 enzyme kinetics를 시행하였다.

즉 시간의 경과에 따른 흡광도 (dA/dt)를 측정하 여 이를 폐장의 무게로 나누고 여기에 13.5를 곱하 여 MPO (U/g of wet lung)의 활성도를 구하였다.

5. 호중구에 있어서의 산소기 생성의 검사

호중구에서 생성되는 산소기 형성에 미치는 doxycyclin hyclate의 영향을 알아보기 위하여 인 체의 혈액에서 호중구를 분리하고 이 분리된 호중 구를 이용하여 NADPH oxidase의 활성도를 검사 하였다.

1) 호중구의 분리 :

호중구에서 생성되는 산소기 특히 superoxide anion (O2-

)의 생성에 doxycyclin hyclate가 미치는 영향을 알아보기 위해 Hasletts등¹²의 방법에 따라 인체의 혈액으로부터 호중구를 분리하였다. 2개의 50ml 주사기에 15ml 씩의 Pentaspan (제일약품주 식회사)과 1.0ml의 heparin (1000 U)을 혼합한 뒤 정맥에서 30ml의 혈액을 뽑아 혼합한 뒤 주사기를 수직으로 세워 40분간 방치하여 혈장층이 분리되 도록 하였다. 그 뒤 혈장층을 분리하고 55%, 74%

등장성 percoll 용액을 이용하여 상온, 1,500 rpm에 서 20분간 비중차 원심분리 (gradient centrifuga󰠀

tion)를 시행하였다. 원심분리 후 55%와 74%

percoll 경계에 모인 호중구층만을 분리하고 이 호 중구를 생리적식염수에 혼합한 뒤 1,000 rpm에서 원심분리하여 생리적식염수로 2회 세척한 뒤 산소 기 생성검사에 사용하였다.

2) 호중구에 있어서의 산소기 생성의 검사 : 분리된 호중구를 이용하여 Botha등¹³의 방법에 따 라 doxycyclin이 호중구에서의 산소기 생성에 미

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치는 영향을 검사하였다. 즉 2×10⁶개의 호중구가 든 HBSS용액에 10% normal pooled serum을 가 하고 여기에 phorbol myristate acetate(PMA)가 400 nM이 되도록 첨가하여 호중구에서의 respir󰠀

atory burst를 유발하였다. Doxycyclin의 효과를 보기 위해서는 PMA 첨가후 10 nmol의 doxy󰠀

cyclin을 첨가하고 37℃의 수조에서 15분간 incu󰠀

bation후 파장 550 nm에서 비색정량하였다.

6. 전자현미경을 이용한 폐장내 과산화수소 형성 의 관찰

장의 재관류후 유발되는 급성폐손상에서 폐장내 산소기의 역할을 알아보기 위하여 폐장내 과산화 수소의 생성을 검사하였다. 즉 Karnovsky등의 방 법¹⁴을 변형하여 폐장조직을 담궈 반응시킬 용액내 에 NADPH를 제외하고 cerium chloride를 첨가하 여 폐장조직내의 과산화수소의 생성을 검사하였다.

즉 cytochemical electron microscopy를 시행하기 위하여 폐장조직을 적출 즉시 2.0 mM cerium chloride, 10 mM 3-amino-1,2,4-triazol, 0.1 M tris-maleate buffer (pH 7.5), 7% sucrose, 0.002%

Triton X-100으로 조제된 기질에 담그고 30분간 37℃에서 반응시켰다. 이 과정은 조직내의 과산화 수소가 cerium chloride와 반응하여 cerrous perhydroxide를 형성하는 과정이다. 반응이 끝난 조직을 0.1 M Tris-maleate buffer (pH 7.4)와 0.1 M sodium cacodylate buffer (pH 7.4)로 차례로 수세한 후 1% osmium tetroxide in 0.1 M cacodylate buffer (pH 7.4)로 고정시켰다. 고정이 끝난 조직을 sodium cacodylate buffer로 수세하고 alcohol-propylene oxide 계열로 농도를 순차적으 로 증가시키며 탈수시킨 다음 epoxy-resin에 포매 하였다. 포매된 조직을 열중합시켜 블록을 제작한 뒤 ultramicrotome (Recher-Supernova)을 이용하 여 60-70 nm의 두께로 초박절편하여 uranyl

acetate로 염색한 뒤 투과전자현미경으로 관찰하였 다. 관찰시의 contrast 및 해상도를 높이기 위하여 counter stain은 시행하지 않았다.

