Effects of Antibacteria and Adhesive Inhibition of Scutellaria baicalensis Extract on Streptococcus mutans

(1)

367

황금(Scutellaria baicalensis) 추출물에 의한 Streptococcus mutans의 항균 및 부착억제 효과

백종윤·김용현·권현정

¹

·김은님·김완종·한만덕

^†

순천향대학교 생명과학과, ¹신흥대학 치위생과

Effects of Antibacteria and Adhesive Inhibition of Scutellaria baicalensis Extract on Streptococcus mutans

Jong-Yoon Paek, Young-Hyun Kim, Hyun-Jeoung Kwon

¹

, Eun-Nim Kim, Wan-Jong Kim and Man-Deuk Han

^†

Department of Biology, Soonchunhyang University, Asan, Chungnam, 336-745, Korea

1

Department of Dental hygiene, Shinheoung College, Uijeongbu, Gyeonggi, 480-701, Korea

Abstract

The natural products are used to be development of new antibacterial substances against human pathogenic bacteria. Adherence to the tooth surface by S. mutans is an important step in initiation of dental caries. This study was to examine antibacterial activity and anti-adhesive effect of Scutellaria baicalensis extract against S. mutans . Extracts of S.

baicalensis were tested for antimicrobial activities by paper disc methods and radial diffusion assay methods, and bacterial adherence assay using 3 type of hydroxyapatite. The antibacterial level of ethyl acetate extract, IPK-3 on the growth of S. mutans was 125 mg/ml of minimum inhibitory concentration (MIC). The maximum growth of S. mutans in medium added with IPK-3 extract (50 mg/ml) was delayed to 30 hr, while the highest at 24 hr in control medium. The pH values of the control medium was 5.63 at 18 hr, but the media supplemented with IPK-3 extract was pH 6.50 at 12 hr.

In adhesive inhibition assay, S . mutans was labelled with the fluorescent indicator DAPI and measured with fluorescence microscope. Adhesion of S. mutans on hydroxyapatite beads was inhibited by IPK-3 extracts. These results suggest that S.

baicalensis extract can be used as an effective material for antibacterial activity and adhesive inhibition against S. mutans .

Key words

Streptococcus mutans , Antibacterial activity, Bacterial adhesion, Scutellaria baicalensis

서 론

최근다양한식생활습관의변화와항생제내성균의 출 현으로치아우식증은증가되고있다¹⁾

.

^구강^내^대표적^질

병인치아우식증의주요원인균은

Streptococcus mutans

²⁾

와 그 외에도

Lactobacillus casei , Actinomyces viscosus , S. sanguis , S. milleri , S. salivarius , S. rattus , S. cricetus

등이있다^3,4)

. S. mutans

는

Gram

^{양성균으로}^통성^혐기성

이며 구강 내에 상주하며 부착능력이 있어 치아 표면에

부착하게 된다

.

치아 표면의 세균막에 부착한

S. mutans

는구강으로섭취하는음식물들의여러영양소들중포도 당 및 과당을 이용해 유기산인 젖산을 생산하는 것으로 알려져있으며

,

^또한

glucosyltransferase (GTF)

^와^같은^당

전이효소를 생산하여 당을 중합시키고 불용성

glucan

을

합성한다

.

생성된 불용성

glucan

은 구강 내 상주하는 다

른미생물집단들이치아에쉽게부착하여증식하도록유 도하고치아우식증외의다른구강내질병을일으키도록 한다

.

^또한^젖산으로^인해^법랑질이 ^탈회되어^{최종적으로}

치아우식증을유발하게된다³⁾

.

치아우식증예방을위해서 는항생제사용이효과적이나항생제내성과인체에미치 는 부작용 때문에항생제를 대체할 수있는 천연 항균물 질의개발이활발히연구되고 있다⁵⁾

.

^천연^항생제는 ^주로

식물에 존재하며 주로

alkaloid

류

, flavonoid

류

, phenolic compound

류

, quinone

류 등의

2

차 대사산물들인 것으로 알려졌다⁶⁾

.

^그러나 ^합성 ^항생물질 ^보다 ^{항균효과가} ^낮아

실용화에 어려움이 있다

.

치아우식증을 억제하는 천연물

에 대한연구로는녹차추출물은

tannin

^성분이^치아우식

증에 효과가 있음이 보고되었고⁷⁾ 오룡차⁸⁾및

Chinese black tea, Andrographis paniculata , Cassia alata

또한치 아우식증을억제하는데효과가있다고보고되었다⁹⁾

.

