20 13년 2월 박사학위 논문
MDA-MB-2 31세포에서
5-ni t r o-5 ’ -hydr oxy-i ndi r ubi noxi me 의 항암 효과
조선대학교 대학원
치의생명공학과
권 성 민
MDA-MB-2 31세포에서
5-ni t r o-5 ’ -hydr oxy-i ndi r ubi noxi me 의 항암 효과
Theant i -c anc e re f f e ctof5 -ni t r o -5’ -hydr oxy-i ndi r ubi noxi mei n br e as tc anc e rMDA-MB-231c e l l s
20 13년 02월 2 5일
조선대학교 대학원
치의생명공학과
권 성 민
MDA-MB-2 31세포에서
5-ni t r o-5 ’ -hydr oxy-i ndi r ubi noxi me 의 항암 효과
지도교수 안 상 건
이 논문을 이학박사 학위신청 논문으로 제출함
20 12년 1 0월
조선대학교 대학원
치의생명공학과
권 성 민
권성민의 박사학위 논문을 인준함
위원장 광주과학기술원 교수 김 재 일 ( 인) 위 원 원광대학교 교수 윤 정 훈 ( 인) 위 원 서울대학교 교수 강 건 욱 ( 인) 위 원 원광대학교 교수 이 준 ( 인) 위 원 조선대학교 교수 안 상 건 ( 인)
20 12년 1 2월
조선대학교 대학원
목 차
목 차 ··· ⅰ 도목차 ··· ⅲ ABSTRACT ··· ⅳ
Ⅰ.서 론 ··· 1
Ⅱ.재료 및 방법 ··· 5
1.재료 및 항체 ··· 5
2.세포 배양 ··· 5
3.MTT 실험법 ··· 5
4.Flow cytometry를 이용한 세포주기 분석 ···6
5.Flow cytometry를 이용한 세포사멸 분석 ···6
6.DAPI염색 ···6
7.Westernblot분석 ···7
8.Xenograftmodel···7
9.자료 분석 ···7
Ⅲ.결과 ··· 8
1.5-OH-NIO가 MDA-MB-231세포 증식에 미치는 영향 ···8 2.5-OH-NIO가 MDA-MB-231세포주기에 미치는 영향 ··· 11 3.5-OH-NIO가 MDA-MB-231세포사멸에 미치는 영향 ···15 4.5-OH-NIO가 MDA-MB-231세포괴사에 미치는 영향 ···19 5.5-OH-NIO가 MDA-MB-231xenograftmodel에서 종양 억제에 미치는
영향 ···24
Ⅳ.고찰 ··· 27
V.참고문헌 ···31
도목차
Figure1.Theeffectof5-OH-NIO on cellproliferation ofMDA-MB-231 cells··· 9
Figure2.Cellcycleanalysisbyflow cytometry··· 12
Figure 3.G2/M phase cellcycle regulators expression in MDA-MB-231 cells···14
Figure4.Apoptosisanalysisof5-OH-NIO treatedcellsbyflow cytometry andDAPIstain···16
Figure 5.Apoptosis analysis of5-OH-NIO treated cells by immunoblot
···18
Figure 6.Induction of necrosis by 5-OH-NIO in MDA-MB-231 cells usingLDH releaseandPIstain···20
Figure 7.Necrosis analysis of5-OH-NIO treated cells by PIstain and immunoblot···22
Figure 8. Antitumor effect of 5-OH-NIO in xenograft model
···25
ABSTRACT
Theant i -c anc e re f f e c tof
5 -ni t r o-5’ -hydr oxy-i ndi r ubi noxi mei nbr e as tc anc e r MDA-MB-23 1c e l l s
Seong-MinKwon
Advisor:Prof.Sang-GunAhn,Ph.D.
DepartmentofDentalBioengineering, GraduateSchoolofChosunUniversity
Purpose: The novel indirubin derivatives 5-nitro-5’-hydroxy- indirubinoxime (5-OH-NIO) was designed and tested for antitumor activity both in vitro and in vivo using breast cancer cell lines, MDA-MB-231cells.
METHODS:Cellviability was examined by MTT assay.To examine apoptotic cell death, Annexin V/PI staining for flow cytometry and Western blotanalysis and DAPIstaining were performed.Necrotic cell death was determined by leakage of lactate dehydrogenase (LDH), HMGB1,andPIstainingin5-OH-NIO-treatedMDA-MB-231cells.
Six-week-oldmalenudemicewereinoculateds.c.ontherightflankwith MDA-MB-231 cells.Indirubin derivatives were directly injected into the
tumorevery otherday.Animalsweremonitored daily and tumorvolume wasmeasuredbycaliper.
