대한임상명리사회지 : 제 7 권 제 1 호 1975
Diacetyl
Monoxime을 利用한 銀素測定援에 對한 繹驗中央大學校 醫科大學 附屬 聖心病院
朴 - 鎭·徐 德 接
績 論
血波및 民中 17R素定量法에는 여러카지 方法이 있지 만 가장 표統的이 고 傳來的안 方法은 아직 까지 도 Ure- ase法A로 생각된다. 近來에는 自動化機械의 發達과더 불어 可能하면 簡單한 操作파 적 은量의 可檢物로 分析 할수 있고 또한 短時間內에 檢훌를 完 T할수있는 方法 으로써 또한 精密度및 正確性에 있어서도 優秀한 方法 이 가장 現實에 맞는 方法이며 이러한 條件에 相應하 는 여러方法이 考案되어 發表되고 있다. 이런點에서불 혜 Urease블 利用하는 Chaney 및 MarbachD의 方法이 우리 나리-에 셔 많이 探擇되 어 實施中에 있 고 또한 Dia- cethy 1 Monoxime을 利用하고 醒化媒를 變化시 킨 Ro- senthal 法(2,6), Coulombe의 佳住木變法(3,4) 및 Cou-
시키고 總量 1 ， 000ml가 되도록희석하예 칼 색멍에 저장하며 1個日만 使用한다.
c) Arsenic acid reagent ... 16gm의 arsenic pentoxide를 1， 000ml의 농염 선 에 용해 시 케 사용한다. 찰녹지 않으으로 수엘간 카끔 흔 들면서 녹언다.
d) Standard urea nitrogen
0, 20, 40, 60, 80, 100mg~Ö7} 되 도록 (214 mg의 urea를 化學天휴￡료 휴量하여 100ml 의 증류수에 녹이되 灌黃醒을 0.5ml첨가한 다) 희석한다. 이것을 20떼가 되도록 제댄 백액으로 희석한다. 이표준액으로 檢量線을 作成한다(過程 4以下를 寶鎭).
lombe의 Bray변엽 (5， 7) 동의 方法이 우리 주변 에 서 많 過程 :1. 血波 또는 血淸을 Folin-Wu法무로 10倍 除
이 普及되어 實施되고 있다. Urease法은 주先 可檢物 中 ammonia의 除去와 마음 urea를 urease로 作用시 켜 ammonia로의 發生操作， 이 어 서 이 발생 된 ammo- nia의 묵色反應 검P Nessler反應이 나 Berthelot 反應오 로 比色定量하지 만 Diacety lmonoxime法은 直接醒性溶 被中에서 Fearon反應을 시킴으로서 얼단계 조작으로 比色定量함으로 有利한點을 갖고있다. 이點을 應、用하 여 自動化機械에 利用하고 있고 自動化機械에 適合한 方法무로 생각된다. 筆꽃는 上記의 몇가지 方法을 Manual 法A흐 實施하는동안 느낀 몇 가지 知見을 보고 하며 아울러 Urease블 利用하는 Chaney 몇 Marbach 의 方法과 Diacethy lmonoxime을 利用하는 Rosenthal 方法과의 比較試驗도 考察하여 보았다.
쩌IJ 定術式
1. Rosenthal法 (2， 6) 試藥 a) Folin-Wu除蛋白試藥
b) Diacethylmonoxine"'5.0gm의 diacethylm- onoxime을 10 % acetic acid 100ml 에 용해
蛋白을 實施하고 다시 2倍후 희석한다 (10倍滅으로 빨1 색시키면 너무 파도한 살색이되어서 불펀하다).
2. 試驗管 2個에 T(검체)및 B(맹검) 표시를 한마 3. 各各 하당하는판에 제단백여액 1ml(T) 와 제단액 시 약 1ml(B) 블 넣는다.
4. 양판에 5ml의 diacethy lmonoxime과 3ml의 arse- nic acid시 약을 넣고 섞 는마. 마개 를 한다.
5. 끓는블에 30分間 담거 말색시킨다. 流水에 冷혜
시킨후 480mu 波長에서 B 블 對照로 하여 T 의 吸光
度블 求한다.
計算: 標準曲線에 서 含量을 求한다.
