Performance Evaluation of Chemiluminescent Immunoassay for Erythropoietin and Establishment of Reference Interval in Korean Population

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Performance Evaluation of Chemiluminescent Immunoassay for Erythropoietin and Establishment of Reference Interval in Korean Population

Misuk Ji

, Hee-Jung Chung

, Gee Young Kim

, Woochang Lee

, Sunhwa Lee

, Sail Chun

, and Won-Ki Min

Department of Laboratory Medicine, Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine

, Seoul;

Department of Laboratory Medicine, Cheil General Hospital and Women’s Healthcare Center, Kwandong University College of Medicine

, Seoul; Neodin Medical Institute

, Seoul, Korea

화학발광면역 측정법을 이용한 Erythropoietin 검사법의 수행능 평가 및 참고범위 설정

지미숙

․정희정

․김지영

․이우창

․이선화

․전사일

․민원기

울산대학교 의과대학 서울아산병원 진단검사의학과

, 관동대학교 의과대학 제일병원 진단검사의학과

, 네오딘의학연구소

접수일: 11 / 11 / 28 최종재심접수일: 11 / 12 / 6 게재승인일: 11 / 12 / 13 교신저자：전사일

우) 138-736 서울특별시 송파구 올림픽로 43길 88 서울아산병원 진단검사의학과

전화: 02)3010-4513 FAX: 02)478-0884

E-mail: [email protected]

Background: The measurement of serum erythropoietin (EPO) is useful for the differential diagnosis of polycythemia and anemia and for treatment monitoring of recombinant human EPO. Radioimmunoassay (RIA) has been used in several clinical laboratories of Korea, and recently a few manufacturers developed fully automated chemiluminescence immunoassay (CLIA). We evaluated performance of Access EPO assay (Beckman Coulter, USA) using CLIA and established reference interval for Korean adults with this assay.

Methods: The precision, linearity, limit of detection, percent carryover, comparison of Access EPO CLIA and EPO-Trac RIA (DiaSorin Ltd, UK), and establishment of reference interval were determined according to the Clinical and Laboratory Standards Institute guidelines. The quality control materials were used in the determination of precision, limit of detection, and carryover. For the reference interval, serum specimens obtained from a total of 120 healthy adults were used.

Results: The linearity was good (R

=0.998) from 0.5 IU/L to 732.3 IU/L and within-run and total imprecision were 2.1-4.1% and 2.6-4.1%, respectively. The lower limit of detection was 0.259 IU/L and percent carryover was 0.18%. A comparison analysis with RIA assay showed good correlation, with a correlation coefficient (R) of 0.88. The reference interval was from 2.5 IU/L to 30.8 IU/L with nonparametric method.

Conclusions: The Access EPO assay provided suitable performance for linearity, precision, and detection limits for clinical laboratory. As this assay does not need radioactive isotopes and afforded a short turnaround time (<1 hr), it is expected to be clinically useful especially for the outpatients.

Key Words: Erythropoietin, Evaluation, Reference interval, Chemiluminescence immunoassay (CLIA), Anemia, Polycythemia