Results:Indirubin derivatives showed potentantiproliferative activity on various human cancer cells.5-OH-NIO inhibited cells proliferation in a dosedependentmanner.TheratioofannexinV-positivecellsandcleaved caspase-3/7 was increased by 5-OH-NIO treatment in MDA-MB-231 cells,suggesting that5-OH-NIO inducedcelldeathinMDA-MB-231cells may be owing to apoptosis.In addition,LDH secretion and PIstaining were detected in MDA-MB-231 cells treated with 5-OH-NIO,showing that 5-OH-NIO also induced necrotic celldeath in the MDA-MB-231 cells.Theinhibitory effectof5-OH-NIO on tumorgrowth wasconfirmed by in vivo tumor xenograft model. 5-OH-NIO induced significant inhibition oftumorgrowth in nude mice bearing MDA-MB-231-induced tumors.
Conclusions: These data showed that novel indirubin derivatives 5-OH-NIO arrested the tumorgrowth by inhibiting cellproliferation and inducing apoptosisandnecrosis.Thesefindingsprovidethepotentialvalue ofindirubinderivativesasnovelcandidatesforantitumoragents.
I .서론
유방암은 우리나라 부인암 중에서 자궁경부암에 이어 발생빈도가 매우 높 은 암으로 점차 그 발생 빈도가 증가 추세를 보이고 있어 유방암의 조기발견 과 예방 및 치료에 많은 연구가 필요하다.암에 대한 치료의 방향은 여러 종 류가 있지만 최근 암세포의 특징적인 분자생물학적인 지표를 찾아내어 부작 용을 최소화하면서 암을 치료하고자 하는 연구에 관심이 높아지고 있다.
정상적인 진핵세포는 신호전달체계를 통하여 외부의 성장신호를 받으면 일 정 과정의 세포주기에 따라 세포증식이 일어난다.세포주기는 정확한 시간에 정확한 장소에서 진행되도록 조절되게 된다.이러한 조절 기능이 제대로 작 동하지 않으면 세포는 무제한적으로 증식하는 암세포로 변하게 된다.이러한 세포주기의 조절은 cyclin-CDKs (cyclin-dependentkinases)복합체를 포함 한 여러 조절인자들에 의해 유도된다 (1-4).
CDK는 serine/threonine kinasesgroup에 속해 세포주기의 조절,신경 기 능,분화 및 세포사멸에서 증가한다고 알려져 있다 (1).그들의 활동성은 세 포 주기의 다른 단계에서 발현하는 해당 cyclins과 결합을 포함하여 여러 메 커니즘을 조절한다고 알려져 있다 (2).여러 종류의 CDK/cyclin 복합체는 G1,S와 G2/M 단계를 통해 각각의 세포주기 단계에서 활성화된다.초기의 G1기에서 CDK4/cyclin D와 CDK6/cyclin D가 결합하고,말기의 G1기에서 E2F 단백질의 유입으로 인해 CDK6/cyclinE가 결합함으로써 retinoblastoma protein (Rb)의 인산화가 일어난다.이러한 전사 인자들은 차례로 세포주기의 S기로 진입에 필요한 유전자들을 활성화 시킨다 (3,4).CDK2는 S기에서 DNA 복제의 후반 단계에서 cyclinA에 의해 활성화되고,CDK2는 E2F 활동 성을 유지함으로써 세포 사멸의 시작을 예방하여 E2F의 불활성화를 촉진한 다 (5, 6). 결국, cyclin A 또는 B와 복합체를 형성한 CDK1은 G2/M
checkpoint에 관여하고 유사분열을 통해 세포 분열을 유도한다 (2,7).게다 가,세포 주기 조절에서 중요한 역할을 하는 CDK2,7,8,9는 여러 작용을 한 다고 알려져 있다.CDK2/cyclinE는 p53에 의해 조절되는 DNA 손상 경로에 서 중요한 역할을 하고,CDK7,8,9은 RNA polymerase의 인산화를 통해 전 사의 개시와 연장의 조절에 관여한다고 보고되었다 (8,9).그러므로,세포 성 장과 생존을 위한 여러 세포 과정에서 적절한 CDK 활성의 조절이 중요한 역할을 한다.Cyclin D와 E 같은 cyclin이 비정상적으로 높게 발현하거나 유 전자 변이를 통한 CDKs의 조절은 여러 종양에서 관찰되고 있다 (10).이전 의 보고에서,CDK2/cyclin E 복합체의 발현과 촉매활동이 대장,난소,유방, 전립선 암에서 증가하고,낮은 생존율을 보이는 유방암 환자의 종양에서 cyclinE의 발현이 증가한다는 보고가 있다 (11,12).또한,전립선 암과 폐암 환자에서도 비정상적인 CDK1/cyclin B 복합체의 과발현이 관찰되었다 (13, 14).종양세포에서 CDK1과 CDK2의 동시 결핍 시 종양세포의 성장 억제 효 과가 CDK1또는 CDK2중 하나의 결핍 때 보다 강하게 나타난다고 보고되 었다 (15).게다가,최근 특정 종양 세포에서 특별한 CDKs가 세포 성장에 필 요하다는 보고가 있었다 (7,16).그러므로,CDKs의 억제는 종양 억제 조절을 위해 새로운 치료법으로 제시되어 CDK 억제제에 대한 연구가 많이 진행되 고 있다.