7. 폐장의 phospholipase A2 활성도의 측정

내장의 재관류 후 doxycyclin이 폐장의 phospho󰠀

lipase A2 (PLA2)의 활성도에 비치는 영향을 알아 보기 위하여 Katsumata 등의 방법¹⁵에 따라 PLA2

의 활성도를 측정하였다. 즉 -70℃로 동결보존된 폐장을 1 mM의 DTT가 함유된 0.25 M sucrose용 액 4.0ml에 녹인 후 Polytron homogenizer (Swizland)로 분쇄하였다. 분쇄 후 즉시 얼음 위에 서 60초간 Vibra cell (Sonics & Materials, USA) 을 이용하여 sonication하여 cell lysate를 얻었고 이 중 0.1ml를 PLA2 활성도 검사에 사용하였다.

즉 0.1ml의 cell lysate는 900 ㎕의 2.0 μCi의

3H-diplamitoylphosphatidylcholine(DPPC)이 함유 된 완충용액 (100 mM glycine, 10 g/l BSA, 2.5 mM deoxycholate, 0.1 mM lecithin, 20 mM CaCl2, 1.75 mM ethanol, pH 9.0)과 혼합하여 37℃

의 수조에서 30분간 반응시켰다. 그 뒤 1g의 Na2SO4를 가하여 단백질을 침전시키고 5.0ml의 0.1%의 빙초산이 함유된 acidic hexane을 가하여 혼합한 뒤 hexane층을 분리하고 이 중 1.0ml를 3.0ml의 scintillation cocktail과 혼합한 뒤 β -scintillation spectrometry를 시행하였다. PLA2의 표준시료로는 Crotalus adamanteus PLA2 0.01 unit를 매번 실험에 사용하였고 PLA2 1.0 unit는 1 분당 유리지방산 1 μmol이 생성되는 것으로 정의 하였다.

8. 통계처리

모든 성적은 평균±표준오차로 나타내었다. 유의 성의 검정은 Student-Newman-Keul test를 이용

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Fig. 1. Comparison of protein content(mg/ml) in BAL. Gut I/R had increased protein content(p<0.001) compared with that of BAL of control rats. In contrast, Doxy󰠀 cycline decreased(p<0.001) protein content in the BAL of gut I/R rats.

Values are given as mean±S.E.

Values in parentheses indicate the number of experiments.

I/R : gut ischemia/reperfusion Doxy : Doxycycline hyclate

*p<0.001, Control vs. I/R

#p<0.001, I/R vs. I/R+Doxy

Control I/R I/R + Doxy

Protein in BALF (mg/ ml)

0 2 4 6 8 10

#

*

Figure 1.

Fig. 2. Change in lung MPO activity(U/g of wet lung). Lung MPO increased significantly (p<0.001) after gut I/R, whereas doxy󰠀 cycline decreased lung MPO(p<0.001) in gut I/R rats.

Values are given as mean±S.E.

I/R : gut ischemia/reperfusion Doxy : Doxycycline

MPO ( U/g of wet lung)

0 5 10 15 20 25 30

하여 검정하였고 p<0.05를 유의하다고 인정하였다.

결 과

장의 허혈후 재관류에 따른 급성폐손상시 doxy󰠀

cyclin의 효과를 폐장의 산화성 스트레스와 연관하 여 알아본 본 실험의 결과는 다음과 같다.

1. 폐세척액내의 단백함량

장의 재관류 후 폐세척액 내의 단백함량은 1.00±

0.10 (mg/ml)으로서 대조군의 0.50±0.04에 비해 유의한(p<0.001) 증가를 보였다. 이것은 장의 재관 류에 의하여 폐장 내 모세혈관의 혈관내피세포의

손상에 따른 혈중 단백질이 폐포 및 간질쪽으로 이동한 것을 의미한다. 이에 비해 clamp전 doxycyclin을 투여후 장의 재관류를 시행한 군에 서는 폐세척액내의 단백함량이 0.49±0.05로 현저 히(p<0.001) 감소하여 doxycyclin에 의해 폐장의 손상이 감소됨을 시사하였다(Fig. 1).