J Lab Med Qual Assur 2011 ; 33：83-8

서 론

Erythropoietin (EPO)은 주로 신장에서 생산되는 저분 자량의 당단백 호르몬 (glycoprotein hormone)으로 적혈 구계 조혈 작용에 관여한다. EPO는 골수에서 적혈구계 조혈 을 촉진하는 가장 중요한 인자로 적혈구전구세포(erythroid precursor cell)의 표면에 주로 발현되어 있는 특이 수용체 와 결합하여 작용을 나타내며, 적혈구전구세포의 분화와 증 식을 촉진시키는 동시에 세포자멸사(apoptosis)를 억제하고 말초 혈액의 적혈구 수를 조절하는 역할을 한다[1,2]. 신장 의 EPO sensor에서는 혈액 내 이용 가능한 산소농도를 감 지하여 EPO의 생산, 분비 및 EPO 수용체의 발현 정도를 적 절히 조절한다[1]. 재생불량빈혈, 용혈빈혈, 철결핍빈혈과 같은 경우에는 적혈구용적률 (hematocrit)이 감소하여 산소 농도가 낮으므로 혈액 내 EPO 농도가 증가하고, 말기신질환 (end-stage renal disease)로 인한 빈혈 환자에서는 신장 의 EPO 생산 능력 저하 등의 원인으로 EPO 농도가 감소한 다[2,3]. 적혈구증가증(polycythemia) 환자의 경우에도 EPO 농도는 다양하게 나타나는데, 골수증식종양의 하나로 적혈구용적률이 과도히 증가하는 진성적혈구증가증 (polycythemia vera) 환자에서 EPO 농도는 증가하지 않 는 반면[4], 이차적 원인에 의해 보상적으로 적혈구가 증가 하는 이차적혈구증가증 (secondary polycythemia) 환자에 서는 EPO 농도가 높아 치료가 달라지게 된다[5,6]. 이와같 이 혈중 EPO 측정은 적혈구증가증과 빈혈환자의 감별진단 에 유용하고, 그 외 순적혈구무형성(pure red cell aplasia) 의 진단, 암 환자에서 recombinant human erythro- poietin (rhEPO) 치료의 효과 판정과 용량 조절 등 임상적 유용성이 점차 증가하고 있다.

국내 임상검사실에서는 몇몇 기관에서 방사면역측정법 (radioimmunoassay, RIA)로 혈액 내 EPO 농도를 측정 해 왔으나 최근 들어 보다 민감한 화학발광면역측정법 (chemiluminescence immunoassay, CLIA)를 이용한 EPO 측정법이 개발되었다. 본 연구에서는 CLIA법으로 측 정하는 Access EPO assay (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)의 수행능을 평가하고 기존 RIA법과 의 상관성을 보고자 하였다. 또한 건강한 성인남녀를 대상으 로 한국 성인에서의 EPO 참고범위를 설정하고자 하였다.

대상 및 방법

Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) evaluation protocol 지침에 따라 Access EPO assay (Beckman Coulter)의 정밀도, 직선성, 검출한계, 상관성, 검체 간 교차오염률 등 수행능을 Access 2 장비에서 평가하였고, 한국 성인남녀에서의 참고범위를 설정하였다.

검사에 사용된 모든 시약과 정도관리 물질은 단일 로트 제품 이었다. 시약 보관과 사용은 제조사의 지침에 따랐다.

1. 정밀도(precision)

상품화된 정도관리 물질 Liquichek Specialty Immunoassay Control (Bio-Rad Laboratories, Irvine, CA, USA) level 1 (low), level 2 (medium), level 3 (high)를 이용하여 평가하였다. 20일동안 1일 2회씩 매 검사 마다 2회 반복 측정하였고 이 결과를 이용하여 검사차례내 정밀 도(within-run precision), 검사차례간 정밀도 (between- run precision), 총 정밀도(within-laboratory precision) 을 구하였다[7].

2. 직선성(linearity)

6개 농도물질을 각각 4회 반복 측정하여 직선성을 평가하 였다[8]. 6개 농도물질은 Access EPO Calibrator (Beckman Coulter)와 생리식염수를 0:5, 1:4, 2:3, 3:2, 4:1, 5:0으로 혼합하여 제조하였고 제조된 검체의 기대값은 0.5, 138.6, 293.0, 422.0, 582.2, 732.3 IU/L이었다.

3. 검출한계(limit of detection)

아래 공식에 따라 최소농도 검출한계(lower limit of detection, LLD)와 생물학적 검출한계(biologic limit of detection)을 설정하였다[9].

Lower limit of detection = Mean

+ 2SD

Biologic limit of detection = LLD + 2SD

공백검체(blank sample)로 생리식염수를 이용하여 20회 반복 측정한 값의 평균과 표준편차를 얻었다. 저농도(level 1)의 정도관리물질 Liquichek Specialty Immunoassay Control을 생리식염수로 32배 희석하여 LLD와 유사한 농 도의 EPO가 포함된 검체 (spiked sample)를 제조 후 20 회 반복 측정한 값의 표준편차를 구하였다.