다세포 생물체에서의 세포사는 일반적으로 체계적인 분자 신호 전달 체계 에 의해 매개되는 세포사멸과 분자 신호 전달 과정이 없이 급성적으로 이루 어지는 세포괴사의 두 형태로 구별을 하는데,이는 흔히 세포사멸을 자살에 의한 세포사로 세포괴사를 타살에 의한 세포사로 비유하기도 한다 (17).세포 사멸은 세포사를 억제하는 단백질,혹은 반대로 세포사를 유발하는 단백질들 의 활성도 조합으로 결정이 되고 (18),caspase효소에 의해 세포사멸을 유도 한다고 알려져 있다.세포사멸의 외형적 특징으로는 초기 염색사 응축과 더
불어 건강한 세포의 경우 세포막 안쪽으로 노출되는 phosphatidylserine(PS) 막지질이 세포막 바깥쪽으로 노출이 된다.또한 세포막의 blebbing현상과 함 께 DNase 활성에 의해 조각난 DNA와 세포질 일부를 포함하는 vesicle (apoptoticbody)로 분열된다.Apoptoticbody는 주변의 phagocyte면역 세포 에 의해 제거되어 세포 내 항원 물질이 세포 밖으로 새어나오지 않기 때문에 염증반응에 의한 주변 세포의 피해를 최소화 시킨다 (19).반면,세포괴사는 과도한 세포독성이나 지속적인 환경 스트레스로 인해 유발되는 비가역적 세 포사로서 세포의 부피가 증가하고 plasmamembrane의 파괴가 일어난다 (20, 21).하지만,세포괴사가 최근에는 능동적인 프로그램에 의해 일어날 수 있다 는 사실이 밝혀지면서 프로그램화된 세포괴사에 대한 연구가 진행되고 있다.
이전의 연구에서,CDK 억제제는 세포 주기를 억제하고 세포 사멸을 유도한 다고 알려져 있어 항암제로 사용되고 있다 (22-24).하지만,CDK 억제제에 의한 세포괴사에 대한 연구는 거의 없다.
이전의 연구에서 당귀 롱휘 완 (DangguiLonghuiWan)의 성분인 인디루 빈 유도체 (indirubin derivative)가 암세포를 억제한다는 결과가 발표되었다 (25).이러한 인디루빈과 그 유도체가 일부 kinasefamily에 대한 높은 선택 성과 특히 CDK의 ATP가 결합하는 catalytic site에 결합함으로써 강력한 CDK의 저해제로 알려져 있다 (25).ATP는 대부분의 생화학 반응을 유도하 는 에너지원으로 ATP가 없으면 CDK 효소는 작용하지 않아서,세포 분열은 중단되게 된다.세포 분열은 정상적인 세포보다는 암 세포에서 많이 일어나 기 때문에 세포 주기 억제 효과가 있는 인디루빈은 새로운 항암 치료제로 이 용되고 있다.그러나 인디루빈은 물에 잘 녹지 않으며,체내에 거의 흡수되지 않기 때문에 수용성이며 흡수율이 높은 인디루빈 유도체의 연구가 필요하다.
본 연구에서,새로운 인디루빈 유도체인 5-nitro-5’-hydroxy-indirubinoxime (5-OH-NIO)를 합성하여 실험에 사용하였다.
본 연구를 통해 CDK 억제효과가 있는 새로운 인디루빈 유도체인 5-OH-NIO가 인간 유방암 MDA-MB-231세포의 증식 및 세포 주기에 미치 는 영향과,세포사멸 뿐 만 아니라 세포괴사에 어떤 영향을 미치는지 조사하 였고,이를 통해 유방암 치료의 새로운 치료제로의 가능성을 제시하고자 한 다.
Ⅱ.실험 재료 및 방법
1)재료 및 항체
5-OH-NIO는 애니젠(주)에서 합성하여 실험에 사용하였다.일차 항체는 phospho-cdc2(Tyr161),Cyclin B,HMGB1(Cellsignaling,Danvers,MA) 과,Cytochromec,pro-caspase3,pro-caspase7,Cleaved caspase9,Poly (ADP-ribose)polymerase(PARP)와 Actin (SantaCruzBiotechnology,CA, USA)을 사용하였다.