2. 폐장내 MPO 활성도의 측정결과

장의 재관류후 폐장의 손상이 호중구의 침윤과 관 계가 있는지를 알아보기 위하여 폐장내 MPO의 활성도를 측정한 결과는 Fig. 2와 같다.

대조군에 있어서의 폐장 내 MPO의 활성도는 3.37±0.67(U/g of wet lung)이었으나 장의 재관류 후에는 22.78±3.76으로 유의하게(p<0.001) 증가하

(6)

Fig. 3. Effect of doxycycline on the generation of free radicals from isolated human neu󰠀 trophils. Comparing with unstimulated neutrophils, PMA-stimulated neutrophils generated more free radicals which resul󰠀 ted in the increased (p<0.001) reduction of cytochrome-c. Doxycycline decreased (p<0.001) the generation of free radicals from PMA-stimulated neutrophils.

PMA : phorbol myristate acetate Doxy : Doxycycline

*p<0.001, Control vs. PMA

#p<0.001, PMA vs. PMA+Doxy

Control PMA PMA+Doxy

Cytochrome - c reduced ( nmol / 2 X 106 cells)

0 20 40 60 80 100 120

였고 상장간동맥 clamp전 doxycyclin을 투여한 군 에서는 장의 재관류후 8.06±1.13으로서 재관류군 에 비해 유의한(p<0.001) 감소를 보였다. 이러한 결과는 장의 재관류에 의해 폐장 내의 호중구의 침윤이 증가하며 doxycyclin은 이러한 호중구의 침윤을 감소시킴을 보여주고 있다.

3. 호중구에서의 산소기 생성의 측정

호중구의 respiratory burst에 따른 산소기 생성에 미치는 doxycyclin의 효과를 알아보기 위해 cyto󰠀

chrome-c 환원검사를 시행한 결과는 Fig. 3과 같

다. 분리된 호중구에서 PMA를 가한 경우 대조군 의 11.32±1.71(nmol/2×10⁶ cells)에 비해 96.32±

1.89로서 현저한(p<0.001) 증가를 보였으나 PMA 첨가후 doxycyclin을 처리한 군에서는 27.40±2.64 로서 유의한(p<0.001) 감소를 보여 doxy󰠀cyclin이 호중구에서의 산소기 생성을 억제함을 알 수 있었 다.

4. 폐장에서의 산소기 생성의 확인

CeCl3 cytochemical electron microscopy를 이용하 여 폐장내 과산화수소의 생성을 검사하였다(Fig.

4).

대조군에서는 과산화수소와 cerium chloride의 반응물질인 cerrous perhy-droxide의 과립이 거의 보이지 않았으나(Fig. 4-a) 장의 재관류후에는 cerrous perhydroxide의 과립이 현저히 증가하였고 특히 제2형 폐포세포막을 따라 다량으로 관찰되었 다(Fig. 4-b). 상장간동맥 clamp전 doxycyclin을 투여한 군에서는 장의 재관류후에도 Fig. 4-c에서 보듯이 cerrous perhydroxide의 과립이 현저히 감 소하여 doxycyclin이 폐장내 산소기의 생성을 억 제함을 알 수 있었다.

5. 폐장의 PLA2 활성도의 검사

대조군의 폐장의 PLA2 활성도는 3.71±0.63(mU/g of wet lung)이었으나 장의 재관류 한 군에서는 37.86±5.40으로 증가(p<0.001)하였고 doxycyclin을 투여후 재관류를 시행한 군에서는 9.13±1.19로서 재관류군에 비해 유의하게(p<0.001) 감소하였다 (Fig. 5).