황금

(

^黃芩

, Scutellaria baicalensis G.)

^은 ^한국

,

^중국

,

^몽

†

Corresponding author

Tel: +81-41-530-4702

Fax: +82-41-530-1256

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(2)

골 및 시베리아 동부지역에 분포하며쌍떡잎식물 통화식 물목꿀풀과에 속하는여러해살이풀로 높이는

20~60 cm

에달하고

,

^뿌리는^약용으로^이용되어^왔다¹⁰⁾

.

^{중국에서는}

고열

,

마른기침

,

토혈

,

변비

,

태아를안정시킬때에사용되 었으며¹¹⁾뿌리에는

baicalein, baicalin, wohonin, wogono- side, neobaicalein

^이^{함유되어있으며}

, sitosterol

^등도^포함

되어있다¹²⁾

.

황금의약리작용으로 항균작용¹³⁾

,

항암작용

,

항염증 효과

,

^{항히스타민} ^효과 ^등이 ^알려져 ^있다¹⁴⁾

.

^국내

황금에 대한 연구로는

Cho

등¹⁵⁾의 황금추출물의 항균특

성 연구로황금추출물이 공시균주에 항균력이있음을 보

고하였고

, Moon

등¹⁶⁾은 치아우식증의 원인균 중 하나인

S. mutans OMZ176

^에 ^대해 ^{황금추출물이} ^항균력이^있다

고보고하였다

.

그리고

Lee

등¹⁷⁾은황금추출물이

Staphy- lococcus aureus

와

Bacillus cereus

에 대해

, Choi

등¹⁸⁾은

Pseudomonas aeruginosa

^에 ^대해 ^항균력이 ^있다고 ^보고

하였다

.

본 연구에서는 안전성이 우수한 한약재인황금을 이용하여구강내질병의 원인균에대한항균활성능력및 최소억제농도

(minimal inhibitory concentration, MIC)

를 측 정하고

,

^{황금추출물이}

S. mutans

의 생장에 미치는 영향과

hydroxyapatite beads

에 대한 부착억제 효과를통해 치아 표면에치아우식원인균의부착억제가능성을확인하였다

.

재료 및 방법 1. 황금 추출물 준비

한약재인 황금은 서울 경동시장에서 건조 상태의것을 구입하여 사용하였으며

,

여러 유기용매를 활용하여 추출 하였다

.

^구입한^황금을^분쇄한^후

, 3

^배량의

methanol

^을^첨

가하여

72

시간냉침시켰으며

methanol

추출물을

aspirator (EYELA, A-3S, Tokyo Rikakikai Co.)

로 여과하였다

.

여 과된

methanol

^추출물은 ^회전 ^{감압농축기}

(Rotavapor, Büchi RE-111, Switzerland)

를 사용해

80

^o

C

항온수조

(Oilbath, Büchi B-485, Switzerland)

^에서 ^감압 ^농축시켰

다

. Methanol

추출물

(IPK-6)

을 약

40 ml

까지 농축한 후 분액깔때기를 이용해

hexane (IPK-1), chloroform (IPK- 2), ethyl acetate (IPK-3), n-butanol (IPK-4),

물

(IPK-5)

순으로용매첨가후 분리하여시료를얻었다

.

^농축된^추

출물들은냉장보관하면서시료로사용하였다

.

2. 균주 및 배양

본 연구에 사용한 충치균은

Streptococcus mutans

ATCC 25175

^균주로 ^{한국생명공학연구원} ^{생물자원센터}

(KCTC)

에서분양 받아 사용하였다

.

세균의증식은

brain heart infusion (BHI, Difco, USA)

^에서

1~2

^차 ^계대배양

후같은 배지에식균하여

37

^o

C CO

2

incubator (5% CO

2

) (Thermo electron corporation, USA)

^에서 ^{배양하였다}

.

^항

균활성용 배지는

Müeller hinton agar (MHA, Difco, USA)

^를^{사용하였다}

.

3. 항균활성 측정

황금 유기용매 분획 추출물의

1

차 항균활성 검색은

paper disc

^방법을 ^{사용하였다}

.

^간략하면 ^보관된

S. mutans

균주를

BHI

배지에 접종하여

15~18

시간 활성화 시켜 항균성실험용

MHA agar

배지에균주

50

µ

l

씩도 말하였다

.