2)세포배양
사람 유방암 세포주인 MDA-MB-231세포는 10% fetalbovineserum,1
× MEM non-essential amino acid, 100 U/ml penicillin과 100 μg/ml streptomycin이 포함된 RPMI1640에서 37℃,5% CO2의 조건하에 계대 배 양하였다.
3)MTT 실험법
MTT (3-4,5-Dimerhylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)시약 은 최종 농도 5mg/ml가 되도록 PBS에 녹인 후 빛을 차단하고 4℃에 보관 하였다.MDA-MB-231세포를 계수하여 12well배양접시에 1×105개씩 분주 하여 배양 후,5-OH-NIO를 처리하였다.48시간 후,MTT 용액을 처리하여 37 ℃에서 3 시간동안 반응시켰다. 세포 배양액을 제거한 후, acid-isopropanol(0.04 mol/L HCL in isopropanol)에 dark blue crystals을
용해시켜 MicroplateAutoreaderELISA를 사용하여 570 nm의 파장에서 흡 광도를 측정하였다.
4)Flow cytometry를 이용한 세포주기 분석
MDA-MB-231 세포를 60 mm 배양접시에 1×105/mL 개의 세포수가 되도 록 분주한 후 5-OH-NIO를 농도별로 48시간 동안 처리하였다.세포를 모아 70% 에탄올에 고정하여 PI(50μg/mL)로 염색 후,CellLab QuantaTM SC flow cytometer(BeckmanCoulterInc,Miami,FL)를 이용하여 측정하였다.
5)Flow cytometry를 이용한 세포사멸 분석
MDA-MB-231세포에 5-OH-NIO를 농도별로 처리하고 48시간 배양 후, 세포를 배양액과 함께 모아 Alexa Fluor 488 Annexin V 와 propidium iodide (VybrantApoptosis Assay kit,Molecular Probes)로 염색 후,Cell Lab QuantaTM SC flow cytometer(Beckman CoulterInc,Miami,FL)를 이 용하여 측정하였다.
6)DAPI염색
MDA-MB-231세포를 chamberslide에 1×105개/well에 계수하여 배양 후, 5-OH-NIO를 농도별로 48시간 동안 처리하였다.세포를 PBS로 세척하고 4
% paraformaldehyde에 고정한 후,DAPIsolution(2μg/ml)을 15분 동안 반 응시키고 AxiovertS 100형광현미경 (CarlZeiss,Inc.,USA)으로 확인하였 다.
7)Western blot분석
Lysis buffer (1 % Triton X-100, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA와 proteaseinhibitors)를 사용하여 단백질을 추출하여 정량 후,20-50 μg의 단 백질을 7.5-12 % SDS-PAGE gel을 사용하여 전기영동 하여, PVDF membrane에 transfer하였다.5 % skim milk에 2시간 동안 Blocking하고, 일차항체 (1:1000)를 overnight으로 4℃에서 반응시켰다.TBST buffer로 세 척 후,실온에서 1 시간동안 이차 항체 (1:5000)와 반응시켰다.최종적으로 WEST ZOL PLUS reagent를 사용하여 LAS-1000(Fujifilm,Japan)으로 단 백질 발현 정도를 확인하였다.
8)Xenograftmodel
BALB/c nude mice에 MDA-MB-231 세포 5×106개/mice를 오른쪽 옆구리 피하에 주사하고 종양이 형성되었을 때,5-OH-NIO를 10,20,40 mg/kg로 복강에 이틀에 한 번씩 주사하여 4주 동안 종양 크기 및 몸무게를 측정하였 다.
9)자료 분석
모든 통계학적 분석은 MicrosoftExcel을 사용하였다.각각 시료에 대한 t-test를 사용하여 유의성 검정을 한 결과 p-value<0.05,0.01,0.001로 통계 적으로 유의하게 정의하였다.
Ⅲ.결과
1)5-OH-NIO가 MDA-MB-231세포 증식에 미치는 영향
5-OH-NIO가 MDA-MB-231 세포 증식을 억제하는지 확인하기 위해 MTT 실험을 시행하였다.MDA-MB-231 세포에 5-OH-NIO 1,2.5,5,10, 20 μM을 24,48시간 처리 후,흡광도를 측정한 결과,5-OH-NIO를 처리한 MDA-MB-231 세포에서 대조군과 비교하였을 때 농도 및 시간 의존적으로 현저히 세포 증식을 저해하는 것을 확인하였다 (Fig.1A).또한,기존의 높은 항암효과를 가진 것으로 알려진 인디루빈 유도체인 indirubin-3-monoxime 보다 5-OH-NIO가 MDA-MB-231세포 증식을 48시간에서 더 효과적으로 억제하였다 (Fig.1B).