2. Coulombe으| 住住木變法(3.4)
試藥: a) Diacetylmonoxine 試藥… diacethylmonoxine 6.0gm와 thiosemicarbazide O. gm를 증류수 에 녹여 總量 1， 000ml로 희 석 한다.
過程:
b) 34 % phozphoric acid .. '400ml의 灌憐醒을 증 류수로 희 석 하여 총량 1， OOOml로 만든다.
1. 시험판 2個를 준비하여 T( 검체)및 B(맹검) 표
직을한다.
2. T 관에는 血淸0.02ml B 판에는 증류수 0.02ml를 micropipette로 넣 는다.
3. 각관에 diacethy lmonoxide시 약 0.5ml와 phosp- horic acid 2.5ml를 넣 고 잘섞 는다. 마개 를 한다.
4. 각판을 끓는 水慢中에 20분간 담군다음 유수에 냉각시컨다. 540mu波長에서 B 를 對照로 하여 T의吸 光度를 求한다.
5. 標準檢量線을 Rosenthal法에 서 만든 除蛋白하지 않은 0, 20, 40, 80, 100mg% urea mitrogen에 해 당 하는 標準滾으로過程 2以下의 操作을 實施하여 標準曲 線을 그러 고 檢體의 함량을 求한다.
3. Colulombe으I Bray변 법 (5,7)
훌뭘藥 : a) Diacethylmonoxide試藥… 19m diacethylm-
onoxime과 0.2gm의 th iosemi bazide와 9.0 gm의 sod. Chloride를 증류수에 녹여 총량 1 ， 000ml로 만든다. 칼색병에 保管使用한다.
過程:
b) Sulfuric-phosphorlc acid 용액 … 60ml의 黃 廳및 10ml의 憐醒을 約 800ml의 증류수에 용 해 시 키 고 다시 O.lgm의 Ferric chloride를 넣 어 녹이 고 총량 1 ， 000ml로 희 석 하여 사용한 다.
c) Standard urea nitrogen
Rosenthal法에 서 와 똑같이 조작하여 20x 희 석액으로 반응을 시킨다.
(파정 3 以下의 조작을 설시 한다).
1. 血滅 또는 血淸을 Folin-Wu法이로 10 倍 除蛋白 훨을 實施하고 다시 2倍로 희 석 한다.
2. 시험판 2個에 T( 검체)및 B( 맹검) 표식을 한다.
3. 各各 해당하는 T 판에 20x 제단백 검체 1ml 빛 B 에 제단백 시약 1ml블 넣는다.
4. 양관에 diacethy lmonoxime 시 약 3.0ml 및 sulf- uricphosphoric acid용액 3.0ml썩 넣 어 섞 는다.
5. 끓는물에 15分간 담거 발색시킨다. 流水에 냉각
시킨후 520mu 波長에서 B 블 對照로 하여 T 의 吸光
度를 求한다.
(註: 民中民素는 民블 100배 . 또는 200배 희 석 하여 질 시하고 결파에 100배 또는 200배를 하여준다)
4. Chaney 및 Marbach으I Urease法-phenate
hypo Chlorite法
훌훌藥 : a) Urease 錢衝被…Sigma urease 150mg와 E.
D.T.A 2Na 1. Ogm를 約 80ml의 증류수에 녹 이고 pH를 6.5로 수정한후 0.2ml썩 分注 速 結하여 두면서 使用한다.
過程:
b) Phenol皇色試藥… phenoI 50gm, sod. Nitro- prusside 25mg를 증류수에 녹여 100ml로 만 든다.
c) Alkali-hypochlorite 試藥… sod. hydroxide 2 .5gm블 약 50ml의 증류수에 녹이 고 sod.
hypochlorite 原滾 4.0ml를 加하여 섞 고 증 류수를 추가하여 100ml로 만든다.
d) Standard urea nitrogen ... Rosenthal法과 같 이쓴다.
1. 시험판 2個에 T(檢體)및 B(롭檢) 표식을한다.
2. 各管에 urease 완충액 0.2ml썩 넣 는다.
3. T 판에는 血淸(검체) O.Oml B 판에는 증류수(맹 검) 0.02ml블 넣고 마개를 한다.
4. 각판을 실온에저는 30分 (250C) ， 370C 에셔는 15분 570C에서는 5분간 가온하여 분해시킨다.