고 찰

장의 허혈-재관류에 따른 급성폐손상 특히 ARDS

(7)

(A)

(C)

(B)

는 PLA2의 활성화와 관계가 있다. 본 연구의 결과 에서도 보듯이 장의 재관류 120분 뒤에는 폐세척 액내의 단백함량이 현저히 증가하고 있다. 이러한 폐세척액내의 단백함량의 증가는 혈관내피세포의 손상을 의미하는 것으로 이것은 호중구의 침윤, PLA2의 활성화 및 이에 따른 호중구에서의 산소 기 생성이 그 원인 것으로 생각된다. 그 근거로는 폐장내 MPO 활성도의 증가, PLA2 활성도의 증가 및 세포화학적 방법으로 확인한 과산화수소의 증 가를 들 수 있다. 호중구의 침윤에 따른 조직손상 의 기전은 잘 알려져 있지만¹⁶ 급성폐손상에서의 호중구의 역할은 최근까지도 명확하지가 않다.

Repine등¹⁷은 호중구에서의 과다한 산소기의 유리 가 ARDS의 중요한 병인론을 차지한다고 보고하

고 있고 특히 Nilsson등¹⁸은 장의 허혈-재관류에 따른 급성폐손상은 XO의 작용에 따른 호중구에서 의 산소기 생성이 중요한 원인이라고 하였다. 침윤 한 호중구에서의 산소기의 생성은 PLA2의 활성화 와 관계가 있다. 즉 respiratory burst를 유발한 호 중구에 PLA2 억제제를 가하면 산소기의 생성이 억제된다는 점¹⁹을 통해서도 PLA2가 호중구에서의 산소기 생성에 관여한다는 점을 알 수 있으며 특 히 Dana 등²⁰은 PLA2의 활성화에 의해 생성되는 아라키돈산은 호중구막의 NADPH oxidase를 직접 활성화하여 산소기를 생성한다고 하였다.

본 연구에서는 장에서의 재관류가 폐장에서의 PLA2 활성도의 증가하는 원인을 제시하지 않았으 나 Lee 등²¹은 장에서의 재관류는 장조직, 혈장 및 Fig. 4. Doxycycline decreased the production of

free radicals in the lungs of gut I/R rats.

In Figure 4-a, the scanty distribution of cerous perhydroxide(arrow head) was shown. In contrast, in Figure 4-b, dense deposits of cerous perhydroxide were identified in the lungs of gut I/R rats, especially along the lining of the alveolar type I & II cells(arrow heads). In Figure 4-c, doxycycline had decreased the density of cerous perhydroxide in the lungs of gut I/R rats(arrow heads).

AL : alveolar lumen, T1 : alveolar type I cell, T2 : alveolar type II cell.

Bar indicates 0.2㎛

(8)

PLA2 ( mU/g of wet lung)

0 10 20 30 40 50

Fig. 5. Effect of doxycycline on the PLA2 activity in the lung. After gut I/R, PLA2 activity (mU/g of wet lung) increased significantly (p<0.001) compared with that of the lungs of control rats. In contrast, doxycycline decreased (p<0.001) PLA2 activity in the lungs of gut I/R rats.

I/R : gut ischemia/reperfusion Doxy : Doxycycline

폐장에서의 platelet activating factor의 농도를 증 가시키며 또한 폐장조직에서의 PLA2의 활성도가 증가한다고 보고하고 있다. PAF는 동시에 PLA2를 활성화시키는 것이 알려져 있어서²² 장의 재관류로 생성된 PAF가 일종의 체액성인자로 작용할 가능 성도 있다.

호중구에서의 산소기 생성에 관여하는 PLA2는 분자량에 따라 cytosolic형과 분비형으로 구분되는 데 이중 분비형 중에서도 groupII 형은 급성폐손상 에 관여함이 알려져 있다²³. Pruzanski등⁹은 doxy󰠀

cyclin이 이 groupII PLA2의 억제제로 작용함으로 써 항염증 작용을 나타낸다고 하였다.

본 연구결과에서도 보듯이 doxycyclin은 폐장의 PLA2의 활성도를 감소시키고 그에 따른 호중구

침윤의 감소 및 호중구에서의 산소기생성의 감소, 조직에서의 과산화수소의 감소를 유도함으로써 조 직에서의 산화성 스트레스를 감소시키고 있다.