Figure 1. The effect of 5-OH-NIO on cell proliferation of MDA-MB-231cells.
(A) MDA-MB-231 cells were incubated with 1,2.5,5,10,20 μM of 5-OH-NIO for24,48h.Thegraphrepresentstherelativenumberofcells from threeseparatedexperiments.*p< 0.05,**p< 0.01,***p< 0.001 statistically significant when compared with the control. (B) MDA-MB-231 cells were incubated with 1, 2.5, 5, 10, 20 μM of indirubin-3-monoxime or 5-OH-NIO for 48 h. Cell proliferation was analyzedbyMTT assay.
2)5-OH-NIO가 MDA-MB-231세포주기에 미치는 영향
5-OH-NIO가 MDA-MB-231 세포의 세포주기를 억제하는지 확인하기 위 해 MDA-MB-231세포에 5-OH-NIO 1,2.5,5μM을 48시간 처리하여 배양 하여, flow cytometry를 이용해 세포주기를 조사하였다. 실험 결과, 5-OH-NIO 48 시간 처리군에서 대조군과 비교하였을 때,5-OH-NIO 농도 의존적으로 MDA-MB-231세포의 G2/M기가 축적됨을 확인하였다 (Fig.2A, B).세포주기 조절 인자인 여러 CDK,cycline 중 phospho-cdc2 (Tyr161) (CDK1),CyclinB가 G2/M기 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다 (3,4).따 라서 MDA-MB-231 세포에서 5-OH-NIO에 의한 phospho-cdc2 (Tyr161), CyclinB에 영향을 미치는지 확인하기 위해 5-OH-NIO를 1,2.5,5μM 농도 별 처리 후,western blot 분석을 수행하였다.phospho-cdc2 (Tyr 161), Cyclin B 항체를 이용하여 단백질 발현을 확인한 결과,농도 의존적으로 phospho-cdc2 (Tyr 161)와 Cyclin B의 발현정도가 감소됨을 확인하였다 (Fig. 3). 이 결과를 통해 MDA-MB-231 세포에서 5-OH-NIO가 phospho-cdc2(Tyr161)와 Cyclin B의 발현을 감소시킴으로써 G2/M기에서 축적되는 것이 확인되었다.
Figure2.Cellcycleanalysisby flow cytometry.
(A)MDA-MB-231cellscyclearrestinducedby5-OH-NIO (1,2.5,5μM) was measured by flow cytometry.(B)The graph represents the relative numberofcells from three separated experiments.* p < 0.05,** p <
0.01,statisticallysignificantwhencomparedwiththecontrol.
Figure 3. G2/M phase cell cycle regulators expression in MDA-MB-231cells.
MDA-MB-231cellsweretreated with 1,2.5,5 μM of5-OH-NIO for48 h.Westernblotanalysisofphospho-cdc2(Tyr161),CyclinB andActin.
3)5-OH-NIO가 MDA-MB-231세포사멸에 미치는 영향
MDA-MB-231 세포에서 5-OH-NIO가 세포사멸에 영향을 미치는지 AnnexinV/PI염색과 DAPI염색을 통해 확인하였다.MDA-MB-231세포에 5-OH-NIO 1,2.5,5μM을 48시간 처리하여 배양하였다.Annexin V/PI염 색을 통한 세포사멸 확인 실험에서 5-OH-NIO를 처리한 MDA-MB-231 세 포에서 세포사멸이 확인되었다 (Fig. 4A, B). DAPI 염색 결과에서도 5-OH-NIO를 처리한 군에서 염색된 apoptoticbody를 형광현미경을 통해 관 찰함으로써 세포사멸을 확인할 수 있었다 (Fig.4C).특이하게 저농도인 1μ M을 처리한 군에서 고농도보다 높은 세포사멸이 관찰되었다. 다음으로, 5-OH-NIO에 의해 나타나는 세포사멸이 어떤 신호 경로를 통해 MDA-MB-231세포에 영향을 미치는지 western blot분석을 통해 조사하였 다. 5-OH-NIO에 의한 세포사멸 관련 단백질의 변화를 조사한 결과, 5-OH-NIO 처리 시 세포질로 cytochrom c가 유출되고 caspase3/7/9가 활성 화 되면서 PARP의 cleavege가 유되되는 것이 관찰되었다.즉,5-OH-NIO가 미토콘드리아 의존적 세포사멸 기전을 통해 세포의 증식을 억제하는 것으로 나타났다 (Fig.5).이 결과를 바탕으로 MDA-MB-231세포에서 5-OH-NIO 에 의해 내재적 고유 경로 (intrinsicapoptoticpathway)를 통해 세포사멸이 유도됨을 확인하였다.
