쌀 및 즉석밥의 미생물학적 안전성 확보를 위한 내열성 포자 형성균 및 포자 제어 기술 개발
이민석 고려대학교 식품공학부
1. 서 론
1.1 연구개발의 요약
연구의 필요성 연구내용 3. 쌀의 품질변화 측정
■ 주식인 쌀의 미생물(포자형성균 및 포자 잔존)에 의한 잠재적 위해를 제어해야 함
■ 수요 및 판매량이 꾸준히 증가하고 있는 즉석밥의 안전성 확보 요구 증가
■ 적용 가능한 저감화 조건을 모색하기 위하여 처리 전/후 쌀의 품질변화 측정
■ 경도, 색도, 수분활성도
■ 이를 고려하여 최적 조건 확립
연구내용 1. 저감화 효과 확인(단일, 조합) 최종 목표
■
■ 초임계 이산화탄소의 다양한 조건(온도, 압력, 시간)에 따른 저감화 효과
■ 주정의 다양한 조건(농도, 시간)에 따른 저감화 효과
■ 단열처리의 실험 결과를 바탕으로 조합 처리 수행
■ 가장 효율적인 최적조건 확립
■ 쌀의 품질변화를 최소화하는 저감화 조건 확립
■ 쌀의 미생물학적 안전성 확보
■ 즉석밥 등의 쌀 가공품에 활용
쌀 및 즉석밥의 안전성 확보
1.2 연구개발의 목적
포자 생성균/포자 저감화
■ 주정과 초임계이산화탄소의 저감화 효과 확인
■ 단일처리 조건 최적화
■ 조합처리 조건 최적화
■ 쌀의 미생물학적 안전성 확보를 위한 내열성 포자 형성균 및 포자 제어기술 도입
■ 즉석밥 및 기타 쌀 가공품에 적용
품질변화 측정
최종목표
■ 처리 전후 품질변화 측정
■ 색도, 경도, 수분흡습도
■ 품질을 고려한 최적 처리 조건 확립
1.3 연구개발의 필요성
사회적 측면
요약 국민들의 식품안전에 대한 불안감이 고조되고 있는 상황에서 우리나라의 주식인 쌀의 안 전성 확보는 필수 과제임.
쌀을 주재료로 하는 즉석밥의 경우 수요 및 판매량이 꾸준히 증가하고 있으나 Bacillus cereus, B. subtilis 같은 포자 형성균의 미생물학적 위해를 제어할 수 있는 효과적인 살균방 법은 현재까지 정립된 바 없음.
본 연구에서는 쌀에서의 내열성 포자 형성균과 포자를 제어할 수 있는 방안을 제시함으 로써 쌀과 즉석밥의 안전성 향상에 기여하고자 함.
• 식품의 안전성은 국민 보건과 직결되는 주요 문제로 우리나라 식중독 발생건수는 2003년 135건 에 환자 수 7,909명에서 매년 대체적으로 증가하여 2007년에는 510건에 환자 수 9,686명, 2008년에 는 354건에 환자 수 7,487명으로 보고되었음(식품의약품안전청, 2009). 이처럼 식중독발생 사건은 매년 증가하고 있으며 날로 집단화·대형화되는 추세임.
• 최근 집단 식중독 및 식품 중 이물 검출 사건 등 식품안전사고가 빈번히 발생함에 따라 식품 안전에 대한 국민들의 관심이 증대되고 있으며 식품의 안전성 확보에 대한 요구가 점차 높아
지고 있음. 이러한 상황에서 우리나라의 주식인 쌀에 대한 안전성 확보는 필수적 과제임.
• 농산품을 매개체로 한 식중독은 계속 증가하고 있으며 우리나라 식중독 발생 병원균도 다양한 형태로 출현되고 있음. 미생물학적 위해에 대한 쌀의 안전성 문제도 절대 간과될 수 없으며 식중 독을 미연에 방지할 수 있는 대책 마련이 필요함.
• 특히 최근 여성의 사회진출, 독신가구나 미혼가구 수 증가에 따른 현대인의 식생활 변화로 인하 여 쌀을 주재료로 한 다양한 종류의 쌀가공 식품이 출시되고 있으며, 특히 즉석밥의 수요가 가장 빠른 속도로 성장하여 그 소비시장이 증가하고 있음.
• 이러한 추세를 반영하여 식품의약품안전청은 즉석편의식품의 안전관리를 강화하고자 2007년 즉석섭취·편의식품류의 정의와 기준을 개정하여, B. cereus의 미생물 기준규격을 즉석섭취·편의식 품류의 즉석섭취식품, 신선편의식품에 대하여 1,000CFU/g 이하로 관리하도록 규정하고 있음.
• 즉석밥은 즉석섭취·편의식품류 중 즉석조리식품에 해당하며 미생물 기준규격으로는 일반세균 100,000CFU/g 이하, Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Vibrio parahaemol yticus 음성으 로 기준이 설정되어 있으나 B. cereus에 대한 기준규격은 설정되지 않은 실정임.
• 그러나 B. cereus, B. subtilis 등과 같이 내열성 포자를 형성하는 미생물은 높은 열처리 공정 후 에도 생존할 가능성이 있으며, 실제로 가공 처리 후 식품이 오염된 사례가 보고되어 소비자의 불만이 증가하는 추세임. 다음은 관련 기사를 요약하였음.
“곰팡이로 ‘도배’된 즉석밥” “흰색, 노란색, 검은색 곰팡이 범벅”...제보 잇달아 소비자가 만드는 신문 2008.09.19
“유통과정에 이렇게 변질되면 유통기한이 무슨 의미가 있습 니까?” 즉석밥이 곰팡이 범벅상태라는 소비자 제보가 또 접 수됐다. 본지에 제보된 건만 벌써 올 들어 2차례다.
특히 즉석밥의 곰팡이 원인이 포장 불량에 따른 것으로 분 석하면서도 보완 대책이 이루어지지 않고 있어 소비자불신 은 더욱 높아질 전망이다.
#사례 1 - 서울 대림동의 김모씨는 지난 8일 즉석밥 묶음판 매 제품을 여러 개 구입했다.
미군부대에 근무 중인 김씨는 평소 외부 식당 등을 이용하기 쉽지 않아 이른 아침이나 점심식
• 즉석밥의 경우 가공 공정상 미생물을 제어하기 위한 고온 가열처리를 수행하지만 내열성 포자 는 가열처리에도 생존하여 최종 제품에서 문제를 일으킴.
• 따라서 B. cereus, B. subtilis 등과 같은 내열성 포자 형성균에 대한 원료 단계 제어가 필수적으로 요 구되지만 아직까지 이와 같은 위해세균을 완벽히 제어할 만한 기술은 확립되어 있지 않음.
• 따라서 쌀 및 즉석밥을 안심하고 소비할 수 있도록 기초연구개발을 통한 관련 산업체 기술지 원 및 효율적 관리방안이 절대적으로 필요한 실정임.
• 우리나라의 주식인 쌀과 그 가공식품인 즉석밥의 안전성 확보는 소비자들에게 신뢰를 심어주 고, 안심하고 소비할 수 있는 건전한 문화를 창출할 수 있음.
경제적 측면
요약 우리나라 식중독 사고로 인한 경제적 손실은 매년 증가하고 있으며 농산가공품에 의한 식중독 또한 증가추세에 있음.
