Expression of Proteins Related Cell Cycle and Apoptosis during Diethylnitrosamine (DEN)-induced Hepatocarcinogenesis in Rats
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(2) 360 J Korean Surg Soc. Vol. 75, No. 6 실험적으로 동물에서 간암을 유발하는 방법으로는 ni-. 단백은 survivin 유전자의 전사를 억제시키는 것으로 알려. trosamine 계열의 diethylnitrosamine (DEN)이나 aflatoxin B1. 지고 있는데, p53의 기능상실이 인체의 다양한 악성종양에. 등을 투여하는 방법이 가장 널리 사용되고 있는데, DEN을. 서 survivin의 과 발현을 유도시킨다는 보고도 있다.(8) 결국,. 이용한 실험적 간암 모델은 간암의 전구병변으로 간주되고. 종양이 형성되는 과정에서 세포증식과 세포자멸사에 대한. 있는 비정형성 증식, 샘종의 발생에 이어 인체에서 발생하. 연구는 암의 병인론을 이해하는데 중요하다고 생각한다.. 는 간암과 형태학적으로 유사한 병변이 초래되어 이상적 모델로 이용되고 있다.(1). 본 연구의 목적은 흰쥐에 발암물질인 DEN을 투여하여 발생되는 간암의 형태적 병화를 관찰하고, 각 단계에서 세. 화학적 발암물질에 의해 악성으로 형질 전환된 세포의. 포주기 조절인자(cyclin D1, p27Kip1 protein)와 세포자멸사 조. 핵심적 특징은 지속적이며 자율적인 증식과 사망회피가 동. 절인자(caspase 3, survivin, p53 protein)의 발현을 측정하여. 반되며, 여기에는 암세포 내 세포주기의 진행과 증식에 관. 간암의 분자 생물학적 특성을 이해하고자 하였다.. 여하는 신호전달체계와 세포자멸사 조절에 이상이 있기 때. 방. 문으로 해석되어진다.(2) 종양형성에 관여하는 세포주기조절인자로 촉진인자인 cyclin 계열 단백과 이들과 결합하여 활성을 나타내는 촉매. 법. 1) 연구 재료. 단위인 cyclin dependant kinase (CDK)와 억제인자인 cyclin. (1) 실험동물 및 약물: 실험에 사용된 동물은 생후 8주 이. dependent kinase inhibitor (CDKI) 등이 있는데, 이러한 세포. 내의 체중 150∼160 gm의 Sprague-Dawley계 흰쥐 수컷 60. 주기 조절인자의 이상이 다양한 종양의 발생과 진행과정에. 마리(실험군 50마리, 대조군 10마리, Samtaco Biokorea)를. 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.(3). 사용하였고, 사료는 시판되는 쥐-햄스터용 반합성 사료와. Cyclin 계열 단백 중에서 가장 대표적인 것이 cyclin D1. 수돗물로 사육하여 일주일간의 적응기간을 거쳐 실험에 사. 단백으로, 이 단백의 작용기전은 세포증식을 조절하는 감. 용하였다. 실험에 사용된 발암제는 diethylnitrosamine (DEN). 시관문으로 가장 중요한 단계인 G1/S기의 이행단계에 작용. [(C2H5) 2NNO], Sigma Co, Missouri, USA)을 사용하였다.. 하는 주 조절단백으로 이 단백의 이상발현은 조절되지 않 는 세포성장을 초래해 종양의 발생에 관여한다.(4) CDKI군. 2) 실험 방법. 에 속해있는 p27Kip1 단백의 주 작용은 일종의 종양억제 유. (1) 실험동물의 약물처리: 간암을 유발시키기 위해 실험군. 전자로 cyclin D1-CDK4 복합체와 결합하여 CDK의 활성을. 은 수돗물에 DEN을 120 ppm농도로 섞어 12주 동안 투여. 억제해서 G1기에서 S기로 이행하는 과정을 차단함으로써. 후 일반 수돗물로 대체한 다음 18주 동안 사육하였다. 대조. 세포분열을 중단시키는 기능을 한다.(5). 군은 처음부터 18주간 수돗물만 사용하였다.. 한편 세포자멸사의 억제로 인한 세포의 수명연장이 악성. (2) 조직표본 제작: 실험군은 실험 시작 후 3주, 6주, 9주,. 종양의 발생과 더불어 종양의 진행에 영향을 미친다고 알. 12주, 15주에 각각 6 마리씩, 그리고 실험이 종료되는 18주. 려져 있다.(6) 최근 caspase 의존성 및 비의존성 작용기전을. 에 생존해 있는 7마리 흰쥐를 이산화탄소 챔버를 이용하여. 통하여 세포자멸사를 억제하는 새로운 단백들이 발견되었. 질식시킨 후 개복하여 간 조직을 일정하게 왼쪽엽에서 절. 는데, 그중의 하나인 survivin은 가장 대표적인 것으로 세포. 편을 택하여 10% 중성 포르마린에 24시간 고정한 후 통상. 자멸사의 억제와 더불어 세포주기 중 G2-M기에 발현되어. 