Volume 6, Number 1 , A p r i l , 2003
Calcium Metaphosphate의 생체적합성 및 사람 골수기질세포의 골아세포 분화 촉진 효과
경북대학교병원 생명의학연구소, 경북대학교 의과대학 생화학교실1, 경북대학교 치과대학 구강병리학교실2, 영남대학교 공과대학 생체재료학교실3,
경북대학교 의과대학 정형외과학교실4
박의균・이영은・김정환・최제용1・신홍인2・오선호3・김석영3・김신윤4
= Abstract =
Cellular Biocompatibility and Stimulatory Effects of Calcium Metaphosphate on Osteoblastic Differentiation of Human Bone
Marrow-derived Stromal Cells
Eui Kyun Park, M.D., Young Eun Lee, M.D., Jung-Hwan Kim, M.D., Je-Yong Choi1, M.D., Hong-In Shin2, M.D., Sun-Ho Oh3, M.D., Sukyoung Kim3, M.D., Shin-Yoon Kim4, M.D.
Biomedical Research Institute, Kyungpook National University Hospital, Department of Biochemistry, School of Medicine, Kyungpook National University1, Department of Oral Pathology, College of Dentistry, Kyungpook National University2,
School of Materials Engineering, Yeungnam University3,
Department of Orthopaedic Surgery, School of Medicine, Kyungpook National University4
Purpose: The in vitro biocompatibility of Calcium Metaphosphate (CMP) with human bone marrow stromal cells (HBMSCs) and its effect on osteoblastic differentiation have been evaluated.
Materials and Methods : The effects of CMP on the HBMSCs undergoing osteoblastic differentiation were evaluated with 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay. Morphologies of the HBMSCs were examined using scanning electron microscopy and confocal laser scanning microscopy.
Osteoblastic differentiation of the HBMSCs was analyzed by alkaline phosphatase (ALP) staining and RT- PCR.
Results: The CMP powder and disk did not exert cytotoxic effect on the HBMSCs. In addition, the HBMSCs were adhered on the surface of CMP disk as successfully as on the culture plate or HA disk and displayed simi- lar actin arrangement and cellular phenotypes. Furthermore, the HBMSCs grown on three different matrices
※ 통신저자: 김 신 윤
대구시 중구 삼덕동 2가 5 0 경북대학교 의과대학 정형외과학교실
TEL: 053) 420-5635 FAX: 053) 422-6605 E-mail: [email protected] e-mail
본 연구는 산업자원부 ( N 1 1 - A 0 8 - 1 4 0 2 - 0 4 - 1 - 3 )의 지원으로 이루어졌음.
서 론
최근 골절, 종양, 감염, 선천성 질환 또는 인공 임플란트 주위 골용해 등으로 인한 골조직의 손실 을 회복시켜줄 수 있는 대체물질에 대한 수요가 점점 늘어남에 따라, 여러 생체적합성 세라믹스 및 생분해성 폴리머 개발이 활발히 진행되고 있다
6 , 2 1 ). 그 중에서도 생체세라믹스는 어느 정도의 생
체역학적 강도 유지와 골전도성, 생체적합성이 높 은 장 점 을 가 지 고 있 다 고 알 려 져 있고 H A ( h y d r o x y a p a t i t e )와 ß- T C P (ß- t r i c a l c i- um phosphate)는 골과 매우 유사한 조성을 가 지고 있어 골 대체물질로서 임상적으로 널리 사용 되어지고 있다5 , 9 ).
H A는 탁월한 골 전도성을 가지고 있는 반면1 0 ) 불활성의 성질을 가지고 있어서 흡수가 되지 않아 새로운 골조직형성으로의 대체를 지연시킬 수 있
다1 8 , 2 5 ). ß- T C P는 H A보다 생분해성은 우수하나
1 4 )
, 용해률이 비교적 빠른 단점이 있어 H A와 ß- T C P로 구성된 합성재료도 개발되고 있다3 ). 새로 운 골 대체물질은 생체적합성이 뛰어나야 할 뿐만 아니라 골 전도성이 높아야 하고 분해속도도 어느 정도 조절되어야 한다. 이러한 특성을 가진 C M P 세라믹이 새로운 골 대체재료로서 제시되고 있으
며2 , 2 0 ), Baksh 등2 )과 Lee 등1 7 )은 CMP 지지체
( s c a f f o l d )가 쥐 골수기질세포의 증식과 분화를 지지한다고 하였다. 또한 조직공학의 발달로 자가 골세포와 골대체물질의 혼합물을 이용한 골조직의 재생 가능성이 제기되고 있다2 1 ).