^도말된 ^배지에^멸균된

filter paper disc (8 mm : 1.5 mm, Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Japan)

를 밀착시킨 후

,

^황금^추출물을 ^농도별^{적용하였다}

.

^황금^추출물을^초

기 농도의

1/2

이 되도록 연속적으로

4

회 희석하여 최종

1000 mg/ml, 500 mg/ml, 250 mg/ml, 125 mg/ml

^농도가

되도록 조제하였으며

, disc

당

50

µ

l

씩 흡수시켰다

. Disc

에 추출물을 흡수시킨배지는 실온에서

10

^분간^방치시켜 ^건

조시킨 후

, S. mutans

를

37

^o

C CO

2

incubator(5% CO

2

)

에 서

18~24

시간동안배양시켰다

.

배양후에는

disc

주변에 생성된

inhibition zone diameter (mm)

^의 ^크기를

vernier caliper (Mitutoyo Co., Japan)

로측정하여각추출물의항 균활성정도를측정하였다

.

4. 최소억제농도 측정

Paper disc method

로

1

차항균활성을검색하고 선별한 황금

ethyl acetate

^추출물

(IPK-3)

^은

radial diffusion assay

를 통해 최소억제농도

(MIC)

^를 ^{측정하였다}

.

^모든 ^균주를

tryptic soy borth (TSB, Bacto, USA)

에전배양하여활성 화 시킨 후

, 37

^o

C CO

2

incubator

에서

18~24

시간 배양하 였으며 본 실험에서는

tryptic soy agar

를 사용하여 실험 하였다

.

^실험법을 ^간략하면

,

^균의

O.D.

^값을

0.45 (4 x 10

⁶

cells/ml)

로 맞추어

underlay

배지

10 ml

에 균

45

µ

l

씩 분주하여혼합한후

, square petri dish (Falcon, USA)

에분주하여

15

분간실온에서방치하였다

.

건조된배지에

0.4 mm

직경의구멍을뚫고준비된황금

IPK-3

추출물을 분주하였다

.

^최초 ^농도를

1000 mg/ml

^로 ^하여 ^다음 ^농도

가 초기 농도의

1/2

이되도록 연속적으로

17

번째까지 희 석하였다

.

^분주한^후

, 37

^o

C CO

2

incubator (5% CO

2

)

^에서

18~24

시간 동안 배양하였으며

MIC

측정은 육안으로 관

찰된생육저지대의농도로결정하였다

.

5. S. mutans 의 생장과 배지 내 환경변화

BHI

액체배지에 황금

IPK-3

추출물

50 mg/ml

을 첨가 한후 균을

1×10

⁷

cells/ml

이되도록접종하였다

.

접종후

37

^o

C CO

2

incubator (5% CO

2

)

에서

18~24

시간동안배양

하였으며 대조군은

BHI

액체배지를

blank

로하고실험군

은

IPK-3

^를 ^첨가한

BHI

^{액체배지를}

blank

^로 ^하여

Multi functional microplate reader (BMG Labtech, Germany)

를 이용해

540 nm

^에서 ^흡광도를^{측정하였다}

.

^또한

pH

^변화

는

IPK-3

추출물을

50 mg/ml

로첨가하고

pH

변화를

6

시 간 마다 측정하였다

.

^배지내 ^총당량은

phenol-sulfuric

method,

총 단백질량은

BCA protein assay kit(Pierce

Co.)

^을 ^이용하여^{측정하였으며}

,

^또한

glucan

^생성 ^효과도

(3)

알아보았다

.

^이때 ^대조군은

IPK-3

^추출물이 ^첨가되지^않

은배지를이용하여측정하였다

.

6. Hydroxyapatite beads(HA) 부착 억제 실험 S. mutans

균의

hydroxyapatite adhesion assay

는

Gaines

¹⁹⁾^의

assay

^를^응용하여^{실험하였다}

.

^우선^타액은^건

강한성인에게서 채취하여 냉각된

conical tube

에채취한 후

, 4

^o

C

^에서

15,000 rpm

^으로

20

^분간^원심분리

(Mega 17R, Hanil, Korea)

하였다

.

원심 분리된 타액의 상징액을취하 여

60

^o

C

^에서

30

^분간^가온하여^효소를^불활성화^시킨^후

- 20

^o

C

에 보관하여 실험에 사용하였다

.