적인 방법으로 파라핀 포매조직을 만들어 4∼5μm 두께로. 유사분열방추의 미세관(microtubles of mitotic spindle)의 활. 박절하여 hematoxylin-eosin 염색(HE-stain)을 실시하여 광학. 동성을 조절한다. 따라서 과 발현될 경우 세포의 증식을 도. 현미경으로 관찰하였다. 간 병변의 형태적 소견은 Maronpot. 와 암의 진행에 중요한 역할을 한다고 보고되고 있다.(7). 등(9)의 판정기준에 따라 다음과 같이 하였다.. 대표적 종양억제 유전자인 p53 단백은 발암물질 등에 의해. ① 세포 변이소(foci of cellular alteration): 간 실질에 세포. DNA가 손상되면 p53이 활성화되고 세포는 세포주기 중 G1. 의 이형성이 없이 세포질이 공포성, 호산성, 호염기성 변화. 기에 머물게 하여 손상된 DNA를 복구시킨다. 그렇지만. 를 보이는 세포집단군이 관찰되지만 간세포의 소엽구조가. DNA의 손상이 심할 경우엔 실행 caspase-3에 의한 엔도뉴. 보존되어 있는 경우; ② 간세포증식(hepatocellular hyper-. 클리아제를 활성화시켜 세포자멸사가 유도된다. 또한 p53. plasia): 간세포의 이형성이 동반되면서 결절형으로 세포집.
(3) Woo Jung Sim, et al：Expression of Proteins Related Cell Cycle and Apoptosis during Diethylnitrosamine (DEN)-induced Hepatocarcinogenesis in Rats. 단이 관찰되나 세포의 소엽구조는 유지되어 있고 주변실질. 361. 하였다.. 세포의 압박이 없는 경우; ③ 간샘종(hepatocellular adenoma):. (4) 통계처리: 실험적 간암 발생과정에서 출현하는 증식성. 세포의 이형성이 동반되며, 주변실질을 압박하며 증식하는. 병변의 형태학적 분류에 따른 세포증식 표지 지수, 세포자. 결절형 병변으로 간 세포가 1∼2층으로 배열되며, 소엽구. 멸사 빈도, cyclin D1, p27Kip1, p53, survivin, 그리고 caspase. 조가 소실되어 있는 경우; ④ 간암(hepatocellular carcinoma):. 3의 발현의 분석 단위는 흰쥐의 개체가 아니라 흰쥐의 간에. 세포학적으로 악성을 보이며 악성세포의 배열이 3층 이상. 출현하는 각각의 증식성 및 종양성 병변에서 조직을 채취. 의 층판 또는선형을 보이며 빈번한 괴사와 출혈이 동반되. 하여 측정하였고, 전이성 병변은 폐에서 관찰된 전이성 병. 는 병변; ⑤ 전이성 간암(metastatic hepatocellular carcinoma):. 소에서 하였다. 측정치의 통계적 유의성을 검정하기 위해. 폐실질 또는 폐혈관내에 명백한 간암의 전이성 병변이 관. one way ANOVA, t-test, 그리고 chi-square 검정을 실시하여. 찰된 경우로 표기하였다.. P값이 0.05 미만인 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 판정. (3) 면역조직화학염색: 파라핀 포매조직을 4∼5μm 두께. 하였다.. 로 박절하여 코팅슬라이드에 부착시키고 파라핀을 제거한 다음 통상적인 방법으로 알코올로 함수과정을 거친 다음, 감춰진 항원을 노출시키기 위해 citric acid 완충액에 넣고 고압극초단파(750 w)에서 20분간 또는 EDTA로 처리하였. 결. 과. 1) 병리조직학적 소견. 다. 그 후 Tris 완충용액으로 세척하고 avidin-biotin complex. 총 60마리의 흰쥐 중 실험기간 동안 사망한 쥐 16마리를. 방법을 이용한 통상적인 방법으로 면역조직화학 염색을 시. 제외한 44마리(실험군 37마리, 대조군 7마리)의 흰쥐에. 행하였다. 세포증식능은 PCNA (proliferating cell nuclear an-. DEN 투여 후 간의 형태적 변화를 3주 간격으로 18주 동안. tigen) 항체(mouse monoclonal, 1：1,000 Novocastra Co, UK),. 관찰하였다. DEN 투여 3주 후에는 일부에서 문맥부위에 간. 세포자멸사는 TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase. 세포 괴사 후 세포질이 공포성 또는 호산성으로 보이는 세. mediated dUTP nick end labeling) 방식을 이용하여 Tdt DAB. 포변이소가 출현하였고, 6주 후에는 부분적으로 증식성 결. in situ apoptosis detection kit (Travigen Co, USA) 제품을 사. 절이, 9주 후에는 대부분의 경우에서 다양한 증식성 결절이. Kip1. , survivin,. 