사람의 골수기질세포는 일종의 줄기세포로서 골 세포, 연골세포, 지방세포 등의 다양한 세포로 분 화될 수 있는 잠재성을 가지고 있다2 3 ). 따라서 인 체에서 면역거부나 질병 등의 전파를 막을 수 있
는 자가 골수세포에서 골세포를 증식, 분화시키고 세포 독성이 없고 세포 부착성과 분화 촉진 능력, 생분해성이 있는 적절한 지지체와 혼합한 조직을 사용하는 것은 손상된 골을 재생할 수 있는 바람 직한 방법이 될 수 있다. 이러한 방법은 동물 실 험상에서 어느 정도 성공하였지만 인체에서는 시 도하는 정도의 단계에 있다. 동물과 인체는 여러 가지 측면에서 차이가 있다. 예를 들어, Fibrob- last growth factor(FGF)는 쥐 골수기질세포에 있어서는 골세포로의 분화를 촉진시키는데 반해, 사람 골수기질세포의 골아세포로의 분화는 억제하 며 오히려 증식을 촉진시킨다1 9 , 2 2 ). 또한, colony 형성에 있어서도 마우스와 사람 골수기질세포는 다른 성장인자를 필요로 한다1 5 ).
그러므로 인체에 적용을 시도하기 전에 재료에 대한 사람 골수기질세포의 영향을 연구하는 것이 필수적이라 할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 생 체재료로 개발중인 C M P의 사람 골수기질세포에 대한 독성과 재료표면에의 부착능 및 분화능을 평 가하여 C M P의 골 대체물질로서의 가능성을 알아 보고자 하였다.
연구재료 및 방법 1. 재료의 준비
Calcium phosphate monohydrate [ C a ( H2P O4)2・H2O(Duksan, >90%)]를 8 5 0℃
에서 열처리하여 ß- C M P ( [ C a ( P O3)2]n)분말을 제조하였다. 결정질의 C M P를 분쇄하여 75 μm 이하의 크기에 해당하는 CMP 분말을 분리하여 2 4시간 볼 밀링하였으며, 볼밀에 사용된 지르코 니아볼의 크기와 사용량을 다르게 하여 크기가 다 른 분말을 준비하였다. HA 분말은 tribasic cal- were able to support osteoblastic differentiation of the HBMSCs as accessed by ALP staining. However, the CMP disk compared to the HA disk has a better ability to induce expression of osteoblast-related genes such as ALP, osteopontin (OPN) and osteoprotegerin (OPG).
Conclusion: The results demonstrate that, in addition to biocompatibility of the CMP with the HBMSCs, the CMP has an ability to stimulate osteoblastic differentiation of the HBMSCs in vitro.
Key Words: Human bone marrow stromal cells, Calcium Metaphosphate, Osteoblastic differentiation, in vitro biocompatibility
cium phosphate [Ca3( P O4)2( D u k s a n ,
> 9 0 % ) ]를 사용하여 동일한 방법으로 제조하였다.
이렇게 준비된 분말을 소결하여 HA 및 C M P디 스크를 지름 15 mm, 높이 1 mm의 크기로 제조 하였으며, X선 회절분석기(X-Ray Diffrac- tometer; XRD, D/MAX-2500, Rigaku), 주 사전자현미경(Scanning Electron Microscope;
SEM, S4200, Hitachi) 및 주사탐침현미경 (Atomic Force Microscope; AFM, NanoScope Ⅲ a, Digital Instruments)을 사 용하여 분석하였다.
2. 사람 골수기질세포의 배양
인공관절 치환술 때 근위대퇴골이나 장골능에서 골수를 5~10 ml 채취하였다. 수술 전 환자의 동 의를 얻었으며 한 곳에서 2 ml 이상은 흡입하지 않았다. 채취한 골수액은 histopaque 용액을 사 용하여 원심분리를 한 후 지방층과 혈장층을 제거 하고 cell pellet을 얻었다. 이를 다시 한번 1 0 % fetal bovine serum(FBS)이 포함된 α- m i n i- mum essential medium(α- M E M )에 현탁시킨 후 PBS 용액으로 여러 번 수세한 다음, 5%
C O2, 37℃의 조건으로 세포배양기에서 2 4시간 내외로 배양하여 배양d i s h의 표면에 부착된 골수 기질세포를 얻었다.