Figure 4.Apoptosis analysis of 5-OH-NIO treated cells by flow cytometry andDAPIstain.
(A)MDA-MB-231 cells induced apotosis by 5-OH-NIO (1,2.5,5 μM) was measured by Annexin V/PIstaining.(B)The graph represents the relativenumberofcellsfrom threeseparated experiments.*p< 0.05,**
p < 0.01,*** p < 0.001 statistically significantwhen compared with the control. (C) The effect of 5-OH-NIO on apoptotic features in MDA-MB-231cellsby DAPIstaining.Apoptoticbodieswereobserved in 5-OH-NIO treatedMDA-MB-231cellsfor48h.Morphologicalpatternsof apoptosisinMDA-MB-231cellsexposedto5-OH-NIO.
Figure 5.Apoptosis analysis of5-OH-NIO treated cells by immuno blot.
MDA-MB-231cellsweretreated with 1,2.5,5 μM of5-OH-NIO for48 h.Western blotanalysisofCytochromec,Cleavedcaspase9,pro-caspase 3/7,PARP andActin.
4)5-OH-NIO가 MDA-MB-231세포괴사에 미치는 영향
위의 실험에서 MDA-MB-231 세포에 5-OH-NIO를 처리하였을 때,세포 증식은 농도 의존적으로 억제되는 것으로 나타났으나,세포사멸은 오히려 저 농도에서 높게 나타났다.이에 세포사의 또 다른 형태인 세포괴사가 유도되 는지 LDH,western blot분석,PI염색을 통해 확인하였다.5-OH-NIO를 처 리한 세포의 배양액을 사용하여 세포에서 유출되는 LDH의 수준을 측정한 결 과,농도 의존적으로 LDH 수준이 증가하는 것을 확인하였다 (Fig.6A).또 한,5-OH-NIO를 처리한 MDA-MB-231세포에 PI를 염색 후,형광현미경으 로 관찰한 결과 5-OH-NIO 농도 의존적으로 PI의 염색된 세포의 숫자가 증 가함을 확인하였다 (Fig.6B).다음으로,MDA-MB-231 세포에 5-OH-NIO 1,2.5,5 μM을 48 시간 처리하여 배양하고,PI염색을 통한 세포괴사 확인 실험에서 5-OH-NIO 처리한 군에서 농도 의존적으로 현저히 세포괴사가 증 가함을 확인하였다 (Fig.7A,B).HMGB1은 핵단백질로 괴사에 의한 세포 손 상에서 세포질 및 세포 외로 유출되는 것으로 알려져 있다 (26,27).Western blot을 통해 세포괴사 관련 단백질인 HMGB1의 변화를 조사한 결과, 5-OH-NIO 농도 의존적으로 세포질로의 HMGB1유출되는 것을 확인하였다 (Fig.7C).위 결과를 통해 MDA-MB-231 세포에서 5-OH-NIO가 세포사멸 과 함께 세포괴사도 유도함을 확인하였다.
Figure6.Induction ofnecrosisby 5-OH-NIO in MDA-MB-231cells using LDH releaseandPIstain.
(A)MDA-MB-231 cells were treated with 1,2.5,5 μM 5-OH-NIO,and the release of LDH into culture medium was detected after 48 h of treatment.Resultsareexpressed asthemeans± SD;*** p < 0.001.(B) Morphologicalfeatures ofnecrosis were examined during 5-OH-NIO in MDA-MB-231cells.Cellswerestained with PI(10mM)for10min and analyzedunderafluorescencemicroscope.
Figure 7.Necrosis analysis of5-OH-NIO treated cells by PIstain andimmunoblot.
(A)MDA-MB-231 cells induced necrosis by 5-OH-NIO (1,2.5,5 μM) was measured by flow cytometry.(B)The graph represents the relative numberofcellsfrom threeseparatedexperiments.*p< 0.05,**p< 0.01 statistically significantwhencomparedwiththecontrol.(C)Expression of released HMGB1 by 5-OH-NIO.MDA-MB-231 cells were treated with 5-OH-NIO (1,2.5,5 μM) for 48 h.HMGB1 expression in the cytosol fractionwasdetectedbywesternblotanalysis.