5. 각판에 1.0ml의 phenol시 약과 1. Oml의 alkaline hypochlorite 시 약 1. Oml썩 넣 어 섞 고 실 온이 타면 30 분 370C꾀-면 15분， 560C라면 5분간 말색시킨다.
6. 8.0ml의 증류수를 가하고 잘섞은後 B 블 對照로
하여 500,...,660mu 범위의 波長에서 T 의 吸光度를 求
한다. 標準滾으로 과정 2 以下의 조작을한 標準曲線에 서 검체의 함량을 구한다.
考 察
1. Rosenthal method(HCI-arsenic pendoxide 를 醒化媒로 쓰는 Rosenthal法의 考察)
20, 40, 60, 80, 100 mg %의 standard urea nitrogen
용액을 使用하여 4次에 걸쳐 standard calibration을 實施하였던바:
1 次에 서 20mg% (.18) 40mg% (.44) 60mg% (.74) 80mg% (1. 10) 100mg% (1. 40)
2 次에 셔 20mg% (.18) 40mg% (.44) 60mg% (.74) 80 mg% (1.10) 100mg% (1.40)
3 次에 서 20mg% (.18) 40mg% (.44) 60mg% (.74) 80 mg% (1.10) 100mg% (1. 40)
4 次에 서 20mg% (. 18) 40mg% (.44) 60mg% (.75) 80 mg% (1. 14) 100mg% (1. 44)
의 吸光度를 보여 (表1) 4차의 검사가 거의 일치하는 흡광도와 표준곡선을 보였다. 이런點으로 보아 재현성 (再現性)이 차차 좋고 術者의 個人差도 보여주지 않았 A나 檢量線은 약간 鏡曲판 曲線을 나타내었다.
2. Coulombe으| 住住木變法 (34% 의 彈한 t憐명꼈을 醒 化媒로 쓰는 佑뾰未變法의 考察)
O.D 2∞
O.D‘
깅 α〕
.. (2 차)
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/ / ‘ / , ' / / , / - / / /ι깃/
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0 1.80
1.00 80 1.20 1.60 1.40
(4 차) (1 ， 2 ， 3 차)
1.80 1.60
1.20
60
-1.00 80 '1.40
.60 .40 20 .40
100 mg%
1.40 1. 54 1. 30 100 mg%
60 80 20 40
100 mg%
100 mg%
60 80 20 40
0
)'(1 차) /，， (2 차)(3 차)
1.00
60
.40 차 차 차 .80
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.:80
60
. .40
.20
~I 짧% 값g%
1꿇%1 업g% |
100 mg'7'o
100 mg%
1.00 .95 .95
1 차 2 차 3 차 表 3. Coulombe의 Bray 밴 볍 (자불시 간 15분)
\ |
짧%1 꿇%|
짧%1 짧%|
앓?。0
80 60 40 20 0
20, 40, 60. 80, 100 mg?~ 의 εtandard urea n;trogen 용액 을 使用하여 3차에 걸쳐 standard calibration을實 施하였던바:
1 次에 샤 20mg% (.28) 40mg% (.54) 60mg% (.84) 80 mg% (1. 14) 100mg% (1. 40)
表 6. Urease法과 Diacethy 1 monoxime法의 비 교 Specimen
No.
Urease Method
없
뼈
nu
M m
i
‘
。〔ψ
N .m
n잉
”u D
1따
’n
빠 뼈 1 nm
M
I
E$鋼alI
Dif. Bias1. 31. 5 31. 0 -0.5 1 35. 50.0 44. 0 5.0
2. 25.0 19.0 5.0 36. 20.0 16.0 3.0
3. 25.0 18. 0 6.0 37. 14.5 10.0 3.5
4. 66.5 70. 0 -4.5 38. 18. 0 18.0 -1.0
5. 20.0 15.0 4.0 39. 18.0 16.0 1.0
6. 86.5 86.0 -0.5 40. 18. 0 17.0 O. 0
7. 23.0 17 0 5.0 41. 24.0 23.0 0.0
8. 16.5 14.0 1.5 42. 18.0 17.0 0.0
9. 16.5 14.5 1.5 43. 19. 0 19.0 -1.0
10. 100.0 100.0 -1.0 44. 11. 0 10.0 0.0'
11. 20.0 15.0 4. 0 45. 86.0 92.0 -7.0'
12. 20. 0 15.0 4.0 46. 15.5 17.0 -2.5
13. 25.0 18.0 6.0 47. 20.0 19.0 0.0
14. 22. 0 18.0 3.0 48. 152. 0 140.0 11. O'
15. 164. 0 153.0 10. 0 49. 29.0 30.0 -2.0
16. 59. 5 55. 2 3.5 50. 17.0 19.0 -3.0’
17. 22. 0 23.0 -2.5 51. 9.2 7. 0 1. O.