즉석밥의 수요·판매량이 증가하고 있는 시점에서 이를 매개로 한 내열성 포자 형성균 및 포자에 대한 안전성 확보 방안의 미비는 관련업체에 커다란 경제적 손실을 야기할 수 있음.
비용, 시간, 인력문제에 대한 부담을 해소시키기 위하여 미생물학적 안전성을 확보할 수 있는 효과적인 저감화 기술이 필요함. 이는 소비자의 보호뿐만이 아니라 관련 농가·산업 체의 소득 향상까지 가져올 수 있을 것으로 기대됨.
• 우리나라의 식중독 사고로 인한 직접 사회경제손실은 매년 1조 3,000억 원 이상이며(한국보건사업 진흥원, 2001), 보건 분야 지출 총액은 54조 7,000억 원을 넘어서고 있어 식중독 저감화 대책은 국 가 차원의 근본 과제임(한국은행 정부 통계, 2007).
• 미국의 경우 식품을 매개체로 하여 연간 500만 건의 질병이 발생하고 약 5,000명이 사망하는 것으 사 대용으로 즉석밥을 즐겨 이용해왔다.
9일 아침 즉석밥을 먹으려고 데워 비닐 팩을 벗겨보니 희고 노란 곰팡이가 가득한 것이 눈에 띄 었다. 확인한 유효기간은 2009년 2월까지였다.
#사례 2 - 충남 아산의 유모씨는 지난 5월 17일 자녀들의 식사를 챙기던 중 가끔 이용하던 밥 을 먹이려고 개봉하다 깜짝 놀랐다. 밥은 시커멓게 변질되어 곰팡이가 가득했다. 유통기한은 6 월 30일까지였고 포장상태에서도 아무런 이상을 찾을 수 없었다.
로 알려져 있으며(Mead 등, 1999), 식중독으로 인한 사회경제손실이 41조 원($350억)에 달하고 있 음(미국 질병예방관리센터 통계, 2008). 이처럼 식중독 발생 건수 및 이로 인한 사회·경제적 손실은 점차 증가하는 추세임.
• 한편 바쁜 현대인의 가정식 대용으로 개발된 쌀가공식품(즉석밥, 떡, 쌀떡볶이 등)에 대한 소비자 수요가 증가하는 추세에 있으며, 특히 즉석밥의 경우 시장규모가 10년 만에 12배로 급증하였으며 (1988년 10억 원 규모에서 1,200억 원대) 매년 15%의 높은 신장세로 수요·판매량이 크게 증가하고 있음(한국쌀가공식품협회, 2008).
• 현재 우리나라는 쌀의 소비가 줄고, 수입쌀의 수량도 늘어나면서 공급이 수요를 웃돌고 있는 상 황임. 따라서 과잉재고에 따른 새로운 수요처 창출을 위한 쌀가공 식품산업은 매년 성장을 거듭 하고 있음(그림 1).
• 우리나라의 가공용 쌀 소비는 2001년 6만 7,000톤을 기록한 이후부터 매년 증가하여 2007년 에는 1만 1,000톤으로 2006년의 97만 톤보다 3만 톤가량 늘어난 것으로 나타났음.
• 농림수산식품부는 최근 국산 쌀 소비량 증진을 목적으로 쌀 가공식품산업을 집중 육성하여 현 재 1조 원 수준인 쌀 가공식품시장 규모를 2012년까지 2조 원으로 키우겠다고 밝힘(농림수산식 품부, 2008).
• 이에 쌀떡볶이·쌀국수·즉석밥 등 쌀 가공식품 시장을 성장시키고 가공면 시장 등의 개발을 통해 신규 수요를 창출함으로써 연간 가공용 쌀 수요를 22만 톤에서 44만 톤으로 확대하겠다는 계획 을 발표하였음(농림수산식품부, 2008).
• 이와 같이 시장의 잠재적 발전 가능성이 큰 쌀에서 위해·부패세균의 등장은 소비자뿐만 아니라 관 련업체에 커다란 경제적 손실을 야기할 수 있으므로 이를 해결할 수 있는 획기적 저감화 기술이 요 구됨.
• 쌀의 미생물학적 안전성 확보는 소비자만이 아니라 생산자도 모두 보호하여 비가시적인 매우 큰
(단위: 만 톤) 12
10 8 6 4 2 0
1998년
7.8 7.4 7.4 7.4 8.5 9.2 9.6 9.7 10.1 6.7
411 407 396 495 550 587 610 579 554 556 가공
업체수(개)
2000년
’99 ’01 ’02 ’03 ’04 ’05 ’06 ’07
경제적인 효과를 산출할 수 있음.
• 따라서 본 과제에서는 쌀의 품질 변화를 최소화하면서 실제 산업체에서 적용 가능한 최적의 저감 화 조건을 제시할 것임. 이는 쌀에 대한 소비자의 신뢰 확보뿐만 아니라 관련 농가·산업체의 소득 향상까지 가져올 수 있을 것으로 기대됨.
기술적 측면
요약 쌀 및 쌀 가공품에서 내열성 포자를 생성하는 Bacillus spp.를 포함한 열 저항성 미생물 검 출이 다수 보고됨.
초임계 이산화탄소는 식품산업에 적용 가능한 최적 살균기술로 각광받고 있음.
본 과제에서는 초임계 이산화탄소와 주정의 단일처리 및 조합처리를 수행하여 내열성 포 자 형성균의 저감화 방안을 모색하고자 하며, 쌀의 품질변화를 최소화하면서 최대의 미 생물 저감화 효과를 나타내는 최적 조건을 제시하고자 함.
• 식품산업에 있어서 가장 중요한 과제는 식품안전성을 확보하는 것과 식품 본연의 품질을 유지한 상태로 유통기간을 연장하는 것임. 현재까지 국내 농산물은 품질면에서는 일정 수준에 도달하였 으나, 식품으로서의 안전성은 그 중요성에 비해 위생적 관리 측면이나 소비자 신뢰도 측면에서 낙 후되어 있는 실정임.
• 쌀은 우리나라의 전통적 주식으로 관련 식품의 미생물학적 안전성 확보는 전통적 식문화의 근간 이라 할 수 있음. 따라서 이러한 쌀 및 즉석밥에서의 미생물학적 위해요소에 대한 꾸준한 연구와 관리가 필요함.
• 쌀에는 25, 37℃에서 생장하는 호기성 중온균뿐만 아니라 50, 60℃에서 생장가능한 고온성 세균 또한 상당수 존재하는 것이 보고됨(박 등, 2003).
• 이러한 결과에 따르면 쌀에는 산지나 품종별로 약간의 차이는 있으나 쌀에서 일반 세균이 다수 검출되어 쌀을 주원료로 하는 식품의 미생물학적 관리가 필요한 것으로 나타남.
• 한편 최근까지 연구된 바에 의하면, 여러 가지 비가열 살균방법은 향미성분 및 영양소의 파괴, 독 성이 있는 부산물의 생성, 물리·화학 및 광학적 특성의 변화 등을 유발하지 않는 장점이 있어 전 통적으로 이용되던 살균방법을 대체·보조할 수 있는 방법으로 잠재가치가 큰 기술임.
• 그중에서도 고압의 이산화탄소를 사용하는 초임계 이산화탄소 처리법이 비가열 살균방법 중 가 장 유망한 기술로 알려져 있음(Spilimbergo와 Bertucco, 2003).