출현하였다. 12주 이후에는 세포의 이형성을 보이며 주변. p53, caspase3의 측정은 cyclin D1항체(mouse monoclonal 1：100,. 실질을 압박하는 샘종이 관찰되었고, 12주 이후에는 불규. MS-1203, Neomarker, USA), Rb항체(rabit polyclonal, 1：50,. 칙한 층판을 형성하고 핵의 이형성이 심한 간암이 출현하. Santa Cruz SC-102, USA), p27항체(mouse monoclonal, clone. 기 시작하였고, 15주 이후에는 출혈을 동반한 전이성 병변. DCS-72, Lab vision Co, USA), survivin항체(mouse mono-. 이 폐 실질에서 관찰되었다(Fig. 1, Table 1).. 용하여 측정하였다. 또한 cyclin D1, Rb, p27. clonal, MS-1203, 1：100, Neomarker, USA), p53항체(mouse monoclonal, MS-104, 1：100, Neomarker, USA), 그리고 cas-. 2) 세포증식 표지 지수와 세포자멸사 지수. pase 3항체(rabit polyclonal, ab4051-500, 1：100, Abcam,. PCNA 염색은 핵에 미만성으로 염색되었다(Fig. 2). 정상. USA)를 각각 사용하여 실온에서 2시간 동안 반응시켰다.. 간세포에서 PCNA 표지지수는 정상 간 조직에서는 1.24±. 발색제는. 사용하였고. 0.52, 변이 세포소에서는 2.32±3.65로 문맥부와 소엽에 있는. Mayer's hematoxylin으로 대조 염색하여 글리세린으로 봉입. 일부 상피세포에서 산발적으로 출현하였다. 또한 증식증에. 한 다음 광학현미경(Olympus BX50, Japan)으로 관찰하였다.. 서는 17.12±13.52, 샘종에서는 48.75±11.82로 증가양상이 뚜. 면역조직화학 염색의 음성대조군은 일차항체 대신 Tris 완. 렷하였고, 간암에서는 66.33±17.67, 전이성암에서는 75.52±. 충용액을 이용하여 같은 염색을 실시하였다.. 15.91로 나타나 종양이 진행할수록 세포증식은 통계적으로. 3-amino-9-ethyl-carbazol. (AEC)을. 양성세포의 판정은 통상적인 방법으로 세포증식능과 세 포자멸사는 각 병변당 4 부위에서 최소 1,000개의 세포를 Kip1. 세어 백분율(%)로 나타내었고, cyclin D1, p27. 유의하게 증가하였다(P＜0.01)(Fig. 3A). 세포자멸사는 간암 발생과정의 각 종 병변에서 특정부위. , p53, survi-. 에 편재되지 않고 흩어져서 관찰되었다(Fig. 4). 세포자멸사. vin은 세포의 핵에, caspase 3은 세포질에 과립성 색소의 침. 표지지수는 정상대조군 0.12±0.06, 세포변이소 0.59±0.31,. 착이 전체 병변에서 10% 이상을 보일 경우 양성으로 판정. 증식증은 0.77±0.25로 병변이 진행할수록 증가하는 양상을.
(4) 362 J Korean Surg Soc. Vol. 75, No. 6 Table 1. Incidence of histopathological lesions during hepatocarcinogenesis in DEN rat Lesions Groups (weeks) Rat No. FCA* Hyperplasia Adenoma HCC† MHCC‡ Control 3 6 9 12 15 18 Fig. 1. Gross finding: multinodular hepatocellular carcinoma after 14 weeks of administration of DEN.. Fig. 2. Diffuse positive immunostaining for anti-PCNA in metastatic lesion in lung (×200, ABC stain).. 7 6 6 6 6 6 7. − 4 3 3 − 1 −. − − 2 5 3 1 −. − − − 1 4 3 2. − − − − 1 3 5. − − − − − 2 5. † *FCA = foci of cellular alteration; HCC = hepatocellular carcino‡ ma; MHCC = metastatic hepatocellular carcinoma.. Fig. 4. Hepatocellular carcinoma showing multifocal apoptotic nuclei (×200, TUNEL stain).. Fig. 3. PCNA (A) and Apoptotic (B) labeling indices (LI) of the liver lesions treated with 120 ppm DEN-induced rat hepatocarcinogenesis..