세균 부착 분자는

hydroxyapatite beads

^로써^다음과^같은^제품을^{사용하였다}

: (a) Macro-prep ceramic hydroxyapatite type II 80

µ

m (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA); (b) Fluka crude hydroxylapatite (Fluka cat. No. 21223); (c) Hydroxyapatite (H-0252, Sigma, USA).

각 시료를

30 mg

을 정량하고

0.2 M NaOH 10 ml

^에

10

^분간 ^{전처리하여} ^표면을^활성화

시키고부유물은흡입하여 제거하였다

.

이과정을

2

회반 복하고증류수로

bead

^를

3

^번^{세척하였다}

.

^세척된

hydrox- yapatite beads

는

pH 7.0

으로 중화시키고 증류수로 한번 세척하였다

.

^세척된

hydroxyapatite beads

^에 ^냉장 ^보관된

타액

1 ml

^를 ^넣고

37

^o

C

^에서

60

^분간 ^타액을 ^코팅 ^시켰다

(S-HA).

^코팅된

S-HA

^를

0.01 M potassium phosphate buffered saline (PBS, pH7.2)

로

2

회 세척한후

,

최종적으 로

BHI

액체배지

1 ml

로 세척하였다

.

세척된

S-HA

는

96 well plate

^에

10

^µ

l

^씩 ^분주하고

,

^황금

IPK-3

^추출물

125 mg/ml

을 첨가한 다음 전 배양된

S. mutans

균주

1×10

⁷

cells/ml

^를^{분주하였다}

.

^분주^된

96 well plate

^는

CO

2

incubator

에서 배양하며

90

분

, 12

시간

, 24

시간 마다

S-HA

시료를 취하였다

.

정치시킨

e-tube

에서 배지를 제거하고

PBS

^로

1

^회 ^세척한 ^후

,

^상징액을 ^버리고 ^세척한

S-HA

^에

DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, Sigma, USA)

를첨가 하여

37

^o

C

^에서

1

^시간동안^{염색시켰다}

. 1

^시간동안^염색시킨

S-HA

는

PBS

로

1

회세척하고

20

µ

l

를채취하여

fluorescence microscope (Olympus DP71, Japan)

상에서관찰하였다

.

결과 및 고찰 1. 황금에 대한 유기용매 추출물의 수율

황금을

hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol

^의

유기용매로분획추출한결과

, Table 1

과같이

butanol

추 출물

(IPK-4)

^은

4.15%, ethyl acetate

^추출물

(IPK-3) 1.19%, hexane

추출물

(IPK-1) 0.65%, chloroform

추출 물

(IPK-2) 0.39%

순으로추출물수율을얻었다

.

추출최 종단계인 물 추출물

(IPK-5)

^은 ^가장 ^높은 ^수율인

4.45%

로나타났다

.

2. 항균활성 측정

황금유기용매분획추출물이균주에가지는항균활성능

력을 보기 위하여

MHA

배지에 균을 도말하고

paper

disc

^에 ^추출물을

1,000 mg/ml, 100 mg/ml, 10 mg/ml

^농

도별로 첨가해

37

^o

C CO

2

incubator (5% CO

2

)

^에서 ^배양

하여 생육 억제대를 관찰하였다

.

^실험 ^결과는

Table 2

^와

같이

S. mutans

균은

1,000 mg/ml

의농도에서 항균활성을 나타냈으나

butanol (IPK-4)

과 물 추출물

(IPK-5)

에서는

항균 활성을 나타내지 않았다

.

^특히

, IPK-3

^추출물은 ^다

른 유기용매 추출물과 비교할 때 항균활성이 가장 크게 나타났으며

,

^그^다음으로

IPK-2

^추출물이^모든^균주에^대

해 약간의 항균활성을 보였다

. 100 mg/ml

의 농도에서

IPK-3

추출물에서만생육억제저지대가관찰되었다

.

Table 1.

Average yield of organic solvent fractions extracted from S. baicalensis

Dried herbal weight (g) Solvent fractions Extract weight ± S.D

¹⁾

Yield (%)

²⁾

± S.D

100 IPK-1 0.65 ± 0.54 0.65 ± 0.54

IPK-2 0.39 ± 0.22 0.39 ± 0.22

IPK-3 1.19 ± 0.45 1.19 ± 0.45

IPK-4 4.15 ± 0.75 4.15 ± 0.75

IPK-5 4.45 ± 0.79 4.45 ± 0.79

1)

S.D = Standard Deviation

Table 2.