• 초임계 이산화탄소는 비교적 낮은 임계조건(임계온도=31.1℃, 임계압력=73.8bar)을 지녀 고압기체 처리법이나 단순 열처리에 비해 낮은 수준의 온도·압력 조건에서 생성될 수 있는 기체와 액체의 중 간 성질의 이산화탄소임.
• 기체의 빠른 확산력과 액체의 높은 침투력을 지니기 때문에 살균처리 시 높은 수준의 위해 미생물 저감화 효과를 기대할 수 있음.
• 뿐만 아니라 비용이 저렴하면서 대상 물질과의 반응성 및 부식성이 없을 뿐 아니라 회수가 용이하 며 자체 독성이 없어 식품산업에의 적용이 적합한 것으로 판단됨(Zhang 등, 2006).
• 따라서 식품의 이화학적 변화 및 에너지 절감을 통한 공정의 효율성과 경제성을 높일 수 있음.
• 발효주정은 탈수작용으로 원형질을 분리시켜 미생물을 사멸시키므로 초임계 이산화탄소로 세포 가 파괴된 미생물에 더 큰 사멸효과를 보일 수 있으므로 이를 초임계 이산화탄소와 조합처리 시 더 큰 미생물 저감화 효과를 모색할 수 있을 것으로 판단됨.
• 본 연구에서 수행하고자 하는 안전성 확보 저감화 기술은 향후 산업체 이용에 지대한 영향을 미 칠 것으로 판단되며 소비자의 식품위생안전성과 관련된 중요한 정보를 제공할 수 있을 것임.
1.4 국내·외 관련기술의 현황
Bacillus cereus와 Bacillus subtilis의 특성
• Bacillus spp.는 그람양성, 간균, 통성혐기성, 내열성 포자 생성균으로 토양과 물에 널리 존재하는 미생물로(Paul과 Diana, 1978) 포자낭과 포자의 형태에 따라 3그룹으로 분류되며(Smith 등, 1946, 1952), 이 중 B. cereus, B. subtilis, B. licheniformis, B. pumilis는 식중독을 일으키는 것으로 알려져 있 음(Adams와 Moss, 1995).
• 그중 가장 대표적인 식중독 원인균인 B. cereus는 토양, 물, 먼지 등에 널리 존재하며 특히 곡물이 나 채소와 같은 토양을 기반으로 하는 식품에서 다수 검출되고 있음(Fang 등, 2003; Goepfert 등, 1972; Johnson, 1984; Norris 등, 1981; Pirttijarvi, 1999).
표 1 쌀의 품종별 고온성 세균수의 분포(박 등, 2003) (CFU/g rice)
Items Variety 50℃ 60℃
Growing land
Ganchuck rice A 4.3 × 102 0.2 × 102
Ganchuck rice B 3.1 × 102 0.1 × 102
Milled rice A 2.7 × 102 0.3 × 102
Milled rice B 3.2 × 102 0.1 × 102
Milled rice C 1.1 × 102 _
Milled rice D 0.3 × 102 _
Milled rice E 2.7 × 102 0.5 × 102
Milled rice F 1.9 × 102 0.4 × 102
• 1887년에 Frankland와 Frankland는 처음으로 B. cereus를 분리·동정하였으며, 1950년에 Hauge는 B.
cereus가 식중독의 원인이 된다는 사실을 밝힘.
• B. cereus는 운동성을 가지고 있고(Min 등, 1987), 최적 생존온도는 30~40°C(최소 온도; 4°C, 최 대 온도; 55°C), 최적 pH는 6.0~7.0(최소 pH; 5.0, 최대 pH; 8.8), 최소 Aw는 0.93으로 알려져 있음 (Roberts 등, 1996).
• B. cereus는 설사형과 구토형, 두 가지 종류의 식중독을 일으키는 것으로 알려져 있으며(Granum, 1997), 설사형은 잠복기가 8~16시간으로 설사와 복통을 유발하고, 육가공품, 채소류, 우유, 유제 품 등이 원인 식품임. 구토형은 잠복기가 30분~5시간으로 비교적 짧으며, 구토와 오심을 수반하 고 볶음밥이나 파스타, 국수 등 면류에서 주로 기인하는 것으로 알려져 있음.
• B. cereus로 인한 식중독은 emetic toxin과 enterotoxins(diarrheal toxin)에 의해 발생하며(Adams, 1995; Thomas와 Karl, 2008), emetic toxin은 열과 pH에 매우 안정하여 126°C에서 90분간 가열하여 도 파괴되지 않기 때문에 일반적인 조리방법으로는 제거할 수 없어 위험성이 큼(Kramer와 Gilbert, 1989; Mellong과 Capel, 1978; Turnbull 등, 1979). Enterotoxin은 5종 이상 존재하며 그중 3종이 식중 독의 원인이 되는 것으로 알려져 있으며(Thomas와 Karl, 2008), 열에 매우 민감하기 때문에 56°C에 서 5분간 가열하면 쉽게 파괴됨(Turnbull 등, 1979).
• B. cereus의 포자는 내열성이 매우 크기 때문에 일반적인 조리온도에서 살아남아 발아하여 식중독 의 원인이 될 수 있음. 또한 물리·화학적 처리에 매우 강해 B. cereus가 내열성 포자를 생성하면 제어 가 매우 어려움(Finlay, 2002; Rönner, 1990).
• B. subtilis 또한 토양, 물, 식물 등에 널리 존재하며(Ackermann, 1995), 1936년 Second International Congress for Microbiology에서 분류 및 정의되었음. B. subtilis는 식중독과 관련이 있는 것으로 알 려져 있으며, 특히 식품의 부패의 원인이 됨(Gilbert 등, 1981; Kramer 등, 1982).
• B. subtilis의 포자는 바람을 통해 쉽게 이동하며(Jaenicke, 2005; Merrill, 2006), B. cereus 포자와 마 찬가지로 내열성이 강하기 때문에 식품에서 제어하기 매우 어려움(Jagannatha, 2005).
Bacillus cereus와 Bacillus subtilis 제어 기술 현황
• B. cereus와 B. subtilis는 자연계에 널리 분포하지만 내열성 포자를 생성하므로 제어하기 어려운 균 으로 다음과 같은 저감화 연구가 진행되었음.
• Sarrías 등(2003)은 도정한 쌀을 electron beam irradiation 3.4KGy로 처리하여 B. cereus 영양세포의 3.40log CFU/g 저감화를 확인하였으며, 7.5kGy 처리 시에는 포자가 약 3.00log CFU/g 저감화되었 음.
• Uemura와 Isobe(2003)는 pressurized electric treatment(16.3kV/cm, 121°C, 1s)를 처리하여 오렌지주스 내의 B. subtilis 포자를 5log CFU/g 저감화하였으며, 전통적인 살균방법보다 ascorbic acid의 함량
과 향미가 덜 감소하는 것을 확인하였음.
• Pina-Pérez(2009)는 우유 속의 B. cereus를 저감화하기 위하여 pulsed electric fields(15kV/cm, 1,900µs) 와 CocoanOX 12%를 처리 시 2.7log CFU/g의 감소효과를 확인하였음.
• 이와 같은 처리는 뛰어난 효과를 나타내었으나, electron beam irradiation의 경우 소비자들이 강한 거부감을 가지고 있으며, 각종 첨가제의 경우에도 최신 소비자 동향에 부합하지 않음.