(5) Woo Jung Sim, et al：Expression of Proteins Related Cell Cycle and Apoptosis during Diethylnitrosamine (DEN)-induced Hepatocarcinogenesis in Rats. 보였으나 통계적 유의성은 없었다(Fig. 3B). 그렇지만 샘종. 363. 통계적으로 유의하게 증가하였다(P＜0.01)(Fig. 6).. 에서는 1.92±0.64, 간암은 2.43±1.42, 그리고 전이성 간암에. p27Kip1 단백은 정상 간조직에서는 28% (2/7)에서 발현되. 서는 3.86±1.25로 나타나 악성으로 진행할수록 통계학적으. 었고 세포변이소에서는 30% (3/10)의 발현을 보였다. 또한. 로 유의하게 높았다(P＜0.05)(Fig. 3B).. 간세포 증식증에서는 55% (6/11), 간 샘암에서는 50% (5/10). 3) Expression of cyclin D1, p27. Kip1. , p53, survivin, cas-. pase 3 in the liver of rats during DEN-induced hepatocarcinogenesis. 에서 양성발현을 보였으나, 간암에서는 44% (4/9), 그리고 전이성 간암 7예 중 3예(43%)에서 양성을 보여 간암이 진행 할수록 감소하는 경향을 보였으나 통계적 유의성은 없었다 (P＞0.05)(Fig. 6).. Cyclin D1 단백은 정상대조군에서는 관찰되지 않았고, 세. p53 단백은 정상 간세포, 세포변이소 그리고 증식증에서. 포변이소, 증식증, 그리고 간세포 샘종에서는 일부에서 양. 는 음성반응을 보였다. 간세포 샘종에서는 10% (1/10)에서. 성 반응이 관찰되었다(Fig. 5, 6). 그렇지만 간암에서는 전체. 양성반응이 관찰되었다(Fig. 7A). 그렇지만 간암에서는 전. 9예 중 4예(44%)에서 양성반응을 보였으며, 특히 전이병소. 체 9예 중 5예(55%)에서 양성반응을 보였으며, 특히 전이병. 에서는 86% (6/7예)의 발현율을 보여 종양이 진행할 수록. 소에서는 71% (5/7예)의 발현을 보여 암이 진행할수록 통계 적으로 유의하게 증가하였다(P＜0.01)(Fig. 8).. Fig. 5. Positive nuclei staining of cyclin D1 in hyperplastic nodule (×200, ABC stain).. Fig. 6. Positive expression rate of cyclin D1, Rb, and p27 protein.. Fig. 7. Hepatocellular carcinoma showing cytoplasimic positive staining of p53 protein (A) and survivin (B) (×200, ABC stain)..
(6) 364 J Korean Surg Soc. Vol. 75, No. 6 Survivin 단백 발현은 정상 간세포, 세포변이소에서는 발 현되지 않았다. 간세포 증식증에서는 18% (2/11), 샘종은. 4) Cyclin D1단백 발현과 p27Kip1 단백 발현의 연관성. 10% (1/10), 간암종은 22% (2/9), 그리고 전이성 병변에서는. Cyclin D1 단백 발현이 음성인 경우 p27Kip1 단백 발현이. 29% (2/7)의 발현을 보여 병변이 진행할 수록 증가하는 양상. 음성인 경우는 57%, 양성인 경우는 78%였으며, cyclin D1단. 을 보였으나 통계적 유의성은 없었다(P＞0.05)(Fig. 7B, 8).. 백 발현이 양성인 경우 p27단백 발현이 양성인 경우는 22%. Caspase 3 단백은 정상 간세포, 세포변이소에서는 발현되. 였고, 음성인 경우는 43%로 cyclin D1 발현과 p27Kip1 단백발. 지 않았고, 간세포증식증과 샘종에서는 9% (1/11)와 10%. 현에 대한 통계학적인 유의성은 없었다(P＝0.174)(Table 2).. (1/10)에서 양성이었다(Fig. 8, 9). 그렇지만 간암과 전이성 간암에서는 각각 44%와 56%로 간암이 진행할수록 통계학. 5) p53단백 발현과 survivin, caspase 3 단백 발현의 연 관성. 적으로 유의성을 보였다(P＜0.05)(Fig. 8).. p53단백 발현이 음성인 경우 survivin단백 발현이 음성인 경우는 85%, 양성인 경우는 43%였으며, p53단백 발현이 양 성인 경우 survivin 단백 발현이 양성인 경우는 57%, 음성인 경우는 15%로 통계학적인 유의성이 있었다(P＝0.001) (Table 3). 한편, p53 단백 발현에 따른 caspase 3 단백 발현 양상은 p53단백 발현이 음성인 경우 caspase 3 단백 발현이 음성인 경우는 93%, 양성인 경우 30%였으며, p53단백 발현이 양성 인 경우 caspase 3 단백 발현이 양성인 경우는 70%, 음성인 경우는 7%로 통계학적 유의성이 있었다(P＜0.0001)(Table 3).. Fig. 8. Positive expression rate of p53, survivin, and caspase-3.. Table 2. The correlation between cyclin D1 and p27Kip1 expression Cyclin D1 expression Negative (n＝36) Positive (n＝17) Kip1. p27 expression Negative (n＝30) Positive (n＝23). 17/30 (57%) 18/23 (78%). 13/30 (43%) 5/23 (22%). P＝0.17 P＝4. Table 3. The correlation between p53, survivin, and caspase expression. p53 expression Negative (n＝30) Positive (n＝23) Fig. 9. Diffuse positive immunostaining for anti-caspase 3 protein in metastatic lesion in lung (×200, ABC stain).. Survivin expression. Caspase expression. Negative (n＝36). Positive (n＝17). Negative (n＝46). Positive (n＝10). 39/46 (85%) 7/46 (15%) P＝0.01. 3/7 (43%) 4/7 (57%) P＝1. 39/43 (93%) 4/43 (7%) P＜0.00. 3/10 (30%) 7/10 (70%) P＝1.