Antibacterial effects of organic solvent fractions from S. baicalensis on pathogenic bacteria.

Bacterial Strain Extract of S. baicalensis

¹⁾

1000 mg/ml 100 mg/ml 10 mg/ml

H

²⁾

C E B W H C E B W H C E B W

Streptococcus mutans ATCC 25175 + + ++ - - - - + - - - - - - -

1)

Concentration of organic solvent extract from

S. baicalensis.

2)

Fractionated procedure of organic solvent from

S. baicalensis

: H (hexane extract), C (chloroform extract), E (ethyl acetate extract), B (n-butanol extract), W (water extract)

2)

Yield(%) = Dried weight of extract fraction (g) × 100 Dried weight of

S. baicalensis

(g)

(4)

3. 최소억제농도 측정

Paper disc

방법에서 높은 항균활성을 나타낸 황금

IPK-3

^추출물을 ^병원성 ^미생물에 ^대한 ^{최소억제농도를}

측정하기 위하여

radial diffusion assay

로 실험하였다

. S.

mutans

에 대하여 최소억제농도를 측정한 결과

, IPK-3

의

최소억제농도는

125 mg/ml

^이었다

(Fig. 1).

4. 황금의 추출물이 S. mutans 의 생장에 미치는 영향

1)

생장에미치는영향

황금

IPK-3

^추출물이

S. mutans

가 성장하는데 미치는 효과를측정하기위해

IPK-3

을

50 mg/ml

의 농도로배지 에 첨가한 후 균의 생육을

Multi functional microplate reader (BMG Labtech, Germany)

로측정한결과는

Fig. 2

와같다

.

대조군이배양

24

시간후에흡광도

1.17

로최대

의성장을보였으며황금

IPK-3

^추출물

50 mg/ml

^를 ^투여

한 배지에서는 생장이 지연되어

30

시간에흡광도가

0.49

로최대성장을나타냈다

.

^이^결과를^통해^황금

IPK-3

^추

출물은 치아우식증 원인균인

S. mutans

의 생장을 억제하 고최대생장시점을지연시키는효과가있었다

.

2)

^배지^내

pH

^변화에^미치는^영향

황금

IPK-3

추출물

50mg/ml

을

S. mutans

의 생장배지 에 첨가하였을 때

pH

^변화에^미치는^효과는

Fig. 3

^과^같

다

.

초기

pH

는

6.8

로 적정하였으며

,

대조군은 배양

18

시

간 만에

pH 5.63

^로 ^급격한 ^변화를 ^보였으며 ^그 ^후의 ^시

간에서는 일정한

pH

를유지하였다

.

반면에

IPK-3

추출물 이투여된배지에서는

12

^시간까지^미소하게

pH 6.5

^로^감

소하였으나 그후 시간에는 더 이상 저하되지 않았다

.

따 라서 황금

IPK-3

추출물은

S. mutans

균의 생장을억제하 여

pH

^변화는^거의^{이루어지지}^않았다

.

3)

배지내탄수화물의변화에미치는영향

황금

IPK-3

^추출물을

S. mutans

^에^첨가한^후^배지^내의

탄수화물량의변화를알아보기위해

6

시간별로측정하였 다

.

^초기 ^배지의 ^총 ^{탄수화물량은}

ml

^당

0.56 mg

^의 ^탄수

화물이정량되었으며

18

시간이지난후대조군은

0.24 mg/

ml

^로 ^{떨어졌으나}

50 mg

^의 ^농도가^첨가된 ^황금

IPK-3

^추

출물이 투여된배지는

0.5 mg/ml

^을 ^{유지하였으며}

24

^시간

이 지난 후 탄수화물의 양이점차 감소하는 것을 확인할 수있었다

(Fig. 4).

4)

배지내단백질의변화에미치는영향

우수한항생제라도 생체에적용될 때

,

^혈액

,

^타액

,

^장액

등에 존재하는 분자

(

특히 단백질

)

에 의해 활성이 감소될

수 있다

.

^따라서 ^황금의 ^추출물을

BHI

^{액체배지에} ^넣고

균체를 성장시켰을 때

,

배지 내 단백질 변화를 확인함으 로써세균의활성을확인하였다

.

황금

IPK-3

추출물이첨

가된배지에

S. mutans

^를^배양하고^시간별^변화하는 ^단백

질량을 측정한 결과

,

배양

0

시간에서는 모든 배지에서

2.52 mg/ml

^이었다

.