18. 56.0 58.0 -3.0 52. 42.0 37.0 4. 0‘
19. 13.5 13.0 -0.5 53. 46.0 48.0 -3.0
20. 16.0 15. 0 54. 40. 0 34.0 5.0‘
21. 33.0 3.0 55. 14.0 16.0 -3. ()
22. 82. 0 95. 0 -14.0 56. 29.0 27.5 0.5
23. 90.0 102. 0 -13.0 57. 15. 0 18.5 -4.5
24. 34.0 35.0 -2.0 58 45.0 52.0 -8.0
20. 30.0 27.0 2.0 59. 14.0 15.5 -2.5
26. 25.5 22. 0 2.5 60. 25.0 23.0 1.0’
27. 13.8 13.0 -0.2 61. 97.0 94.0 2.Û'
28. 40. 0 35. 0 4. 0 62. 20.0 20.0 -1. 0,
29. 10.0 11. 0 -2.0 63. 10.0 10. 0 -1. O.
30. 20.0 18.0 1.0 64. 40. 0 40.0 -1.0
31. 72. 0 77.0 -6.0 65. 31. 0 30.0 -0.0
32. 81. 0 77.0 3.0 66. 12.0 17.7 -6.7
33. 20.0 19.0 0.0 67. 13.0 13.9 -1.9
34. 43. 0 48.0 -6.0 68. 16.0 14. 7 0.3
Average 36.4 35.4 (+ 1.0)
2 次에 셔 20mg% (.34) 40mg% (.62) 60mg% (.92) 80 mg% (1. 24) 100mg% (1. 54)
3 次에 저 20mg% (.25) 40mg% (.52) 60mg% (.78) 80 mg% (1. 04) 100mg% (1. 30)
의 吸光度를 보여(表 2) 3차의 검사가 거의 直線을 보 였으나 吸光度에셔 많은 差異를 보여 再現{生。1 不꽃하 고 術者의 個人差드 많은 差異를 보여 검 사를 實施할 배마다 標準波을 使用하는 것이 좋다고 생각되었다.
3. Coulombe法의 Bray 변 법 (弱한 볍꼈을 사용하는 Coulombe法의 Bray 變法에 對한 고찰)
20, 40, 60, 80, 100mg% 의 standard urea nitrogen
용액 을 사용하여 3次에 걸쳐 standard calibration을實 施 하였먼바:
1 次에 셔 20mg% (. 20) 40mg% (.34) 60mg% (.46) 8() mg% (.75) 100mg% (.58)
2 次에 셔 20mg% (.17) 40mg% (.32) 60mg% (.43) 8()
、
.
n = 68
120 엄 110 E @ 100
。。 90
I
·•’
비
E
80
70
- -
60
」각
I 」·Z비
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I •.
• 0.-1. :
.~:: J ••
: . 0 ‘ .
50
20‘·
40 30
10
160 130 140 15。
|α) I!O 120 80 90
50 60 70 20 30 40
、 10
mg%
METHOD UREASE
표 7.