(7) Woo Jung Sim, et al：Expression of Proteins Related Cell Cycle and Apoptosis during Diethylnitrosamine (DEN)-induced Hepatocarcinogenesis in Rats. 365. 증식의 증가는 대개 세포자멸사의 증가를 동반한다고 상반. 고. 찰. 된 결과를 보고하였다. 따라서 간암에서의 세포자멸사 지 수의 의의에 대해서는 추후 많은 연구가 필요하리라 생각. 세포의 항상성(homeostasis)은 세포증식과 세포자멸사의. 된다.. 균형에 의해 조절되며, 이러한 세포증식과 세포자멸사의. 정상적인 세포분열은 세포주기의 연속적인 과정 중 선택. 항상성은 세포주기의 순서 진행에 의하여 엄격히 조절되고. 적으로 촉진 및 억제 인자들에 의해 조절된다. 정상세포의. 있다. 세포증식과 세포자멸사의 불균형은 세포의 항상성을. 분열은 G1, S, G2, M기의 4단계로 나눌 수 있는데, 각각의. 파괴해 종양의 발생 및 성장을 초래하게 된다.. 세포주기마다 확인점(checkpoint)이 존재하여 이들의 확인. 암세포의 증식능력을 측정하는 면역조직화학 염색방법. 을 거쳐 세포 분열의 다음 단계로 넘어가게 되는데, 암세포. 으로 PCNA (proliferating cell nuclear antigen) 검사가 많이. 에서는 이런 기능들이 저하되어 있거나 소실되어 있는 경. 이용되는데, PCNA는 세포주기 중 G0기에는 존재하지 않으. 우가 많다.(15) 세포주기 촉진인자 중의 하나인 cyclin은 적. 며, G1기 동안에 증가하기 시작해서 S기에 가장 많이 합성. 어도 11개의 cyclin 유전자가 있고 이들은 3가지 종류로 분. 되고 G2기에 감소되는 36kd의 세포 내 polymerase delta ac-. 류된다. G1기 cyclin (C, D1-3, E, G, H), S기 cyclin (A, F),. cessory 단백으로, 세포의 DNA합성과 세포의 증식에 필수. G2/M기 cyclin (A, B1-2)가 있고, 이들과 결합하여 활성을. 적이며, 또한 PCNA가 세포의 증식능력을 나타낼 수 있다. 나타내는 1∼6번까지의 아형으로 분류되는 CDK가 있으며,. 고 알려져 있다.(10) 본 연구에서 측정한 PCNA 라벨지수는. 이들 각각은 세포주기 G1, S, G2, M기에 따라 발현량이 변. 종양의 진행과정에서 초기에는 점차 증가하다가 샘종부터. 화되어 세포주기 진행에 관여한다.(16). 는 증가양상이 뚜렷하였고, 종양이 진행할수록 지속적으로. 여러 cyclin 중 cyclin D1은 세포주기 조절에 있어서 감시. 세포증식이 증가하여 통계적으로 유의하게 나타났다(P. 관문으로 알려진 G1-S기에서 가장 중요한 역할을 하는 pro-. ＜0.01). 이상의 결과로 볼 때 PCNA의 발현은 간세포 종양. to-oncogene으로 CDK4와 cyclin D1/CDK4 복합체를 형성하. 의 진행정도 및 가능성을 예측할 수 있는 지표의 하나로. 여 Rb 단백을 인산화 시키면 Rb 단백에 의해 억제되고 있던. 연구 대상이 될 수 있다고 생각한다.. E2F나 c-abl, Elf-1과 같은 전사인자들이 활성화 되면서 세. 적절한 세포자멸사의 조절은 조직의 항상성 유지와 발달. 포는 G1기에서 S기로 이행하게 하여 세포증식을 초래하여. 에 필수적인 요소이다. 하지만 세포자멸사를 촉진시키는. 암을 유발하게 된다.(4) 간암에 있어서 cyclin D1의 과 발현. 유전자와 억제시키는 유전자들 사이의 불균형에 의해 정상. 에 대해서는 Nishida 등(17)이 종양의 공격성과 유의한 관계. 적인 세포 내 세포자멸사 조절기전이 상실되면, 결과적으. 가 있다고 보고하였다. 본 연구에서 DEN 투여 후 cyclin D1. 로 발암원에 의해 항구적으로 DNA가 손상된 세포가 증식. 은 정상 대조군에서는 발현되지 않았으며, 증식증과 샘종. 되어 종양이 발생하는 것으로 보고되고 있다.(11). 