• Pressurized electric treatment와 pulsed electric fields 등은 높은 온도 처리조건으로 인한 품질저하와 고에너지 소비로 인한 경제적인 문제가 발생하므로 실제 식품산업에서 적용하는 것은 어려움이 있 음.
• 또한 대부분의 Bacillus spp. 저감화 연구는 액상식품(우유, 주스 등)에서 진행된 것으로, 고체식품 인 쌀에 적용하는 데는 한계가 있음.
• 최근 소비자 동향에 부합하면서, 품질변화를 최소화하며 고체식품에 적용하기 위해서는 새로운 저감화 방법의 개발이 요구되고 있음.
국내·외 주정 및 초임계 이산화탄소 관련 기술의 현황
1) 발효주정 기술현황
• 발효주정은 전분질(쌀, 보리쌀, 옥수수, 고구마) 또는 당질(과당 등) 원료를 발효시킨 후 증류하 여 알코올 95%로 농축한 것으로 무색투명하며, 방부성과 소독 효과를 가지며 휘발성이 높음.
• 일반적으로 60~75%의 고농도 알코올은 단백질을 변성시키거나 지방성분을 분해하여 세포벽을 파괴하는 것으로 알려져 있으며(Dillon과 Cook, 1994), 저농도 알코올(5~20%)은 수분활성도를 낮 춰서 미생물의 생장을 저해하기 때문에 유통기한의 연장 목적으로 식품산업에서 장류, 면류, 어묵 류, 소시지류 등의 가공공정에서 널리 사용되고 있으며, 또한 기구와 작업자의 손 등의 제균에도 이용되고 있음(Seller와 Russell, 1991).
• Shapero 등(1978)은 2, 4%의 알코올 처리로 Staphylococcus aureus의 살균 효과를 확인하였으며, Oh 와 Marshall(1993)은 5%의 알코올 처리가 Listeria monocytogenes를 저해하는 것을 확인하였음. 또 한 70%의 알코올 처리는 rif ampicin-resistant Salmonella serotype Typhimurium을 5.2log CFU/g 저 감화시키는 것으로 나타났음(Mies, 2004).
2) 초임계 이산화탄소 기술현황
• 초임계 이산화탄소(supercritical fluid)란 어떤 물질의 임계점(임계압력 73.8 bar, 임계온도 31.1°C) 이 상에 존재하는 액체도 아니고 기체도 아닌 상태로 존재하며 고압상태에서도 더 액화되지 않는 이 산화탄소를 지칭함(Ely와 Baker, 1983; Stahl, 1987).
• 초임계 유체는 임계점 이상의 온도와 압력의 변화에서는 더 이상 상 변화가 일어나지 않으며, 확산
계수, 밀도, 점도와 같은 특성은 액체와 기체의 중간값을 갖는데, 이 값은 온도와 압력을 변화시 켜 조절할 수 있음(Reverchon, 1999).
• 밀폐된 공간에서 액체를 가열하면 기체-액체선을 따라 압력이 증가하게 되는데, 기체의 밀도는 점 점 증가하고 아래층의 액체의 밀도는 낮아지게 되고, 그 결과 기체와 액체의 경계가 사라지게 되어 기체와 액체의 밀도가 동일하게 됨.
Solid
Temperature/K Liquid
Triple point Gas
Supercritical Fluid
Critical point
304.1 73.8
Pressure/bar
그림 2 Phase transition of carbon dioxide with temperature and pressure(Oakes, 2001).
• 고압의 이산화탄소가 미생물을 불활성화시키는 효과가 있다는 것은 1950년대 Fraser 등(1951)이 34기압에서 대기압으로의 급격한 압력 저하가 세균을 무력화시킴을 보고한 후, 식품에서의 살균 공정은 1969년에 Kauffman 등(1969)에 의해 방사선 조사와 함께 사용되어 그 효과를 인정받았으 며, 약 15년 전부터 본격적으로 연구되고 있음.
• 최근에는 식품이나 의료산업의 발전과 제품의 고급화에 따라 향미손실, 성분의 변성, 물리기계학 적 변화 등을 최소화하기 위해 비가열성 살균방법의 개발이 절실히 요구되고 있어 초임계 이산화 탄소를 이용한 살균 방법은 크게 주목받고 있음.
• 기존의 고압만을 이용한 살균방법과는 달리 물리화학적 효과를 지닌 초임계 이산화탄소에 의 한 미생물 사멸화 기작은 다음과 같이 요약됨(Kennedy, 1992; Ishikawa, 1995; Hong과 Pyun, 2001;
Spilimbergo와 Bertucco, 2003).
1. 이산화탄소에 의한 세포질의 산성화 2. 내압에 의한 세포의 파괴
3. 세포막의 변성 및 세포벽 지질의 추출
4. 대사관련 중요 효소의 불활성화 5. 세포내 성분의 추출
• 최근에 가장 주목받는 미생물 사멸 기작은 Garcia-Gonzalez 등(2007)이 제시한 이산화탄소 침투로 인한 세포내 대사 정지 기작임.
• 이 기작은 총 7단계로 이루어지는데, (1) 세포벽에 존재하는 수분에 이산화탄소가 용해되어 침투 하면서 (2) 세포벽이 변성을 일으키고 (3) 세포내 pH가 낮아지면서 (4) 세포내 효소활동과 대사 작 용이 저해를 받기 시작하고 (5) 용해된 이산화탄소와 HCO3- 가 세포내에서 직접적인 대사 작용의 저해를 일으키면서 (6) 세포내 전해질 균형이 깨지게 되어 (7) 세포내 대사활동 성분이 추출되어 세 포가 사멸하게 되는 과정임.
• Dillow 등(1999)은 다양한 미생물(B. cereus, Listeria innocua, S. aureus, Salmonella sal f ord, Pseudomonas aeruginosa, E. coli, Preoteus vulgaris, Legionella dunnifii)을 완전히 살균했는데, 수분이 존재하는 상태의 E. coli는 34℃에서 30분 만에 8.00log CFU/g 저감효과를 보였으나 건조상태에서 는 60분이 소요됨.
① a phospholipid bilayer, ② integral membrane proteins,
③ a plasma membrane H+-ATPase, ④ intracellular substances
그림 3 A schematic diagram of how pressurized CO2 may exert its lethal action on bacteria(Garcia-Gonzalez 등, 2007).
Reactor headspace
STEP 1
STEP 1
STEP 2
STEP 5
STEP 3
STEP 7
STEP 6
STEP 4 Suspending
medium
Plasma
membrane Cytoplasm
Reactor headspace
STEP 1
STEP 1
STEP 2
STEP 5
STEP 3
STEP 7
STEP 6
STEP 4 Suspending
medium
Plasma
membrane Cytoplasm
• Hass 등(1989)은 다양한 식품에 있어 이산화탄소의 항미생물적 작용을 성공적으로 증명하였고, Hong과 Pyun(1999)은 배추김치에서 24시간 동안 70atm에서 초임계 이산화탄소를 처리한 결과 젖 산균이 저감되었으며, 색, 풍미, 그리고 조직감에서 큰 변화가 없음을 관찰함.
• Ishikawa 등(1997)은 B. subtilis, B. cereus, Bacillus megaterium, Bacillus polymyxa 포자활성에 대해 초임계 이산화탄소를 처리하여 40℃, 30MPa에서 30분 처리한 것이 100℃, 60분 열처리한 것보다 더 욱 높은 효과가 있음을 입증함.