Flavonoid중 rutin은 groupII PLA2의 선택적 억제 제로 알려져 있고²⁴ 장의 재관류에 의해 발생하는 급성폐손상 경감의 효과가 있다. 또한 Koike등²⁵은 groupII PLA2억제제를 이용하여 장의 재관류에 따 른 급성폐손상의 감소효과를 제시하고 있다. 이러 한 연구결과들은 groupII PLA2억제제인 doxy󰠀

cyclin의 효과를 확인한 본 실험의 결과와 일치하 는 것이어서 흥미롭다.

장의 재관류후에 발생하는 급성폐손상에는 PLA2외에도 다른 인자가 관여하므로 PLA2의 억제 만으로는 급성폐손상의 완전한 치료를 기대할 수 없다고 생각되지만 아직까지 ARDS에 대한 적절 한 치료제가 개발되어 있지 않다는점, 그리고 결과 에서 보듯이 doxycyclin이 PLA2를 억제하여 급성 폐손상이 감소한다는 점을 감안할 때 doxycyclin 이 어떤 기전에 의해 PLA2를 억제하는지를 연구 하면 ARDS의 치료제로도 사용될 가능성이 있지 않나 사료된다.

요 약

연구배경 :

장의 재관류로 발생하는 급성폐손상에서 group II PLA2의 억제제로 알려진 doxycyclin의 치료효과와 그 작용기전을 알아보기 위하여 본 연구를 시행하 였다. 특히 장의 재관류에 의한 급성폐손상이 호중 구에 의한 산화성 스트레스에 의하며 이 과정에서 group II PLA2가 관여한다는 사실에 근거하여 doxycyclin의 산화성 스트레스억제를 확인하는 것 이 본 연구의 목적이었다.

방 법 :

체중 300g 내외의 Sprague-Dawley 흰쥐에서 상 장간막동맥을 60분간 clamp한 뒤 120분간의 재관

(9)

류를 시키면 급성폐손상이 유도된다. 이때 호중구 에 의한 산화성스트레스가 유발되고 여기에 PLA2

가 관여하는 것을 관찰하기위해 lung leak, lung MPO 활성도, CeCl3 cytochemical electron micro󰠀

scopy, cytochrome-c reduction assay 및 lung PLA2 활성도를 측정하였다. 또한 doxycyclin의 효 과를 확인하기 위하여 doxycyclin hyclate(10mg/

kg)를 복강내 주사한 뒤 위에서 언급한 모든 parameter를 측정, 비교하였다.

결 과 :

장의 재관류로 유도된 급성폐손상에서 doxycyclin 은 폐손상을 감소시켰는데 이것은 doxycyclin에 의한 lung MPO, 산소기생성, lung PLA2 활동도의 감소에 의한 것으로 생각되었다.

결 론 :

장의 재관류로 유도된 급성폐손상은 호중구에서 생성되는 산소기, 특히 PLA2의 활성화에 의해 생 성된 산소기에 의한 것으로 생각되며 이때 doxycyclin은 PLA2를 억제하여 산화성 스트레스를 감소시킴으로서 폐손상의 감소를 가져오는 것으로 생각된다.

참 고 문 헌

1. Donnelly SC, Robertson C. Trauma, inflam󰠀

matory cells and ARDS. Arch Emerg Med 1993;10:108-111.

2. Viejo A, Goodyear-Bruch C, Pierce JD. Oxi󰠀

dative stress in critically ill patients. Am J Crit Care 2002;11:543-55.

3. Koike K, Moore EE, Moore FA, Kim FJW, Carl VS, Banerjee A. Gut Phospholipase A2

mediates neutrophil priming and lung injury after mesenteric ischemia-reperfusion. Am J Physiol 1995;268:G397-403.

4. Terada LS, Dormish JJ, Shanley PF, Leff JA, Anderson BO, Repine JE. Circulating xanthine oxidase mediates lung neutrophils sequestration after intestinal ischemia/reper󰠀

fusion. Am J physiol 1992;263:L394-L401.

5. Anderson BO, Moore EE, Banerjee A.

Phospholipase A2 regulates critical inflam󰠀

matory mediators of multiple organ failure. J Surg Res 1994;56:199-205.