에서는 일부에서 양성 반응을 보이다가 간암, 전이성 간암. TUNEL (Tdt-mediated dUTP nick end labeling)방법은 ter-. 에서는 과발현되는 것으로 미루어 볼때 cyclin D1의 과발현. minal deoxynucleotidyl transferase (Tdt)를 이용하여 기질 반. 은 간암의 진행과정이나 전이에 중요한 역할을 할 것이라. 응 후에 염색하여, 현미경으로 염색 유무를 확인함으로써. 고 생각하였다. 하지만 특이한 점은 증식성 결절에서 샘종. in situ로 세포자멸사를 확인할 수 있는 표준방법으로 사용. 보다 오히려 과발현되는 양상을 보였다는 것이다. 따라서. 되고 있다.(12) 본 연구에서 세포자멸사 지수는 정상대조군. cyclin D1의 과발현은 간암 발생의 초기단계에도 관여할 수. 에 비해 세포변이소, 증식증에서도 증가하는 양상을 보였. 있다고 생각되며, 이에 대해서는 좀 더 많은 연구 자료를. 으나 통계적 유의성은 없었고, 샘종부터는 증가양상이 뚜. 수집하여 암의 진행과정에 대한 역할에 대해서도 심도 깊. 렷하고 악성으로 진행할수록 증가양상이 통계적으로 유의. 은 연구가 필요할 것으로 생각한다.. 성이 있는 것으로 나타났다(P＜0.05). 간암에서 세포자멸사. CDK와 cyclin의 복합체는 p16, p21, p27Kip1 등과 같은. 지수에 대해서는 상반된 결과가 보고되었는데, Grasl-. CDK inhibitor (CKI)라는 물질들에 의해서 억제되는데,. Kraupp 등(13)은 간암의 세포자멸사 지수는 정상 간 조직,. p27Kip1 단백은 198개의 아미노산으로 구성된 단백질로 세. 만성 간염, 간경화, 인접 암 조직보다는 명백하게 낮은 것으. 포주기를 조절하는 CDK와 cyclin 복합체와 결합하여 kinase. 로 보고하였으나, Meki 등(14)은 간암의 진행과정에서 세포. 활성화를 억제함으로써 세포주기 중 G1후기에서 S기로 진.
(8) 366 J Korean Surg Soc. Vol. 75, No. 6 행하는 것을 차단해서 세포를 G1기에 머물게 한다.(15) Kip1. 제한다고 보고하였다. 본 연구의 간암 발생과정에서 초기. 단백은 휴지기의 세포에서는 높은 발현을 보이나 세. 에는 survivin 단백은 발현되지 않았고, 증식증부터 발현되. 포주기로 들어간 세포에서는 cyclin D와 CDK 복합체와 결. 어 간암, 전이성 간암에서는 발현이 증가 하였으나, 통계적. 합하기 때문에 발현이 저하된다. 최근 연구에서 유방암, 전. 유의성은 없었다. 이러한 결과로 볼 때, 비록 survivin 단백. p27. Kip1. 의 발현과의. 이 caspase에 직접 작용하여 여러 종류의 자극원에 의해 유. 의 발현도는 이러한 암들에. 도되는 세포자멸사를 억제 하지만, 간암에서는 의미 있는. 서 하나의 예측인자로서의 가능성이 보고되고 있다.(5). 어떤 세포자멸사 억제작용을 나타내지 못하는 것으로 생각. Kip1. 된다. 따라서 간암에서 survivin의 역할에 대한 규명은 세포. 단백 발현저하가 종양의 형. 자멸사 억제 작용보다는 세포증식과 악성 변화에 대한 역. 립선암, 폐 및 대장직장암에서 악성도와 p27 Kip1. 역상관관계가 발견되어 p27. Lloyd 등(18)은 양성종양과 비교할 때 악성종양에서 p27 Kip1. 의 발현도가 낮게 나타나 p27. 성과 악성도와 관련이 있다고 보고하였다. 본 연구에서 비 록 통계학적인 유의성은 없었지만 종양의 진행에 따라 Kip1. Kip1. 할에 초점이 맞춰져야 할 것으로 생각한다. 최근 단백질 분해 기능을 가지면서 세포자멸사의 신호를. 단. 실행하는 유전자로서 단백질 분해효소 cysteine protease의. 백이 종양의 형성과 악성도에 관련이 있다고 생각되었다.. 계열인 caspase가 알려져 있으며, 이들은 세포자멸사의 신. p27. 단백 발현이 감소하는 역상관 관계를 보여 p27 Kip1. Cyclin D1 단백 발현과 p27. 단백 발현의 연관성에 대한 Kip1. 연구에서 cyclin D1단백 발현과 p27. 단백 발현의 저하는. 