3. CMP의 세포 독성 및 증식평가
다양한 크기의 입자로 준비된 C M P분말을 세포 의 표면적과 동일하게 골수기질세포( 1×1 04 c e l l s / w e l l )에 노출시킨 후, 24, 48, 72시간 동안 배양하였으며, 또한 C M P디스크는 24 well p l a t e에 놓은 다음, 사람 골수기질세포를 5×1 04 c e l l s / w e l l이 되도록 s e e d i n g하고, 골형성배양액 (10% FBS 및 50 ㎍/ml Ascorbic acid, 10 mM β-Glycerophosphate, 100 nM Dexam- e t h a s o n e이 첨가 된 α-MEM) 하에서 1, 3, 5, 7일 동안 배양하였으며, 세포의 독성 및 증식은 각 시간에 3 - ( 4 , 5 - d i m e t h y l t h i a z o l - 2 - y l ) - 2 , 5 - diphenyl tetrazolium bromide(MTT) assay 로 평가하였다.
4. 세포부착 및 분화 양상의 관찰
상기와 같이 배양되어 C M P디스크에 부착된 세 포의 양상은 공초점현미경(Confocal Laser Scanning Microscope; CLSM, Leica TCS S PⅡ, Leica)과 S E M으로 관찰하였으며, 세포의 초기분화는 조직학적 분석인 ALP 염색을 통해 관찰하였다.
5. 사람 골수기질세포의 분화능 평가(RT-PCR)
골아세포로의 분화에 대해 역전사 중합연쇄 반 응( R T - P C R )을 통해 분화 표시유전자 A l k a l i n e Phosphatase(ALP), Osteopontin(OPN), col- lagen type I(Col I)과 Osteoprotegrin (OPG) 의 발현을 확인하였다. ALP, OPN, Col I과 O P G의 primer 염기서열은 다른 논문에서 발표
되었다1 , 2 4 , 2 6 ). GAPDH에 대한 p r i m e r는 f o r-
ward 5’-CCACTGGC GTCTTCACCAC-3’와 reverse 5’- C C T G C T T C A C C A C C T T C T T G - 3’ 로 주문 제작하여 사용하였다(Bioneer). PCR 생성물은 5 ㎕를 덜어 loading buffer와 섞은 후 1% agarose gel에 120 V로 2 0분간 전기영 동하여 확인하였다.
6. 통계처리
수합된 모든 자료들은 SAS 8.01의 일변량분산 분석법을 이용하여 평균차이를 검정하였으며, 각 군간의 통계처리가 유의한 경우에 사후검정법으로 다중비교검정( D u n c a n’s multiple range test) 을 실시하였다.
결 과 1. 재료의 분석
생성된 C M P의 XRD 분석결과 전형적인 고유 한 C M P상을 가지고 있음을 확인하였다( F i g . 1A). 표면양상을 S E M으로 관찰한 결과, CMP 가 H A보다 표면이 다소 더 거칠었으며, AFM에 의한 C M P와 H A디스크 표면의 R a값은 각각
351.32 nm, 118.78 nm였다(Fig. 1B-1E).
2. 사람 골수기질세포에 대한 C M P의 독성 및 증식평가
Fig. 2A에서 볼 수 있듯이, 생체분해성이 높은 C M P분말은 일반적으로 세포독성을 조사하는 농 도( 1×SAR; surface area ratio)에서 사람의 골수기질세포의 골아세포로 분화과정 중 어떠한
독성도 나타내지 않았으며(p>0.05), 세포의 증식 에도 영향을 미치지 않았다. 또한, CMP디스크는 사람 골수기질세포에 독성이 없었을 뿐만 아니라, H A디스크에 비하여 C M P디스크에서 사람 골수 기질세포의 증식이 약 9 . 7 %까지 촉진됨을 확인 할 수 있었다(p<0.05)(Fig. 2B).
3. 골아세포로의 분화과정동안 사람 골수기질세 포의 부착양상
Fig. 1. Composition and surface analysis of HA and CMP disks. XRD pattern of CMP (A) and SEM photographs of CMP (B) and HA (C) are shown. The surface roughness of CMP (D) and HA (E) is analyzed using AFM.