• Enomoto 등(1997)은 B. megaterium 현탁액의 포자를 60℃, 58bar에서 30시간 동안 처리하여 약 7log CFU/g 감소효과를 보였으며 압력에 의해 포자가 뭉쳐지면 살균효과가 감소할 수 있다고 발 표함.
• B. subtilis는 내열성 포자 형성균 중에서 초임계 이산화탄소 처리 실험에 가장 많이 사용되었는데 35℃, 200atm에서 2시간 처리 시 0.5log CFU/g 감소(Kamihira 등, 1987), 80℃, 50bar에서 1시간 처리 시 4.00log CFU/g 감소(Ballestra와 Cuq, 1998), 그리고 75℃, 70bar에서 24시간 처리 시 7.00log CFU/g 감소(Spilimbergo 등, 2002) 효과를 보였음.
• Pinto 등(2006)은 table grape에 50% 주정을 3분 동안 처리하여 2.00log CFU/g의 저감화 효과를 검 증함. 또한 Piernas와 Guiraud(1998)는 주정 70%를 10분 동안 처리하여 일반세균을 3.50log CFU/g 감소시키는 결과를 보고함.
• Kamihira 등(1987)은 2시간 동안 35℃에서 200bar 처리 시 B. subtilis, Bacillus stearothermophilus의 내생포자를 불활성시키지 못하였으나, 에탄올 또는 아세트산의 단순 첨가로 B. stearothermophilus 의 내생포자를 약 50% 사멸시키는 효과를 보고함.
• Erkmen(2000)은 돈육, 우육, 오렌지 주스, 사과 주스 등의 다양한 식품에서 초임계 이산화탄소 의 미생물 저감화 효과를 확인하였으며, 이후에도 사과사이다(Gunes 등, 2006), 우유(Werner와 Hotchkiss, 2006), 계육(Wei 등, 1991) 등에서 초임계 이산화탄소의 미생물 저감화 효과가 검증되 었음.
• 초임계 이산화탄소는 무극성, 무독성이며, 화학적으로 안정하고, 가격이 저렴하며 순환사용이 가 능함. 특히 임계점(임계압력 73.8bar, 임계온도 31.1°C)이 낮기 때문에 비열처리 공법으로 산업에서 유용하게 이용할 수 있음.
• 초임계 유체의 점성도와 표면장력은 기체에 가까우며, 밀도는 액체에 가깝고, 열이나 물질의 전도 성은 물만큼 높다고 알려져 있음. 밀도는 용해력과 밀접한 관련을 가지고 있기 때문에 초임계유체 를 반응과 분리 공정 등에서 용매로 사용하면 이상기체에 가까운 저밀도 상태에서부터 액체 밀도 에 가까운 고밀도 상태까지 연속적으로 변화시킬 수 있어 다양한 종류의 용매 특성을 얻을 수 있 음(Williams, 1981).
• 초임계 유체는 액체와 같은 용해력에 기체와 같은 확산력과 침투력을 가지므로 혼합물에서 특정
성분을 분리, 추출하는 데 뛰어난 능력을 가짐. 따라서 이러한 능력을 식품산업에서 커피의 탈 카 페인 가공, 맥주용 홉 엑기스 추출 등에 이용하고 있으며 초임계 세정, 반도체 웨이퍼, 초임계 크로 마토그래피 등 다양한 분야에서 활용하고 있음(주와 강, 2005).
• 수십 년 동안 기초연구가 되어 온 초임계 이산화탄소를 이용한 공정은 최근 그 설비비용의 절감 과 공장화 기술이 발달하여 제약, 화학, 고분자, 제약 등의 각종 관련 산업에서 현재 산업화단계 로 진행이 되고 있고 식품분야에서도 향료, 참기름, 홉 등의 분리추출분야에서 서서히 상업화 준 비가 이루어지고 있음(Bernardo-Gil, 1988; Brandani 등, 1990; Ayano 등, 1996).
• 또한 초임계 이산화탄소는 비극성, 무독성이며 화학적으로 안정하고 값이 싸기 때문에 기술적 성공이 이루어진다면 비가열식 미생물 저감화 방법으로서의 산업적 이용 가능성이 큼.
• 물리적 효과에 의존하는 고압의 기체 이용방법에 비해 초임계 이산화탄소 이용공정은 초임계 이 산화탄소의 물리적, 화학적 성질을 함께 이용하므로 중요 공정변수인 압력, 온도를 상대적으로 낮은 수준으로 하여도 좋은 결과를 얻을 수 있는 장점이 있어 에너지 절감을 통해 공정의 경제성 을 높일 수 있음.
• 따라서 고압에만 의존하는 hydrostatic pressure를 이용한 단순 물리적 방법보다 온도, 압력을 낮 추고도 우수한 효과를 얻을 수 있는 장점이 있음.
2. 연구방법
2.1 연구내용
발효주정 처리의 미생물 저감화 효과
쌀을 대상으로 포자 형성균(B. cereus, B. subtilis)과 포자를 제어하기 위한 주정의 단일처리 효과를 검증한다. 주정의 경우 다양한 농도와 시간에서 저감화 실험을 수행하여 가장 효율적인 조건을 각 각 확인한다.
초임계 이산화탄소 처리의 미생물 저감화 효과
쌀을 대상으로 포자 형성균(B. cereus, B. subtilis)과 포자를 제어하기 위한 초임계 이산화탄소의 단 일처리 효과를 검증한다. 초임계 이산화탄소의 경우 온도, 압력, 시간의 다양한 조건에서 저감화 실 험을 수행하여 가장 효율적인 조건을 각각 확인한다.
조합 처리의 미생물 저감화 효과
단일처리의 저감화 결과를 바탕으로 초임계 이산화탄소와 주정을 조합, 처리조건을 설정하여 포자 형성균과 포자의 저감화 효과를 확인한다.
조합처리 전/후 쌀의 품질변화 측정 및 최적처리 조건 제시
산업에의 적용성을 모색하기 위하여 저감화 처리 전/후 쌀의 품질(yellowness, hardness, water uptake) 을 측정하여 품질의 변화를 최소화하면서 미생물 저감화는 극대화시킬 수 있는 조건을 산출한다.
2.2 시료 준비
시료(쌀)의 전처리
쌀에 존재하고 있는 미생물을 사멸시키기 위해, 쌀이 충분히 잠기도록 70% alcohol에 침지하여 25°C shaking water bath(VS-1205 SW1, Vision, Korea)에서 100rpm으로 40분간 처리하였다. 70% alcohol을 따라버리고, 멸균증류수를 가하여 2분간 100rpm으로 처리하여 alcohol을 완전히 씻어낸 후 상온에 서 하루 동안 건조하여 시료를 준비하였다.
시료에 존재하는 미생물 확인
매 실험 시 전처리한 쌀에 실험 대상균인 Bacillus spp.와 중온성 세균의 오염여부에 대한 검증실험을 수행하였다. 전처리한 쌀 25g에 225ml의 tryptic soy broth(TSB, Difco, Becton Dickinson, Sparks, MD) 를 가하여 각각 30, 37°C에 24시간동안 증균한 후 MYP(mannitol egg yolk polymyxin agar, Difco) 와 TSA(tryptic soy agar, Difco)에 획선 도말하여 각각 30, 37°C에 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 성상을 관찰하여 미생물의 존재 여부를 확인하였으며, 그 결과 실험에 사용된 쌀에서 B. cereus, B.
subtilis 및 다른 중온성 세균은 검출되지 않았다.