5)5-OH-NIO가 MDA-MB-231xenograftmodel에서 종양 억제에 미치 는 영향
MDA-MB-231 세포에서 5-OH-NIO에 의한 세포 증식 억제 효과를 in vitro에서 확인하였고,5-OH-NIO가 in vivo에서도 종양 억제 효과가 있는지 BALB/cnudemice를 이용한 xenograft모델에서 확인하였다.실험 결과,종 양 크기가 5-OH-NIO를 처리한 군에서 현저히 감소하였고,이는 농도 의존 적으로 나타났다 (Fig.8A,B).그러나,5-OH-NIO 처리에 따른 몸무게 변화 및 다른 부작용은 관찰되지 않았다 (Fig.8C).위의 결과를 통해 5-OH-NIO 의 종양 억제 효과가 in vitro뿐 만 아니라,in vivo에서도 유도됨을 확인하 였다.
Figure8.Antitumoreffectof5-OH-NIO in xenograftmodel.
(A)MDA-MB-231cells(5×106cells/mice)wereinjecteds.c.intotheright flank ofnudemice.5-OH-NIO (10,20,40mg/kg)werei.p.injected into the tumor every other day.Serialtumor volumes were measured by caliperandcalculated using theformulaV = (ab2)/2,in which aisthe largestdiameterand b is the shortestdiameterofthe tumor.Columns, mean;bars,SD.(B)Tumorbearing mice.(C)Body weightwasobtained onday27.
Ⅳ.고찰
새로운 CDK 억제제를 이용한 항암 치료에 대한 연구가 많이 진행되고 있 다.기존의 새로운 CDK 억제제인 인디루빈 유도체,5’-NIO를 사용하여 구강 암 세포 증식을 억제하였으나 (25),낮은 용해도가 단점으로 나타났다.이에 본 연구에서는, 5’-NIO의 단점을 보완한 새로운 인디루빈 유도체인 5-OH-NIO를 사용하여 유방암 MDA-MB-231세포에서의 세포 성장과 세포 주기 억제 및 세포사를 invitro와 invivo에서 조사하였다.
5-OH-NIO 처리군에서 농도 의존적으로 MDA-MB-231 세포 증식 억제 및 G2/M 주기 축적을 확인하였고,western blot분석을 통하여 G2/M 세포 주기에 관여한 단백질인 phospho-cdc2(Tyr161),CyclinB가 감소됨을 확인 하였다 (Fig.1-3).Subramaniam 등은 췌장암 세포에서 CDK4 억제제인 P276이 세포증식억제 효과를 나타냈고,G0/G1기의 축적을 확인하였다 (28). 또한,Dickson등은 CDK2/4/6를 억제하는 억제제로 알려진 Flavopiridol이 in vitro에서 세포 증식을 억제하였고,G1/S기와 G2/M기를 모두 축적한다고 보 고하였다 (29).이전의 5’-NIO를 이용한 연구에서도 phospho-cdc2의 활성을 억제함으로써 구강암 세포의 G2/M기 축적을 유도하는 것으로 보고되어 본 연구와 동일한 결과를 보고하였다 (25).
세포사는 크게 두 가지 방법,세포사멸 또는 세포괴사를 통하여 일어난다 고 알려져 있다.세포사멸은 우리 몸 안에 입력되어 있는 생체 프로그램으로 비정상 세포,손상된 세포 및 노화된 세포가 스스로 자살해 사멸함으로써 전 체적인 우리 몸의 균형을 유지시켜주는 메커니즘으로 알려져 있다.여러 가 지 요인이 세포사멸에 관여하지만,크게 세포사 수용체 (deathreceptor)가 관 여하는 외부요인 경로 (extrinsicapoptoticpathway)와 미토콘드리아 의존적 인 내재적 고유 경로 (intrinsicapoptoticpathway)의 두 가지 메커니즘에 의
해 apoptosis가 유도될 수 있다.외부요인 경로는 주로 Fasligand등 tumor necrosis factor 계열의 리간드가 세포 표면의 세포사 수용체에 결합한 후 Fas-associateddeath domain (FADD)단백질 등 연결기 단백질을 경유하여 caspase8을 활성화시켜 세포사멸을 유발한다 (30,31).특히,내재적 고유 경 로는 가장 대표적인 세포사멸 유도 단백질인 caspase의 활성화와 세포질로의 cytochromec유출에 의해 조절된다 (32,33).이 중,세포내 중요 단백질인 caspase3가 활성화되면 cleavege형태로 전환됨으로써 직접적으로 세포사멸 을 촉매하는 작용을 한다 (32,34).이전의 보고에서 Cartee등은 CDK 억제 제인 flavopiridol이 골수성 백혈병 세포인 U937 세포에서 외부요인 경로를 통해 세포사멸을 유도하는 것을 보고하였다 (35).반면,Subramaniam 등은 CDK4억제제인 P276에 의해 Bax의 증가와 Bcl-2의 감소를 보였고,caspase 3의 활성을 통해 내재적 고유 경로를 통해 세포사멸이 유도됨을 확인하였다 (28).CDK 억제제의 종류에 따라 다른 종류의 기전을 통해 세포사멸이 유도 되지만,본 연구에서 사용한 인디루빈 유도체 5-OH-NIO가 MDA-MB-231 세포 사멸을 유도한다는 것을 Annexin V/PI염색을 통해 확인하였고 (Fig.