6. Matthay MA. Conference summary : Acute lung injury. Chest 1999;116:119S-26S.

7. Tsukahara Y, Morisaki T, Horita Y, Torisu M, Tanaka M. Phospholipase A2 mediates nitric oxide production by alveolar macro󰠀

phages and acute lung injury in pancreatitis.

Ann Surg 1999;299:385-92.

8. Ljungman AG, Christer T, Lindahl M.

Endotoxin stimulates the expression of groupII PLA2 in rat lungs in vivo and in isolated perfused lungs. Am J Physiol 1996;

270:L752-76.

9. Pruzanski W, Greenwald RA, Streat IP, Laliberte F, Stefanski E, Vadas P. Inhibition of enzymatic activity of phospholipase A2 by minocyclin and doxycyclin. Biochem Phar󰠀

macol 1992;44:1165-70.

10. Brown RE. Jarvis KL, Hyland KJ. Protein measurement using bicinchoninic acid : elimi

󰠀nation of interfering substance. Anal Bio󰠀

chem 1989;102:1152-60.

11. Goldblum SE, Wu KM, Jay M. Lung myelo󰠀

peroxidase as a measurement of leukostasis in rabitts. J Appl Physiol 1985;59:1978-85.

12. Haslett C, Guthrie LA, Kopaniak MM, Johnston Jr RB, Henson PM. Modulation of

(10)

multiple neutrophil functions by preparative methods or trace concentration of bacterial lipopoly saccharides. Am J Pathol 1985;119:

101-10.

13. Botha AJ, Moore FA, Moor EE, Fontes B, Banerjee A, Peterson VM. Post injury neu󰠀

trophil priming and activation state : ther󰠀

apeutic challenges. Shock 1995;3:537-66.

14. Karnovsky MJ. Robert Feulgen Lecture 1994.

Cytochemistry and reactive oxygen species : a retrospective. Histochemistry 1994;102:15- 27.

15. Katsumata M, Gupta C, Goldman AS. Rapid assay for activity of phospholipase A2 using radioactive substrate. Anal Biochem 1986;154:

676-81.

16. Weiss SJ. Tissue destruction by neutrophils.

N Engl J Med 1989;320:365-76.

17. Repine JE. Interleukin-1 mediated acute lung injury. Environ Health Perspec 1994;102(suppl 10):75-8.

18. Nilsson UA, Schoenberg MH, Aneman A, Poch B, Magadum S, Berger HG et al. Free radicals and pathogenesis during ischemia and reperfusion of the cat small intestine.

Gastroenterology 1994;106:629-36.

19. Lee YM, Hybertson BM, Terada LS, Repine AJ, Cho HG, Repine JE. Mepacrine decreases lung leak in rats given interleukin-1 intr󰠀

atracheally. Am J Respir Crit Care Med 1997;155:1624-8.

20. Dana R, Leto TL, Levy R. Essential reguire󰠀

ment of cytosolic PLA2 for activation of the phagocyte NADPH oxidase. J Biol Chem 1998;273:441-5.

21. Lee YM, Park Y. PAF contributes to intestinal ischemia/reperfusion -induced acute lung injury through neutrophilic oxidative stress. Korean J Physiol Pharmacol 1999;3:

405-14.

22. 권영식, 이영만. Platelet-activating factor에 의 한 급성폐손상에서 호중구 에의한 산화성스트 레스에 관여하는 phospholipase A2 활성도의 변화. Unpublished Date

23. 전상훈, 김 근, 이상철, 이종태, 김성은, 이영 만. 장의 허혈-재관류로 유도 된 급성폐손상에 서 산화성스트레스에 관여하는 groupII pho󰠀

spholipase A2 의 역할. 대한흉부외과학회지 2002;35:501-10.

24. Lindahl M, Tagesson C. Flavonoids as pho󰠀

spholipase A2 inhibitors : Importance of their structure for selective inhibition of groupII phospholipase A2. inflammation 1997;21:347- 56.

25. Koike K, Yamamoto Y, Hori Y, Ono T.

group IIA phospholipase A2 mediates lung injury in intestinal ischemia-reperfusion. Ann Surg 2000;232:90-7.