4. 방법 간 비교(method comparison)

다양한 범위의 농도를 가지는 40개의 환자검체를 이용하 여 Access EPO CLIA법의 측정값과 EPO-Trac RIA (DiaSorin Ltd, Wokingham, UK)값을 비교 분석하였다 [10]. 각각 두 번 측정한 값의 평균값을 사용하였으며, 선형 회귀 모델을 이용하여 검사 간 상관성을 평가하였다. 검사법 간의 회귀방정식과 상관계수를 구하였다. 또한 RIA법과 CLIA법의 검사소요시간을 조사하고, 키트 설명서를 비교하였다.

5. 검체 간 교차오염률(carryover)

검체 간 교차오염률의 계산을 위해 정도관리물질 Liquichek Specialty Immunoassay Control level 1 (low, L)과 level 3 (high, H)를 사용하였다. Level 3를 4 회 연속하여 측정한 뒤 연속하여 level 1을 4회 측정하였고 아래 공식에 따라 % carryover를 계산하였다[11].

Carryover (%) = {L1-(L3+L4)/2} ×100/{(H2+H3)

/2-(L3+L4)/2}.

Table 1. Precision of the erythropoietin with Access EPO assay

Level N Mean (IU/L) SD Within-run 　 Total

CV (%) 　 CV (%)

Low 80 11.5 　 0.8 4.1

4.1

Medium 80 37.7 1.4 2.1 3.7

High 80 112.4 　 5.3 2.2 2.6

Abbreviations: SD, standard deviation; CV, coefficient of variation.

Fig. 1. Linearity of erythropoietin assay as determined by analysis of four replicates, each with six equally spaced dilutions.

Fig. 2. Method comparison between Access EPO

and EPO-Trac assay for erythropoietin

measurement.

6. 참고범위(reference interval)

서울아산병원 건강검진센터를 방문한 20~60세의 건강한 성인남녀 중 혈색소, 백혈구, 혈소판, 망상적혈구, 적혈구용 적률, 크레아티닌, 추정 사구체여과율(estimated glomerular filtration rate, GFR), AST, ALT, 혈당, 콜레스테롤, 빌 리루빈 결과가 정상인 남녀 각 60명의 혈청을 이용하여 EPO 값을 측정하고 결과값을 분석하였다[12]. 건강인들의 median age는 남자 45세, 여자 45세였다. 비모수적 방법 (nonparametric method)으로 측정값의 2.5 percentile 에서 97.5 percentile을 참고범위로 설정하였으며 90% 신 뢰구간을 설정하였다.

7. 통계분석

직선성 평가에는 다항회귀분석을 시행하였고 검사간 상관 성 분석은 선형회귀 분석을 이용하였다. 통계분석에는 EP Evaluator Release 8 (David G. Rhoads Assoc., Kennett square, PA, USA)와 SPSS version 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 소프트웨어를 이용하였다.

결 과

1. 정밀도

  정밀도 평가결과, Level 1과 level 2, level 3의 평균 농

도는 11.5 IU/L, 37.7 IU/L, 112.4 IU/L였고, 각 농도별 검사차례내 변이계수는 4.1%, 2.1%, 2.2%, 검사차례간 변 이계수는 4.1%, 2.1%, 2.2%, 총 변이계수는 4.1%, 3.7%, 2.6%이었다(Table 1). 이는 일반화학검사에 대한 Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA) 88의 기준인 10%를 충족하였다[13].

2. 직선성

평가결과 0.5~732.3 IU/L 범위에서 직선성을 나타내었 고, 0.2%의 allowable systematic error 범위 내에서 linear하였다(Fig. 1).

3 검출한계

공백검체와 제조검체에서 예상되는 농도는 각각 0.000 IU/L, 0.357 IU/L이었고, 측정값의 평균은 각각 0.197 IU/L, 0.359 IU/L, 표준편차는 0.031 IU/L, 0.034 IU/L였다. LLD는 0.259 IU/L이었고, 생물학적 검출한계 는 0.327 IU/L이었다.

4. 방법 간 비교

RIA법과 CLIA법의 키트 설명서를 비교한 결과 처음 결과

를 얻기까지의 소요 시간은 각각 26시간과 45분이었다. 보정

물질(calibrator)이 포함되는 범위는 RIA가 6.0~280

Fig. 3. Histogram of erythropoietin values in healthy Korean adults (N=120).