S E M과 C L S M을 통하여 C M P디스크에 의한 사람 골수기질세포의 부착양상을 분석해본 결과, 골아세포로 분화중인 사람 골수기질세포는 사용된 모 든 기 질 ( m a t r i x )에 서 유 사 한 a c t i n c y t o s k e l e t o n의 섬유상 배열양상을 보였으며 (Fig. 3), 배양d i s h와 H A디스크에 부착하는 정 도와 유사하게 C M P디스크 표면에 부착되었고 형 태학적인 차이 또한 뚜렷하지 않았다(Fig. 4).
4. 사람 골수기질세포의 골아세포로의 분화에 미치는 영향
초기분화 표식자인 A L P염색으로 골아세포로의 분화능을 평가해본 결과, 모든 기질에서 정상적으 로 골아세포로의 분화가 진행되었으며, 특히 C M P디스크 표면에 부착된 사람 골수기질세포는 배양d i s h와 H A디스크에서와 비교하였을 때 ALP 염색된 세포의 분포가 유의하게 증가됨을 확인할 수 있었다(Fig. 5). 이러한 결과와 상응 하여, 골수기질세포의 골아세포로의 분화를 R T - P C R을 통해 확인해본 결과에서도 사용된 모든 기질에서 Col I의 발현양상은 비슷하였으나, C M P디스크에서의 ALP 발현은 주목할 만큼 증
가하였다. OPN, OPG의 발현 또한 C M P디스크 에서 배양한 경우 더 강하게 발현되었으며, 이러 한 양상은 시간이 증가함에 따라 뚜렷해짐을 확인 할 수 있었다(Fig. 6).
고 찰
Calcium phoaphate 세라믹의 일종인 C M P 는 생분해성 세라믹으로서 이미 다양한 동물실험 을 통해 생체적합성이 있음이 확인된 바 있다
2 , 1 7 , 2 0 )
. 그러나, 사람골수기질세포를 사용한 C M P 의 생체적합성평가는 아직까지 보고된 바 없다.
본 실험결과, CMP분말을 처리한 골수기질세포와 디스크에서 배양한 세포에서 모두 독성은 없었으 며(Fig. 2), 이러한 결과는 이전의 쥐 골수기질 세포 실험결과와 더불어1 7 )C M P가 in vitro sys- t e m에서 동물 골수기질세포 뿐 아니라 사람 골수 기질세포에 대한 독성도 없음을 나타낸다. 또한 다양한 크기의 분말에 대한 세포독성평가는 C M P 골지지체가 생체 내에서 사용도중 발생할 수도 있 는 미세한 wear debris에 대한 세포들의 반응을 in vitro에서 연구하였다는데 의미가 있다.
바람직한 골대체물질은 지지체와 골조직 사이의 안정된 경계면( i n t e r f a c e )을 형성하는 능력을 가 Fig. 2. Analysis of cytotoxic effect of CMP. The HBMSCs were treated with CMP powder (A) or cultured over cul- ture plate, HA disk or CMP disk (B) in the presence of osteogenic medium for the indicated period. Cell toxic- ity was evaluated with MTT assay. Values are mean±SD; n=6, *p<0.05: statistical differences compared with w/o disk; ‡p<0.05: statistical differences compared with HA disk.
져야 하며, 이러한 과정은 재료에 대한 세포의 초 기 부착을 통하여 이루어진다7 ). 그러므로, 재료에 대한 세포의 부착은 골전도도와 골융합에 있어서 가장 중요하고 필수적인 요소이다1 2 ). 배양d i s h , H A와 C M P디스크에 부착된 세포양상을 a c t i n염 색 하에서 C L S M을 사용하여 관찰 한 결과 방추 형태의 세포가 잘 배열되어 있었으며(Fig. 3), 나아가 S E M검경을 통하여 골수기질세포가 잘 부 착됨을 또한 확인할 수 있었다(Fig. 4). 이상의 결과들은 C M P디스크에 골수기질세포가 성공적 으로 잘 부착되어 세포의 성장, 분화 등의 세포반 응이 정상적으로 일어날 수 있음을 시사한다.