^그러나^균체의^최대^생장량을^보인

24

시간에서는 대조군이

2.31 mg/ml

이었고

,

황금

IPK-3

추

Fig. 1.

Minimal inhibitory concentrations(MIC) of the ethyl acetate extract (IPK-3) from S. baicalensis on S. mutans.

Concentrations of IPK-3 extract were A) 1000 mg/ml, B) 500 mg/ml, C) 250 mg/ml, D) 125 mg/ml, E) 62.5 mg/ml, F) 31.25 mg/ml, G) 15.63 mg/ml, H) 7.81 mg/ml, I)3.90 mg/ml, J) 1.95 mg/ml, K) 0.97 mg/ml, L) 0.48 mg/ml, M) 0.24 mg/ml, N) 0.12 mg/ml, O) 0.06 mg/ml, P) 0.03 mg/ml, and Q) 0.015 mg/ml.

Fig. 2.

The growth curve of S. mutans in culture medium by addition of ethyl acetate fraction (IPK-3) extracted from S.

baicalensis.

■

; control,

◆

; 50 mg/ml of IPK-3.

Fig. 3.

The changes of pH in S. mutans culture medium by addition of ethyl acetate fraction (IPK-3) extracted from S.

baicalensis.

■

; control,

◆

; 50 mg/ml of IPK-3.

(5)

출물이 투여된 배지에서는

2.51 mg/ml

의 단백질이 정량 되어대조군보다단백질의활용이적었다

(Fig. 5).

5. S. mutans 의 다당류 생성 억제 효과

S. mutans

의 다당류는치아우식증에관여하는 치면세균

막을 형성하는데 가장 중요한 역할을 하는 다당류이다

.

따라서 본 연구에서는 황금

IPK-3

^추출물

50 mg/ml

^의

농도로

S. mutans

의 배양액 투여하였을 때 다당류 생성

을어느 정도억제하는지확인하기 위하여액체배지에서

시간별 다당류의 양적 변화를 알아 본 결과

Fig. 6

과 같

다

.

^{대조군에서는} ^배양

18

^시간에

500 mg/100 ml

^의 ^다당

류를 얻었으나

,

황금 추출물이 투여된 배지에서는

280 mg/100 ml

^의 ^다당류가 ^{수확되었다}

.

^한¹⁹⁾ ^등이 ^연구

한 바에 의하면

S. mutans

의 균체외 다당류는

glucan

성 다당류인것으로 보고된바 있다

.

이상의 결과로 황금 추 출물은 치면세균막 형성에 중요하게 작용하는

S. mutans

의 다당류 생성을 억제할 것으로 여겨지며 이들

추출물의 활용은 새로운 항 우식물질의 요구에 적절히 대응 할 수 있는 천연물 소재로써 의미가 있는 것으로 사료된다

.

6. Hydroxyapatite(HA)에 S. mutans 부착 억제 효과

S-HA

부착 억제에대한 실험에는

Macro-prep ceramic hydroxyapatite type II 80 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), Fluka crude hydroxylapatite (Fluka cat.

No. 21223), Hydroxyapatite (Sigma, USA)

^등

3

^개 ^제조

사의

hydroxyapatite beads

를 사용하였다

.

황금

ethyl acetate

^추출물이

S-HA

^에^대한

S. mutans

균의부착억제 효과가있는지알아보기위하여최소억제농도인

125 mg/

ml

^농도에서^실험한^결과는

Fig. 7~Fig. 9

^와^같다

. Fig. 7

은

Macro-prep ceramic hydroxyapatite type II 80

µ

m (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)

제품을 사용하여 실험한 결과이며

Fig. 8

은

Fluka crude hydroxylapatite (Fluka cat. No. 21223), Fig. 9

는

Hydroxyapatite (Sigma,

USA)

^제품을 ^사용하여 ^관찰한 ^결과이다

.

^균이

S-HA

^에

부착되는 순간부터 부착된이후까지의 결과를 보기 위해

0

^시간

, 90

^분

, 12

^시간

, 24

^시간에

S-HA

^를 ^채취하고

DAPI

로염색하여관찰하였다

.

황금

IPK-3

추출물이첨가된

S-

Fig. 5.

The changes of total protein in S. mutans culture medium by addition of ethyl acetate fraction (IPK-3) extracted from S. baicalensis.