2.3 내열성 포자 형성균(B. cereus, B. subtilis) 접종
본 실험에서는 각각 3개의 B. cereus와 B. subtilis 표준 균주(표 2)를 사용하였다. B. cereus와 B. subtilis 를 각각 TSB에 접종하고 B. cereus는 30°C에서 24시간, B. subtilis는 37°C에서 24시간 배양하여 균주 의 활성을 최대로 하였다.
표 2 Bacterial strains
Bacteria Strain number
Bacillus cereus
1ATCC 10876 ATCC 11778 ATCC 14579
Bacillus subtilis
ATCC 9372 ATCC 15245 ATCC 21336
1ATCC: American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA).
배양한 균액을 2,500×g으로 30분 동안 원심분리(Centra-CL2, IEC, USA)하고, 상징액을 모두 버 린 후 다시 0.85% 생리식염수(pH 7.0)를 넣고 같은 조건에서 원심분리하는 과정을 3회 반복한 후 시 료에 접종하기 위해 각 균별로 세 개의 균주를 cocktail하여 현탁액을 제조하였다. 전처리한 쌀을 충 분히 잠기도록 현탁액에 1시간 동안 침지시킨 후, 현탁액을 따라버리고 B. cereus와 B. subtilis가 쌀에 부착하도록 냉장고에서 하루 동안 건조하였으며, 이때 쌀에서의 B. cereus와 B. subtilis의 접종 수준 은 6~7log CFU/g였다. 아래 그림 4에 시료준비 과정을 요약하여 나타내었다.
Inoculation
Drying overnight (attachment)
106~107 log CFU/g Bacillus cereus, Bacillus subtilis
그림 4 Inoculation of vegetative cells and spores of Bacillus cereus and Bacillus subtilis on rice.
2.4 내열성 포자(B. cereus spore, B. subtilis spore) 접종
B. cereus와 B. subtilis를 각각 TSB에 접종하고 B. cereus는 30℃에서 24시간, B. subtilis는 37℃에서 24 시간 배양하여 균주의 활성을 최대로 하였다. 배양한 균주 현탁액을 TSA에 도말하고 72시간 배양 하여 현미경으로 80% 이상 포자가 형성된 것을 확인하였다.
포자가 형성된 집락을 면봉으로 취하여 0.2% peptone에 풀어 포자 현탁액을 제조한 후, 원심분리 기를 이용하여 2,500×g으로 30분 동안 원심분리하였다. 상징액을 모두 버린 후 다시 0.85% 생리식 염수(pH 7.0)를 넣고 같은 조건에서 원심분리하는 과정을 3회 반복한 후 시료에 접종하기 위해 각 균별로 세 개의 균주를 cocktail하여 현탁액을 제조하였다. 내열성 포자 형성균의 접종방법과 같이 전처리한 쌀에 B. cereus와 B. subtilis의 포자 현탁액을 6~7log CFU/g 수준으로 접종하였다.
2.5 내열성 포자 형성균 및 포자 제어 방법
주정 단독처리
멸균백에 내열성 포자 형성균과 포자를 접종한 쌀 15g과 0(멸균 증류수, 대조구), 10, 20, 30, 50, 70%
의 주정 100ml를 가하여 25℃ shaking water bath에서 100rpm으로 5, 10, 20, 30, 60분간 처리하였다.
처리 후 주정을 버리고 멸균증류수 100ml를 가하여 25℃ shaking water bath에서 2분간 100rpm으로 처리하여 주정을 완전히 수세하였다.
초임계 이산화탄소의 단독처리
본 실험에서는 초임계 이산화탄소 처리를 하기 위해 그림 5의 초임계 이산화탄소 추출장치 (Supercritical CO2 Gas Extractor, Ilshin Engineering, Korea)의 압력, 온도, 시간을 다양하게 설정하 여 사용하였다. 실험에 사용한 초임계 이산화탄소 추출기는 추출기 및 연결 파이프의 모든 금속이 stainless steel 재질로 만들어졌으며, 내부 용량이 150ml, 최대 압력 6,300psi, 온도는 80℃까지 설정이 가능하다.
초임계 이산화탄소 처리를 하기 위해 먼저 제어장치(controller)를 통해 온도를 설정하여 추출기 (extractor)의 온도가 원하는 온도에 맞춰지면 시료를 추출기에 넣고 뚜껑을 닫아 추출기를 밀폐시 켰다. 사이펀 실린더(gas cylinder)에 있는 순도 99.5%의 이산화탄소 가스를 펌프를 통해 원하는 압 력만큼 추출기 안에 채운 후 밸브를 잠궈 batch type으로 만들었다. 처리 시간에 이르게 되면 밸브를 즉시 개방하여 압력을 낮췄다. 추출기 내 이산화탄소가 모두 제거되면 추출기를 개방하고 시료를 꺼내어 생균수를 측정하였다. 각 처리 후 다음 처리 전에는 70% ethanol로 추출기를 세척하였다. 모 든 실험은 3회 반복하여 수행하였다.
그림 5 The supercritical carbon dioxide system.
P1
CO2
GAS
CHILLER
PUMP
HEATING BATH
VENT
COSOLVHNT CONTROLLER
HIGH VESSEL
SEPA RATOR
SEPA RATOR
P2 P3
T1
T2
그림 6 A schematic diagram of the supercritical carbon dioxide system. P1, P2, and P3 indicate the outlet of the CO2
cylinder, the inlet, and the vessel pressure, respectively. T1 and T2 indicate inlet and vessel temperature, respectively.
내열성 포자 형성균과 포자를 접종한 쌀을 초임계 이산화탄소 처리를 할 수 있도록 멸균된 튜브 (Falcon, NJ, USA)에 10g씩 담았다. 초임계 이산화탄소의 처리 조건은 이산화탄소의 임계온도(31.1℃) 와 임계압력(73.8bar)을 고려하여 그 이상의 조건에서 설정하였다. 초임계 이산화탄소의 처리조건은 표 3에 나타내었다.
주정과 초임계 이산화탄소의 조합처리
주정과 초임계 이산화탄소의 단독처리 결과를 바탕으로 조합처리 조건을 설정하였다. 쌀에 주정을 처리한 직후 초임계 이산화탄소를 처리하여 저감화 효과를 확인하였으며, 자세한 조건은 아래 표 4 에 나타내었다.
표 3 Treatment conditions (temperature, pressure, and time) of SC-CO2
Temperature (℃) Pressure (bar) Time (min)
36
100
10 20 30
150
10 20 30
200
10 20 30
40
100
10 20 30
150
10 20 30
200
10 20 30
44
100
10 20 30
150
10 20 30
200
10 20 30
표 4 Combined treatment conditions of fermentation ethanol and SC-CO2
Fermentation ethanol SC-CO2
Concentration (%) Time (min) Temperature (℃) Pressure (bar) Time (min)
30 30 36 100 10
30 60 36 100 10
30 30 44 200 30
30 60 44 200 30
2.6 내열성 포자 형성균 및 포자의 정량적 저감화 확인
처리 전·후의 시료(쌀) 10g을 무균적으로 취해 stomacher bag에 넣은 후, 90ml의 0.2% peptone water 를 가하여 stomacher(Seward 400 Circulator, England)로 260rpm에서 2분간 균질화하였다. 균질화된 시료로부터 1ml를 취하여 9ml 멸균생리 식염수로 10-2에서 10-6까지 단계별로 희석하였다. 각 단계의 희석액 0.1ml를 TSA에 도말하여 B. cereus는 30℃에서 24시간 동안, B. subtilis는 37℃에서 24시간 동 안 배양하였다. 배양 후 집락을 계수하고 초기 농도와 비교함으로써 저감화 효과를 확인하였다.