한편, 합성된 H A는 우수한 생체적합성과 친화 성을 보여 골전도를 일으키고 직접 골과 결합하는 것으로 밝혀져 있어, 이를 인공 골재료로 개발하려 는 연구가 많이 진행되었다8 ). 하지만 C M P에 대 해서는 연구가 미약하다. CMP가 골수기질세포의 증식을 약하게나마 촉진시켰으나(Fig. 2B), 골아 세포로의 분화를 더욱 강하게 자극함을 본 실험결 과 확인할 수 있었다(Fig. 5, 6). 특히, 골아세포 로의 분화와 관련된 유전자인 ALP, OPN 및 O P G가 배양d i s h나 H A디스크와 비교하였을 때보 다 C M P디스크에서 훨씬 더 강하게 발현되었으 며, 이러한 결과로 미루어 볼 때, CMP가 H A보 Fig. 3. Confocal photographs of TRITC-phalloidin labeled HBMSC undergoing osteoblastic differentiation. The HBMSC was grown on the surface of the culture plate (A, D and G), HA disk (B, E and H), or CMP disk (C, F and I) for 1 (A, B and C), 3 ( D, E, and F) and 5 (G, H and I) days in the presence of osteogenic medium, respectively. F- actin was stained with TRITC-phalloidin; Original magnification: 400×.
다 사람 골수기질세포의 골아세포로 분화를 강화 시킬 수 있는 능력을 가지고 있음을 시사해준다.
일반적으로 세포의 부착과 분화에 영향을 미치 는 요인들로는 재료의 표면 거칠기1 1 ), 산화정도1 6 ) 등의 다양한 요인들이 있다고 알려져 있다. 본 연 구에서 골아세포로의 분화가 C M P디스크에 의하 여 강하게 촉진된 것은 우선 C M P의 물리화학적
성질이 사람 골수기질세포에 영향을 주었을 가능 성이 있다. 즉 C M P가 H A보다 더 큰 거칠기를 가지고 있음으로 인하여(Fig. 1B-1E), 이러한 물리적 성질이 분화를 촉진시켰을 가능성도 있다.
그러나 본 실험에서 사용한 C M P와 H A디스크 표면 거칠기 정도는 약 2 . 9배정도의 미세한 차이 이기 때문에 거칠기가 결정적으로 골수기질세포의 Fig. 4. SEM photographs showing morphology of the HBMSCs during osteoblastic differentiation. The HBMSCs were cultured on the surface of HA (A and B) and CMP (C, D and E) disk. Different magnifications of SEM photographs are shown:
A and C; 500×, B and D;1000× and E;1500×.
골아세포분화에 영향을 미친 것으로 보기는 어렵 다. 한편, CMP의 뛰어난 생분해성으로 인하여 용해된 칼슘과 인 이온들이 골아세포로의 분화를 촉진시켰을 가능성도 있다. 이전 연구에서 C M P 를 SBF(simulated body fluid)에 침적 시켰을 때 뛰어난 생분해성이 있음이 보고된바 있으며
1 3 , 2 0 )
, Chang 등4 )은 칼슘과 인 이온들이 골형성을 증진시킬 수 있음을 보고한 바 있다. 본 연구결 과, CMP가 사람 골수기질세포의 골아세포로의 분화를 촉진시키는 것은 분명하나, 어떠한 메커니 즘에 의해 분화가 촉진되는지에 대한 연구가 향후 에 진행되어야 할 것으로 생각된다.
결 론
C M P의 사람 골수기질세포에 대한 생체적합성 평가를 실시한 결과, CMP는 사람 골수기질세포 에 독성이 없었다. 또한, CMP표면에 부착된 골 아세포로 분화중인 골수기질세포는 배양d i s h와 H A디스크에서와 마찬가지로 잘 부착되어 증식하 였으며, 초기분화 또한 정상적으로 진행되었으며 오히려 다른 기질에서보다 분화가 더 촉진되었다.
Fig. 5. ALP staining of differentiating HBMSC on the surface of the different matrices. The HBMSCs were cultured on the culture plates ( A and D), HA disk (B and E) or CMP disk ( C and F) for 3 ( A, B and C) or 7 (D, E and F) days in the osteogenic medium, respectively. ALP positive cells are shown in red; Original magnification:
200×.
Fig. 6. Analysis of expression of the osteoblastic differ- entiation-associated genes. The HBMSCs were cultured in the osteogenic medium on the culture plate (lanes 1 and 4), HA disk (lanes 2 and 5) or CMP disk (lanes 3 and 6) for day 3 (lane 1, 2, 3) and day 7 (lane 4, 5, 6). Expression of OPN, ALP, OPG and Col I was analyzed as described in the “Materials and methods”. GAPDH was used as a loading control.
이러한 결과를 바탕으로 C M P는 우수한 생체적합 성을 보이며, 분화 또한 촉진시킬 수 있어 우수한 골 대체물질로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
R E F E R E N C E S
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