자불한것은 30分간 자불한것과 벨 차이가 없음을 보였 다(表 5)
上記의 考察을 토대로 하얘 Diacethy lmonoxime을 사용하는 짜띔測펀法中 比較的 再現性이 좋고 術者의 個人差도 적 다고 판정 된 Rosenthaì 法·파 가잔 정 통적 으로 생 각되 어 온 Urease法을 使用하여 本[完에 來院한 68例에 해망하는 검사물에 對하여 캠사른 설시하였닫1 바 Urease法의 산술평 균치 가 Rosethal의 산출평 균치 보다 1.00mg% 높게 나타났고(表 6 ), 國재Ij定個의 상판 도표(表 7) 도 상판판계가 양호하였으며 F휩法에 對한
Sd=Jτ(퍼H같양ce-Bias)2 =4 3이 였고
mg% (.70) 100mg%
3 次에 셔 의 20mg% (.18) 40mg% (.32) 80rng(.72) 100rng(.54)
의 吸光度를 보여 (表 3) 100rng% 의 흡광도가 80rng%
의 흡광도 보다 낮아 發色의 문제點을 보여주었다. 저 자는 발색의 부진。1 時間과 영향이 있는가를 생각하여 자불시 간을 30分으로 연장하여 上記와 같은 方法으로 .std. ca Ii bration을 實施 하였 던 바 :
1 次 20rng% (.28) 40rng% (.47) 60rng% (. 66)80rng%
(.78) 100rng% (1. 00)
2 次 20rng% (.24) 40rng% (.46) 80rng% (.79) 100rng
% (.95)
60rng% (.44)
T{直는
一定한 환경과 조작을 훈‘각 %、는 F 훈 1l 햄 k’에저는 上記의 方法이 좋은 方法으로 생 각이 되 는데 Manual 法으로서는 않은 문제점이있다. 더구냐 우리나라와 같 이 시 약사정 이 여의치 못한 입장에서는 text book 에껴1 제펀 方法이라고 하여도 상당한 검토가 펼요하다고 느
1. 9(p는 O. 005 以下) 였 다.
結 論 3 次 20rng% (.24) 40mgrng(.68) 60rng% (.68) 80mg
% (.79) 100rng% (.95)
의 l及光度를 보여 (表 4) 3차의 검사가 거의 유사한曲 綠을 보여 자불時間이 말색에 관여하는것을 보여주었 다. 이에 40rng% 의 標準波을 使用하여 15分 30分 40 分씩 자불시 간만 연장하면서 4차에 걸쳐 흡광도를 관 찰한즉 15分간 자불한것 은 GD.36 ~.32 ~.35 @D.37 의 흡광í블 보였으며 똑같은 것을 30分간 자불한것은
<D. 39 ~. 44 ~. 49 @D. 52의 의 흡광도를 보였 으며 40分간
6th Editioη， p.259, 1962.
3) Coulombe, J.J., and Favreau.: A ηew simple semimicro method for colorimetric determinat- ion of Urea. Cliη• Chem. 9 : 102-108, 1963.
4) Kanai, Izumi. ete.: Rinshokeηsahoteeiyo. 25th, ed. pp. VH -38, 1968.
5) lohn D. Bauer, Gelson Toro, Philip G. Acker- mann. : Bray’ s Clinical Laboratory Alethods, 7th ed., p.308, 1968.
6) Samuel Y. Lee. : Laboratory Methods iη Cliη
ical Pathology, p.191, 1970.
7) D.K. Suh, J.S. Lee, Y.S. Kim, K.E. Yoon.:
Laboratory Methods iη Clinicαl Chemistry,3rd
Editioη ， p.66, 1974.
껴 진마. 그러 나 測定時마다 귀 찮다고 생 각말고 Stand- ard Calibration Curve 만 작성 한다면 R03enthal法 Coulombe의 住佳木變法은 좋은 方法이 리-고 생 각되 며 충분한 검토를 하여 자불시간만 연장한마연 Coulombe 의 Bray변법도 좋은 成積을 얻을수 있다고 思料되었다.
1) Linch, M.T., Raphael, S.S., Mellor, L.D.,Spare , P.D., and Inwood, M"].H. : Medical lαborato
ry technology α nd Cli,lÍcal Pathology, 2nd ed.
pp. 109, 1969.
2) lohn D. Eauer, Gelson Toro, Philip G. Acker- Bray’s Clinical Laboratory Methodes‘
REFERENCES
mann
f祝3
률훌 二三;플
뜯를뜸홉쫓
o o
회 박멸 협
주 복
-중 연 우
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71
회 장 사무총장
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사단 법인
섭 곤 식 옥 중 직 기 종 수 수 기 원 완 상 용 종 인 인 용 병
오 이 박 윤 안 권 입 김 서 한 김 김
사무국장 사무국장 사무국장 사무국장 사무국장 사무국장 사무국장 사무국장 사무국장 사무국장 사무국장 서울지부
부산지부 경기지부 강원지부 충북지부 충남지부 전북지부 전남지부 겸북지부 경남지부 제주지부
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