IU/L, CLIA 가5.0~750 IU/L였다. 40개의 환자검체를 이용하여 두 방법을 비교한 결과, 기울기=0.3, R=0.88의 상관성을 나타내었다(Fig. 2).

5. 검체 간 교차오염률

EPO의 검체 간 교차오염률은 0.18% 였다.

6. 참고범위

한국인 정상 성인 남녀 각 60명의 혈청을 이용하여 구한 EPO 농도의 참고 구간은 2.5~30.8 IU/L로 비모수적인 방 법으로 계산하였으며, 90% 신뢰구간은 하한치가 2.36에서 3.72 IU/L, 상한치가 25.49에서 34.42 IU/L까지였다 (Fig. 3).

고 찰

EPO의 혈중 농도 측정을 위하여 임상검사실에서는 RIA 또는 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)법 을 널리 사용하여 왔으나, 최근에는 CLIA법으로 측정하는 키트들이 몇몇 제조사들에 의해 개발되어 시판되고 있다[2].

CLIA법은 기존 방법에 비해 더 민감하며 전 과정이 자동화 되어 대량 검체의 처리도 신속하게 이루어질 수 있다는 장점 이 있다. 본 연구에서 평가한 Access EPO assay의 경우 검 체를 장비에 도입하여 최초 검사결과가 출력되기까지의 소요 시간이 45분으로, 비교평가를 시행한 RIA법이 22시간인 것 에 비해 검사소요시간이 짧아 신속한 결과보고가 가능하다.

또한 Access EPO는 무작위 추가검사(random access)가 가능하다는 장점이 있으며, 검사 시 필요한 검체량은 85 µL 로 다른 방법들에 비하여 조금 적거나 비슷한 정도이다[2].

혈중 EPO의 농도는 진성적혈구증가증의 진단 기준 중에 부기준(minor criteria) 의 하나로 포함되어 있다[14]. 진 성적혈구증가증을 진단하기 위해서는 혈색소나 적혈구용적의 증가, 유전자 변이 등 주기준(major criteria)이외에도 반드

시 1개 이상의 부기준을 만족해야 하고, 혈중 EPO의 측정은 골수 검사 등에 비해 쉽고 간단하게 검사 가능하므로 적혈구 증가증의 감별진단에 유용하게 이용할 수 있다. EPO의 측정 을 진성적혈구증가증의 일차적인 진단 검사(first-line diagnostic test)로 사용할 수 있다는 근거들도 증가하고 있 다[2]. 그 외에 외래에서 rhEPO 치료를 받는 암 환자나 말 기 신질환 환자에게 EPO의 측정은 도움이 될 수 있다.

평가 결과 Access EPO assay는 세 농도에서의 변이계수 가 모두 4.1% 이하로 허용범위 내에 포함되었고 0.5~

732.3 IU/L 범위에서 직선성을 만족하였으며, 검체 간 교차 오염율은 0.18%로 매우 낮았다. 검출한계는 0.259 IU/L로 제조사가 제공한 검출한계인 0.6 IU/L에 비해 더 낮았으며, 참고범위의 하한치인 2.5 IU/L에 비해 충분히 낮았다. 이는 진성적혈구증가증의 진단에 중요하다고 할 수 있다[15].

Mossuz 등[16]은 절대적(absolute) 적혈구증가증을 가진 환자에게서 <1.4 IU/L와 >13.7 IU/L의 EPO 농도 한계치 를 진성적혈구증가증과 이차적혈구증가증의 진단에 사용할 것을 제안하였다.

Access EPO CLIA법과 EPO-Trac RIA법의 비교에서 두 방법간의 상관성은 R=0.88로 우수하였으나, 측정값을 비교하였을 때 RIA법에 비해 Access EPO에서 더 낮은 값 을 보이는 경향성을 나타내었다. 두 방법 모두 WHO 표준 물질인 International Reference Preparation 67/343을 이용하여 표준화되었기 때문에, 두 방법간의 불일치는 사용 된 항체의 종류가 달라서일 수도 있다. 항체의 종류가 다르면 인지하는 항원결정기(epitope) 부위에도 차이가 생겨 측정 물질의 농도에 차이가 발생할 수 있기 때문이다[17].