2.7 쌀의 품질평가
Yellowness(황색도) 측정
주정과 초임계 이산화탄소의 조합 처리 전·후 쌀의 색 변화를 확인하기 위하여 백색판으로 표 준화(C: Y=91.7, x=0.3138, y=0.3200)시킨 색도계(CR-300, Minolta Camera Co., Japan)를 이용하여 Yellowness를 측정하였다.
Hardness(경도) 측정
주정과 초임계 이산화탄소의 조합 처리 전·후 쌀의 경도 변화를 확인하기 위하여 대조구와 처 리구의 쌀로 밥을 지어 4g을 Texture Analyzer(TA-XT2I, Stable Micro Systems, UK)를 이용하여 hardness(g)를 측정하였다. Two site compression test 방식을 이용하여 test speed는 2.0mm/sec, distance format은 50%/strain, cylinder diameter는 20mm로 설정하였다.
Water uptake(수분 흡습도) 측정
주정과 초임계 이산화탄소의 조합 처리 전·후 쌀의 수분 흡습도를 확인하기 위하여 50g의 raw rice 와 처리 후 cooked rice의 무게차이를 이용하여 Water uptake(%)를 측정하였다.
Water uptake (%) = WWC-WUCUC × 100 WC: 처리 후 cooked rice
WUC: 처리 전의 raw rice
2.8 연구 추진 체계도
주정
쌀에서의 내열성 포자 형성균 제어를 위한 초임계 이산화탄소 적응 연구
쌀에서의 미생물학적 안전성 확보 취반용 쌀 및 쌀가공품 생산업계 전반에 활용
초임계 이산화탄소
조합처리 수행
■ 주정과 초임계 이산화탄소의 조합처리 저감화효과 확인
쌀의 품질변화 측정
■ Yellowness, Hardness, Water uptake 측정
■ 품질변화를 최소로 하는 효율적인 저감화 처리 조건 확립
최적 조합처리 조건 확립 단독효과
확인
품질을 고려하여 최적의 조합처리 조건확립
2.9 연구 추진 일정
추진일정
12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 가중치
• 주정을 이용한 내열성 포자 형성균 및 포자의 저감
화 실험
- 특정 농도, 시간에 따른 다양한 조건 처리 - 최적의 조건 확립
• 중간보고서 작성
• 초임계 이산화탄소를 이용한 내열성 포자 형성균
및 포자의 저감화 실험
- 특정 압력, 온도, 시간에 따른 다양한 조건 처리 - 최적의 조건 확립
• 주정과 초임계 이산화탄소의 조합처리를 이용한
내열성 포자 형성균 및 포자의 저감화 실험 - 초임계 이산화탄소와 주정의 다양한 조건의 조
합처리 실험 - 최적의 조건 확립
• 내열성 포자 형성균 저감화 처리에 따른 쌀의 품질
변화 측정
- 초임계 이산화탄소와 주정의 처리에 따른 품질 변화(Yellowness, Hardness, Water uptake) 관찰 - 품질변화를 최소화하는 최적의 조합처리 조건
제시
• 즉석밥 제조공정 중 내열성 포자 생성균 제어공정
최적모델 확립
• 결과 보고서 작성
사업 진도 (%) 30 5 20 20 15 5 5 100
3. 결과 및 고찰
3.1 연구수행 결과
주정을 이용한 내열성 포자 형성균 및 포자 제어 1) B. cereus와 B. subtilis에 대한 주정의 살균효과
B. cereus를 접종한 쌀에 주정 없이 멸균증류수만 첨가하여 세척한 결과(대조구), 5분 세척 시 초기
농도보다 1.47log CFU/g 감소하였으며, 5, 10, 20, 30, 60분 처리군 사이에서 유의적인 차이는 나타나 지 않아(p<0.05) 처리시간에 따라 세척효과는 증가하지 않은 것으로 판단된다.
B. cereus를 접종한 쌀에 농도별(10, 20, 30, 50, 70%) 주정 처리 시 처리시간이 증가함에 따라 살균 효과가 증가하였으며, 주정 농도 증가에 따른 저감화 효과 차이도 증가하는 것을 확인하였다(그 림 7). 주정 10, 20, 30, 50, 70%를 5분간 처리하였을 때 초기 농도보다 1.36~2.55log CFU/g 감소하였 으나 농도별 유의적 차이가 없었고, 대조구와 유의적인 차이를 보이지 않아 5분 처리 시 주정에 의 한 저감화 효과는 미미한 것으로 판단된다. 주정 30% 10분, 20% 20분, 30% 30분, 30% 60분 처리하 였을 경우 대조구의 세척효과와 유의적인 차이를 나타내어(p<0.05), 전반적으로 30%의 농도에서 저 감화 효과가 증가하는 것으로 나타났다.
농도별 시간에 따른 저감화 효과를 비교해 보면, 10, 20% 주정 처리 결과 5분에서 60분까지 유의 적인 차이가 나타나지 않아(p<0.05) 처리시간의 증가가 저감화에 영향을 미치지 않음을 확인하였고 10, 20%의 최적 처리 시간은 5분으로 결정하였다. 반면 30%는 30분부터, 50%와 70%는 20분부터 5분 처리 시와 유의적 차이가 나타나고(p<0.05), 그 이후 시간에서는 차이를 나타내지 않아(p<0.05) 30%의 경우 30분, 50%와 70%는 20분으로 각 농도별 최적 시간을 설정할 수 있었다.
B. subtilis를 접종한 쌀에 주정 없이 멸균증류수만 첨가하여 세척한 결과(대조구) 5분 처리 시 초 기농도보다 1.64log CFU/g 감소하여 세척효과를 확인하였으며, 5, 10, 20, 30, 60분 처리군 사이에서 차이를 나타내지 않아 B. cereus와 마찬가지로 처리시간에 따라 세척효과는 증가하지 않은 것으로 보인다.
B. subtilis를 접종한 쌀에 농도별(10, 20, 30, 50, 70%) 주정 처리 시 처리시간이 증가함에 따라 주정 의 살균효과는 증가하였으며 주정의 농도별 저감화 효과 차이가 커지는 것을 확인하였다(그림 8).
또한 10, 20, 30, 50, 70% 주정 5분 처리 시 초기 농도보다 1.64~2.91log CFU/g 감소하였으며, 5분 처 리 시 농도별 차이를 보이지 않았던 B. cereus와는 달리 30%부터 대조구와 유의적인 차이를 나타내 어(p<0.05) 높은 농도로 처리 시 저감화 효과가 증가함을 알 수 있었다.
주정을 10, 20, 30, 60분 처리 시 각각 20, 20, 10, 10%의 농도에서 대조구의 세척효과와 유의적인 차이를 나타내었으며(p<0.05), 20% 주정 10, 20분, 10% 주정 30, 60분 처리군에서 저감화 효과가 증 가하였다. 이는 B. cereus에 비해 같은 시간 처리 시 낮은 농도에서 효과가 나타난 것으로 B. subtilis 가 B. cereus에 비해 주정에 민감한 것으로 사료된다.