4),western blot을 통해 5-OH-NIO에 의한 세포사멸에 관련된 단백질의 변 화를 조사한 결과,5-OH-NIO 처리 시 세포질로의 cytochrom c유출이 유도 되고 caspase가 활성화 되면서 PARP의 cleavege가 나타나는 것을 확인하여 내재적 고유 경로를 통한 세포사멸이 유도됨을 확인하였다 (Fig.5).이전의 연구에서 사용된 5’-NIO 역시 caspase3의 활성을 통해 내재적 고유 경로를 통해 세포사멸이 유도됨을 확인하였다 (25).
세포괴사는 최근에는 능동적인 프로그램에 의해 일어날 수 있다는 사실이 밝혀지면서 프로그램화된 세포괴사에 대한 연구가 진행되고 있다.이러한 세 포괴사의 경우에는 세포 밖에서 수분이 유입됨으로써 plasma membrane의 파괴가 일어난다 (20,21).결과적으로,세포에서 LDH와 같은 효소가 유출되
고,신진대사 기능을 잃음으로써 HMGB1의 감소가 일어난다.HMGB1은 거 의 모든 세포에서 발현하고,대부분 핵 내에 존재하는 단백질로 전사과정에 관여한다.세포괴사 과정에서 나타나는 HMGB1의 유출은 PARP 활성에 필요 한 과정이고,HMGB1의 유출은 염증반응을 유발한다 (26,27).본 연구에서, 5-OH-NIO가 세포괴사를 유도하는지 LDH,HMGB1유출과 PI염색을 통해 확인 결과,5-OH-NIO 처리한 MDA-MB-231세포에서 농도 의존적으로 PI 염색된 세포의 수가 증가하는 것을 확인하였다 (Fig. 6B). 또한, MBA-MB-231 세포에서 5-OH-NIO에 의해 세포막의 파괴가 일어남으로써 LDH 증가와 세포질로의 HMGB1유출을 확인하였다 (Fig.7C).이러한 결과 는 5-OH-NIO가 세포괴사 신호를 통해 MDA-MB-231 세포사를 유도하는 것을 나타낸다.이 연구를 통해 MDA-MB-231세포에서 5-OH-NIO에 의해 일어나는 세포사는 저농도의 5-OH-NIO를 처리하였을 때는 세포사멸에 의한 세포사가 유도되고,고농도의 5-OH-NIO를 처리하였을 때는 세포사멸과 세 포괴사가 함께 일어남으로써 세포사가 유도됨을 확인하였다.
In vitro에서 5-OH-NIO가 세포 증식을 억제하고 세포사를 유도하는 것을 확인하였고,in vivoxenograftmodel에서도 동인한 결과가 나오는지 확인한 결과,5-OH-NIO가 invitro와 같이 invivo에서도 동일한 결과를 확인하였다 (Fig.8A,B).또한,몸무게 변화가 없어 부작용이 없음을 확인하였고 (Fig.
8C),in vitro와 in vivo실험 결과를 통해 5-OH-NIO가 새로운 유방암 치료 제로서의 가능성을 제시하고 있다.이전의 보고에서 췌장암 세포인 PANC-1 세포를 이용한 xenograftmodel에서도 CDK4억제제인 P276에 의한 종양 억 제 효과를 확인하였다 (28).
결론적으로,본 연구를 통해 5-OH-NIO가 유방암 MDA-MB-231세포 증 식을 억제하고,세포주기 중 G2/M기가 축적되는 것을 확인하였다.또한,미 토콘드리아 의존적 신호를 통해 세포사멸을 유도하였고,5-OH-NIO가 세포
사멸 뿐 만 아니라,세포 괴사에 따른 세포사도 유도하는 것을 확인하였다.
동물 모델을 통한 종양 억제 효과를 통해 인디루빈 유도체 5-OH-NIO의 효 과적인 유방암 치료제로서의 가능성을 제시하였고,앞으로 유방암 뿐 만 아 니라 여러 종양 치료에 대한 추가 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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논문 제목
한글 : MDA-MB-231 세포에서 5-nitro-5’-hydroxy- indirubinoxime의 항암 효과
영문 : The anti-cancer effect of 5-nitro-5’-hydroxy- indirubinoxime in breast cancer MDA-MB-231 cells
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2013년 월 일
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