혈청 EPO 농도에 대해 교과서적으로 나와 있는 참고범위 는 없으며, 제조사에서 제시하는 참고범위는 2.6~18.5 IU/L인데 비해 본 연구에서 설정한 한국인에서의 참고범위 는 2.5~30.8 IU/L로 상한치가 더 높았다. 이 결과는 한국 인에서의 EPO 참고범위 설정에 관한 첫 보고이다. CLIA법 으로 측정하는 또 다른 키트인 Immulite 2000 system EPO assay (Siemens Healthcare Diagnostics, Eschborn, Germany)의 비모수적 참고범위가 3.3~23.4 IU/L로 보 고된 바 있는데[18], 인종 등 참고개체(reference individual)의 특성에 따라 약간의 차이는 보일 수 있다고 생각된다.

요약하면, CLIA법을 이용한 EPO 혈중 농도 측정은 RIA

법보다 넓은 범위에서 직선성을 나타내었고, 우수한 정밀도

를 나타내었다. 또한 본 연구에서는 한국인 성인에서의 참고

범위를 설정하였다. Access EPO assay는 검사소요시간이

평균 1시간 미만으로 외래환자 검사에 적합할 것으로 생각되

었으며, 검사자가 방사성폐기물에 노출되지 않고, 신뢰성 높

은 검사 결과를 임상의에게 신속하게 제공하므로 임상적 활

용도가 높을 것으로 기대된다.

요 약

배경: 혈중 erythropoietin (EPO)의 측정은 적혈구증가 증과 빈혈의 감별 및 recombinant human erythropo- ietin 치료의 효과 판정과 용량 조절 등 적혈구 생성에 관련 된 질환의 진단과 치료모니터링에 유용하다. 국내 임상검사 실에서는 몇몇 기관에서 방사면역측정법으로 EPO 농도를 측정해 왔으나 최근 들어 보다 민감한 화학발광면역 측정법 (chemiluminescence immunoassay, CLIA)를 이용한 EPO 측정법이 개발되었다. 본 연구에서는 CLIA법을 이용 한 Access EPO assay (Beckman Coulter, USA)의 수 행능을 평가하고 한국인 성인에서의 참고 범위를 설정하였다.

방법: Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) 지침에 준하여 정밀도, 직선성, 검출한계, 교차오염 률을 분석하고, 정상 성인에서의 참고범위를 설정하였다. 정 밀도, 검출한계, 교차오염률 평가에는 Liquichek Specialty Immunoassay Control (Bio-Rad, USA) 물질 level 1, level 2, level 3와 생리식염수를 이용하였고, 직선성 검증에 는 전용 calibrator를 CLSI 지침에 따라 혼합하여 여섯 농 도로 제조하였다. 40개의 환자검체를 이용하여 Access EPO CLIA법의 측정값과 EPO-Trac RIA (DiaSorin Ltd, UK) 값을 비교 분석하였다. 참고범위 설정에는 건강검 진센터를 방문한 20~60세의 정상인 120명의 혈청을 이용 하였다.

결과: 정밀도 평가결과 검사내 변이계수와 총 변이계수는 모두 4.1% 이하였으며, 0.5~732.3 IU/L 범위에서 직선성 을 보였고, nonlinearity는 0.2%였다. 검출한계는 0.259 IU/L로 제조사가 제공한 검출한계 0.6 IU/L보다 낮았다.

검체오염률은 0.18%였다. RIA법과의 비교 결과 R=0.88 의 상관성을 나타내었다. EPO 참고범위는 2.5~30.8 IU/L 였다.

결론: CLIA법을 이용한 EPO 혈중농도측정은 넓은 범위 에서 직선성을 나타내었고, 우수한 정밀도를 나타내었다. 검 사소요시간이 평균 1시간 미만으로 외래환자 검사에 적합할 것으로 생각되었다. CLIA법을 이용한 EPO 혈중농도측정은 신뢰성 높은 검사 결과를 임상의에게 신속하게 제공하므로 임상적 활용도가 높을 것으로 기대된다.

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