■

; control,

◆

; 50 mg/ml of IPK-3.

Fig. 6.

The polysaccharide contents in S. mutans culture medium by addition of ethyl acetate fraction (IPK-3) extracted from S. baicalensis.

■

; control,

◆

; 50 mg/ml of IPK-3.

Fig. 7.

Fluorescent microscope image (×400 magnification) illustrating S. mutans labelled with DAPI, hydroxyapatite under transmission light and an image overlay illustrating S.

mutans adhering to hydroxylapatite (Bio-Rad Co.). (A) control.

(B) HA beads treated with 125mg/ml of IPK-3 extracted from S. baicalensis.

Fig. 4.

The changes of total carbohydrate in S. mutans culture

medium by addition of ethyl acetate fraction (IPK-3) extracted

from S. baicalensis.

^■

; control,

^◆

; 50 mg/ml of IPK-3.

(6)

HA

^에^대한

S. mutans

의 부착은대조군과달리시간이경 과하여도 균이부착된모습은관찰할수없었다

.

^이^같은

결과는

Gaines

²⁰⁾^가 ^실험한^결과와 ^{비슷하다는} ^것을 ^확인

하였다

.

또한

S. mutans

를

HA

에 부착시킬 때

DMSO

의

처리는세균의 부착에영향을 주었다

.

즉 황금

IPK-3

추

출물을

20% DMSO

^에 ^녹여^처리한^{실험군에서는}^부착이

확인하였으나

, DMSO

처리를 하지 않았을 경우

DMSO

를처리하였을때보다부착율이떨어졌다

.

요 약

천연물 황금으로부터 여러 유기용매 추출물을 얻어 치 아우식증 원인균인

S. mutans

^에^대한^항균활성

,

^배지^내

환경변화

,

그리고부착억제에대해알아보았다

.

1.

^구강 ^질병인^{치아우식증의}^대표적 ^원인균

S. mutans

에대한황금

ethyl acetate

^추출물

(IPK-3)

^의 ^최소억

제농도는

125 mg/ml

이었다

.

2.

^황금

IPK-3

^추출물

50 mg/ml

^의 ^농도로

S. mutans

의 배지내 투여하였을 때균의 생장량과최대 생장시 간은대조군보다지연되었다

.

3.

^황금

IPK-3

^추출물

50 mg/ml

^의 ^농도로

S. mutans

^의

배지내투여하였을때

, pH

변화는 대조군은

18

시간

에서

pH 5.63

^으로 ^급격한 ^변화를 ^보였으며 ^황금

IPK-3

추출물이

50 mg/ml

의 배지에서는

6.50

이상을 유지하여

pH

^가^변화가^없었다

.

4.

황금

IPK-3

추출물을첨가한배지내탄수화물

,

단백 질 및균체 외다당류의 변화는대조군에비해 매우 낮게생산되었다

.

5.

균체를 형광염료

(DAPI)

로 염색하여

S-HA

부착억제 을 확인한 결과

,

^대조군은 ^시간이 ^경과함에 ^따라

S. mutans

의

hydroxyapatite(HA)

에 부착 정도가증가되

었으나

,

^황금

IPK-3

^추출물이 ^첨가된 ^{시험군에서는}

S-HA

에균의부착이매우적었다

.

이같이황금의

IPK-3 (ethyl acetate

^추출물

)

^이 ^치아우

식증의 원인균인

S. mutans

에 대한 항균활성효과 뿐만

아니라

hydroxyapatite

^에^부착^억제^효과도^있었다

.

감사의 글

이 논문은 지식경제부 지역혁신센터 사업

(MOCIE-

RIC060605)

의 지원을 받아 일부 연구되었으며

,

이에 감

사드립니다

.

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Fig. 8.

Fluorescent microscope image (×400 magnification) illustrating S. mutans labelled with DAPI, hydroxyapatite under transmission light and an image overlay illustrating S.

mutans adhering to hydroxylapatite (Fluka Co. product). (A) control. (B) HA beads treated with 125 mg/ml of IPK-3 extracted from S. baicalensis.

Fig. 9.

Fluorescent microscope image (×400 magnification) illustrating S. mutans labelled with DAPI, hydroxyapatite under transmission light and an image overlay illustrating S.

mutans adhering to hydroxylapatite (Sigma Co. product). (A)

control. (B) HA beads treated with 125 mg/ml of IPK-3

extracted from S. baicalensis

(7)

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