연관성이 없을 것으로 생각한다.. 호를 받게 되면 caspase 계열이 활성화되는 cascade를 거치 게 되고 최종적으로 활성화된 caspase가 세포 내 중요 단백 질 즉 생존 신호에 관련된 단백질을 불활성화 시키고 세포. p53 암 억제 유전자는 염색체 17p13부위에 위치해 53kd. 자멸사의 억제기능에 참여하는 단백질은 절단함으로써 세. 핵 내 인산단백질을 암호화 하고 있으며, 세포주기의 조절,. 포 자멸사를 실행하는 것으로 밝혀졌다.(22) 현재 10가지. DNA 복구 및 합성, 세포자멸사에 중요한 역할을 한다.(19). 이상의 caspase가 여러 생물에서 규명 되었는데, 이들 중. 정상적인 p53 암 억제 유전자에서 발현된 단백은 DNA가. casepase-8, caspase-9, caspase-3은 세포 자멸사 과정에서 특. 손상된 세포의 세포자멸사를 유도하여 세포가 암세포로 형. 히 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다.(23). 질 전환되는 것을 막는다. 하지만 p53 유전자의 돌연변이가. Caspase-3은 세포자멸사 과정에서 poly (ADP-ribose) poly-. 있는 세포에서는 DNA가 손상되었더라도 세포자멸사가 일. merase (PARP), inhibitor of caspase activated deoxy-. 어나지 않는다. 본 연구에서 p53 단백은 정상대조군과 세포. ribonuclease (ICAD), gesolin과 같은 기질을 분해하고, cas-. 증식증까지는 전혀 검출 되지 않았는데, 이는 암에 의해 유. pase-8과 caspase-9의 신호를 증폭 시키면서 최종적으로 세. 도되는 인자들의 영향을 받지 않기 때문이라고 생각한다.. 포자멸을 유도하는 것으로 알려져 있다.(24-26) 이러한 물. 하지만 간암 및 전이성 간암에서는 각각 55%와 71%로 통. 질들은 세포 내 골격을 형성하거나 핵 내 DNA를 온전히. 계학적 유의성을 보이는 것으로 볼 때(P＜0.05), 돌연변이. 보존하는데 필요한 중요한 물질들로서 이 물질들의 분해. p53은 간암의 발생에 관여한 것으로 여겨진다.. 또는 활성화가 일어나면 세포의 응축과 DNA 분절화를 유. Survivin은 세포자멸사를 억제하며 세포분열을 조절하는. 발시켜 세포자멸사를 유도한다. 본 실험에서 caspase-3 단백. 단백으로, 17q25 염색체 상에 존재하며, 세포질 내 발현된. 은 초기에는 발현되지 않았지만, 간암으로 진행할수록 발. survivin 단백은 effector caspases와 결합하여 세포자멸사 과. 현이 현저히 증가하여 통계학적 유의성을 보였다(P＜0.05).. 정을 차단함으로써 종양세포의 증식 및 악성전환을 촉진시. 따라서 DEN으로 유도된 간암에서는 caspase-3가 활성화 되. 키고 생존력을 증가시킨다. Survivin은 세포자멸사 과정에. 면서 세포 자멸사에 대한 신호가 전달되는 것으로 판단된다.. 작용하는 효소인 caspase-3와 caspase-7의 활성을 직접 억제. 한편, 세포자멸사 조절인자 간의 상호작용에 대한 연구. 함으로써 세포자멸사를 억제하거나,(20) 세포주기 조절인. 에서 p53단백 발현과 survivin 단백 발현, caspase 단백발현. 자인 CDK4와 결합하여 survivin-CDK4 복합체를 형성하고. 은 통계학적으로 각각 의미 있게 나타났다. p53은 세포자멸. 이 복합체가 p21을 분비하여 결국엔 미토콘드리아 cas-. 사를 조절하는 중요한 유전자이며, 여러 경로를 통하여 세. pase-3와 결합하여 caspase-3의 활성을 억제하여 세포자멸사. 포자멸사를 조절하는 것으로 알려져 있다.(27) 또한 p53은. 를 차단한다고 알려져 있다.(21) Mirza 등(8)은 p53이 간암. bcl-2와 survivin을 하향 조절하는 기능도 가지는 것으로 보. 에서 세포자멸사에 작용하는 bcl-2와 survivin의 발현을 억. 고되고 있다.(8) 따라서 DEN으로 유도된 간암에서 세포자멸.