농도별 시간에 따른 저감화 효과를 비교해 보면 10% 30분, 20% 10분, 30% 5분, 50% 20분, 70%
5분 이상 처리하였을 때 대조구와 차이를 보였으며, 농도와 처리시간을 모두 고려하였을 때 주정 20% 10분, 30% 30분, 50, 70% 20분 이상 처리에서 유의적 차이를 나타내었다(p<0.05).
그러나 통계분석 결과 주정 30% 30분 처리 시부터 두드러진 저감화 효과가 나타나기 시작하였 으며 B. cereus와 달리 B. subtilis 동일 처리시간에서 30, 50, 70%의 저감화 효과 차이는 거의 나타나지
Log CFU/g 7
6
5
4
3
2
1
0 10 20 30 40 50 60
Time (min)
Distiled water
(Fermentation ethanol 0%) 10%
20%
30%
50%
70%
그림 7 Inactivation effect of fermentation alcohol on B. cereus.
Log CFU/g
7
6
5
4
3
2
1
0 10 20 30 40 50 60
Time (min)
Distiled water
(Fermentation ethanol 0%) 10%
20%
30%
50%
70%
그림 8 Inactivation effect of fermentation alcohol on B. subtilis.
않았다.
Bacillus spp.에 대한 알코올의 효과는 쌀에 20, 30, 50%의 알코올을 5분간 처리하여 중온성 세균 이 각각 약 1.00, 1.50, 2.00log CFU/g 감소한(초기농도 3.10log CFU/g) Lee 등(2007)의 선행연구와 유 사한 결과를 보였다.
2) B. cereus와 B. subtilis 포자에 대한 주정의 살균효과
B. cereus와 B. subtilis의 포자에 대한 주정의 저감화 처리 효과는 최대조건(70%, 60분) 처리에서도 0%(멸균증류수) 60분 처리와 유의적 차이를 보이지 않았으며(p<0.05), 이는 주정을 비롯한 알코올 류는 포자 저감화에 영향을 미치지 못하기 때문으로 판단된다(Banwart, 1989; Shelef와 Seiter, 2005).
초임계 이산화탄소를 이용한 내열성 포자 형성균 및 포자 제어
1) B. cereus와 B. subtilis에 대한 초임계 이산화탄소의 살균효과
B. cereus를 접종한 쌀에 초임계 이산화탄소를 처리한 결과 최소조건인 36°C, 10분, 100bar에서 3.84log CFU/g, 최대조건 44°C, 30분, 200bar에서는 4.19log CFU/g의 저감화 효과가 나타나 통계적 으로 차이가 나타나지 않음을 확인할 수 있었다(그림 9).
B. subtilis에 초임계 이산화탄소를 처리한 결과도 역시 최소조건인 36°C, 10분, 100bar에서 3.94log CFU/g, 최대조건인 44°C, 30분, 200bar는 4.20log CFU/g의 저감화 효과가 나타나 실질적으로 최소 조건과 최대조건의 저감화 효과는 거의 차이가 나타나지 않았다(그림 10).
Jung 등(2009)은 새싹채소 씨앗에 존재하는 Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium을 45°C, 15분, 200bar의 조건으로 처리하였을 때 7log CFU/g 이상의 저감 화 효과를 나타내었고, Choi 등(2009)의 연구에서 간장양념육의 generic E. coli, E. coli O157:H7, L.
monocytogenes, S. typhimurium을 45°C, 40분, 140bar 처리하였을 때 2.5log CFU/g의 감소효과를 보 였다. 이와 같이 식품과 미생물의 종류에 따라 저감화 효과가 크게 차이가 나는 것을 알 수 있으며, 본 연구 결과와는 달리 온도, 시간, 압력의 조건에 따라 저감화 효과가 순차적으로 증가하는 것을 볼 수 있다.
그러나 이(2006)와 Kim(2006)의 연구에서 초임계 이산화탄소의 저감화 효과는 온도의 변화에 가 장 큰 영향을 받으며 그 다음으로 처리시간과 압력이 저감화 수준에 영향을 미치는 것을 확인하였 다. 하지만 본 실험에서는 선행연구 결과와 달리 온도와 압력, 시간에 따른 유의적 차이가 발생하지 않았으며, 그 이유는 B. cereus와 B. subtilis가 일정한 치사상태에서 포자를 형성하기 때문인 것으로 추측된다.
2) B. cereus와 B. subtilis 포자에 대한 초임계 이산화탄소의 살균효과
B. cereus와 B. subtilis의 포자에 대한 초임계 이산화탄소의 저감화 처리 효과는 가장 최대조건인 44°C, 30분, 200bar 처리에서 대조구와 유의적 차이를 보이지 않아 저감화 효과가 미비하였다.
Spilimbergoa(2002)는 B. subtilis 포자를 54°C, 60분, 200bar의 조건에서 초임계 이산화탄소로 처리 하였을 때 저감화 효과가 없었으며, 36°C, 24시간, 75bar 처리하였을 때 약 3log CFU/g의 저감화를 나타내었다. 이러한 선행연구 결과를 통해 초임계 이산화탄소로 포자를 제어하기 위해서는 장시간 처리가 필요하다는 것을 알 수 있으나 초임계 이산화탄소를 장시간 처리할 경우 쌀의 품질변화에 큰 영향을 미칠 것으로 보인다.
Temperature (°C) (a)
(c)
(b)
36°C 40°C 44°C
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Control 10 min 20 min 30 min
Log CFU/g
Temperature (°C)
36°C 40°C 44°C
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Control 10 min 20 min 30 min
Log CFU/g
Temperature (°C)
36°C 40°C 44°C
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Control 10 min 20 min 30 min
Log CFU/g
그림 9 Inactivation effect of SC-CO2 on B. cereus at different pressure of (A) 100, (B) 150, and (C) 200 bar.
Temperature (°C) (a)
(c)
(b)
36°C 40°C 44°C
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Control 10 min 20 min 30 min
Log CFU/g
Temperature (°C)
36°C 40°C 44°C
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Control 10 min 20 min 30 min
Log CFU/g
Temperature (°C)
36°C 40°C 44°C
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Control 10 min 20 min 30 min
Log CFU/g
주정과 초임계 이산화탄소의 조합처리를 이용한 내열성 포자 형성균 제어
B. cereus를 접종한 쌀에 주정과 초임계 이산화탄소를 조합 처리한 결과, 주정과 초임계 이산화탄소 최대조건(주정은 30%, 60분, 초임계 이산화탄소는 44°C, 30분, 200bar)에서 유의적 차이를 보였으며 (그림 11), 이때 5.01log CFU/g의 저감화를 나타냈다.
B. subtilis를 접종한 쌀에 주정과 초임계 이산화탄소를 조합 처리한 결과, 최대조건(주정은 30%
60분, 초임계 이산화탄소는 44°C 30분 200bar)에서 4.80log CFU/g의 저감화 효과를 보였으나 주정 의 처리시간과 초임계 이산화탄소의 처리조건에 따라 유의적인 차이가 나타나지 않았다(p<0.05)(그 림 12). 이와 같은 결과는 초임계 이산화탄소 단독 처리에서와 마찬가지로 일정한 치사상태에서 B.
cereus와 B. subtilis가 포자를 형성하기 때문인 것으로 판단된다.
그림 10 Inactivation effect of SC-CO2 on B. subtilis at different pressure of (A) 100, (B) 150, and (C) 200 bar.