(9) Woo Jung Sim, et al：Expression of Proteins Related Cell Cycle and Apoptosis during Diethylnitrosamine (DEN)-induced Hepatocarcinogenesis in Rats. 사는 p53이 중요한 역할을 수행하는 것으로 생각한다.. 결. 론. DEN으로 유도된 쥐의 간암의 발생과정에서 출현하는 형 태학적 변화를 연속적으로 관찰하고 세포주기 조절인자와 세포자멸사 조절인자들의 발현양상을 관찰한 결과, 발암과 정 중 cyclin D1은 발암과정의 초기부터 발현되어 암 발생 과정에 핵심적인 역할을 하는 것으로 판단된다. 또한 p53과 caspase 3단백은 전암성 병변에서 암종으로의 형질전환에 중요한 역할을 하는 것으로 생각한다.. REFERENCES 1) Scherer E, Emmelot P. Kinetics of induction and growth of precancerous liver-cell foci, and liver tumor formation by diethylnitrosamine in the rat. Eur J Cancer 1975;11:689-96. 2) Hartwell LH, Kastan MB. Cell cycle control and cancer. Science 1994;266:1821-8. 3) Wu MS, Shun CT, Sheu JC, Wang HP, Wang JT, Lee WJ, et al. Overexpression of mutant p53 and c-erbB-2 proteins and mutations of the p15 and p16 genes in human gastric carcinoma: with respect to histological subtypes and stages. J Gastroenterol Hepatol 1998;13:305-10. 4) Kamb A. Cell-cycle regulators and cancer. Trends Genet 1995;11:136-40. 5) Guo Y, Sklar GN, Borkowski A, Kyprianou N. Loss of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27 (Kip1) protein in human prostate cancer correlates with tumor grade. Clin Cancer Res 1997;3:2269-74. 6) Grossman D, McNiff JM, Li F, Altieri DC. Expression and targeting of the apoptosis inhibitor, survivin, in human melanoma. J Invest Dermatol 1999;113:1076-81. 7) Li F, Ambrosini G, Chu EY, Plesicia J, Tognin S, Marchisio PC, et al. Control of apoptosis and mitotic spindle checkpoint by survivin. Nature 1998;396:580-4. 8) Mirza A, McGuirk M, Hockenberry TN, Wu Q, Ashar H, Black S, et al. Human survivin is negatively regulated by wild-type p53 and participates in p53-dependent apoptotic pathway. Oncogene 2002;21:2613-22. 9) Maronpot RR, Montgomery CA Jr, Boorman GA, McConnell EE. National Toxicology Program nomenclature for hepatoproliferative lesions of rats. Toxicol Pathol 1986;14:26373. 10) Miyagawa S, Okada N, Takasaki Y, Iida T, Kitano Y, Yoshigawa K, et al. Expression of proliferating cell nuclear antigen/cyclin in human keratinocytes. J Invest Dermatol. 367. 1989;93:678-81. 11) Cox LS. Multiple pathways control cell growth and transformation: overlapping and independent activities of p53 and p21Cip1/WAF1/Sdi1. J Pathol 1997;183:134-40. 12) Gavrieli Y, Sherman Y, Ben-Sasson SA. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol 1992;119:493-501. 13) Grasl-Kraupp B, Ruttkay-Nedecky B, Műllauer L, Taper H, Huber W, Bursch W, et al. Inherent increase of apoptosis in liver tumors: implications for carcinogenesis and tumor regression. Hepatology 1997;25:906-12. 14) Meki AR, Abdel-Ghaffar SK, El-Gibaly I. Aflatoxin B1 induces apoptosis in rat liver: protective effect of melatonin. Neuro Endocrinol Lett 2001;22:417-26. 15) Sherr CJ. Cancer cell cycle. Science 1996;274:1672-7. 16) Pines J, Hunter T. Cyclins and cancer. II: cyclin D and cyclin dependant kinase inhibitors come of age. Cell 1994;79:57382. 17) Nishida N, Fukuda Y, Ishizaki K, Nakao K. Alteration of cell cycle-related genes in hepatocarcinogenesis. Histol Histopathol 1997;12:1019-25. 18) Lloyd RV, Jin L, Qian X, Kulig E. Aberrenr p27kip1 expression in endocrine and other tumors. Am J Pathol 1997;150:401-7. 19) Lane DP. Cancer. p53, guardian of genome. Nature 1992;358: 15-6. 20) Sela B. Survivin: anti-apoptosis protein and a prognostic marker for tumor progression and recurrence. Harefuah 2002;141: 103-7, 123. 21) Ito T, Shiraki K, Sugimoto K, Yamanaka T, Fujikawa K, Ito M, et al. Survivin promotes cell proliferation in human hepatocellular carcinoma. Hepatology 2000;31:1080-5. 22) Kumar S. Interleukin-1β-converting enzyme (ICE)-like protease in apoptosis. Trends Biochem Sci 1995;20:198-202. 23) Cryns V, Yuan J. Proteases to die for. Genes Dev 1998;12: 1551-70. 24) Tewari M, Quan LT, O`Rourke K, Desnoyers S, Zeng Z, Beidler DR, et al. Yama/CPP32beta, a mammalian homolog of CED-3, is a Crma-inhibitable protease that cleaves the death substrate poly (ADP-ribose) polymerase. Cell 1995;81:801-9. 25) Enari M, Sakahira H, Yokoyama H, Okawa K, Iwamatus A, Nagata S. A caspase-activated deoxyribonuclease (DNase) that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD (inhibitor of caspase-activated deoxyribonuclease). Nature 1998; 391:43-50. 26) Kothakota S, Azuma T, Reinhard C, Kippel A, Tang J, Chu K, et al. Caspase-3-generated fragment of gelsolin: effector of morphological change in apoptosis. Science 1997;278:294-8. 27) Miyashita T, Reed JC. Tumor suppressor p53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene. Cell 1995;80: 293-9..
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