J. of Korean Orthopaedic Research Society Volume 7, Number 2, October, 2 0 0 4
성인 골수유래 간엽 줄기세포의 연골화 분화 과정에서 제 2형 프로콜라겐 Splice Form들의
분화 시기에 따른 발현 양상
서울대학교 의과대학 정형외과학교실
유정준・김종원・김영민・김희중
= Abstract =
Temporal Patterns of Expression of Type II Procollagen Splice Forms During the Chondrogenic Differentiation of Human
Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells
Jeong Joon Yoo, Jong Won Kim, Young-Min Kim, and Hee Joong Kim Department of Orthopedic Surgery, Seoul National University College of Medicine, Seoul, Korea
Purpose: We investigated the temporal patterns of expression of alternatively spliced Type II procollagen mRNAs during the chondrogenic differentiation of human bone marrow derived mesenchymal stem cells (hMSCs) in alginate bead and pellet culture systems.
Materials and Methods: hMSCs were prepared from bone marrow aspirates taken from the iliac crest of six normal human donors and expanded in monolayer culture. After 4 passages, the expanded cells were induced to chondrogenic differentiation with 10 ng/ml rhTGF-β3 and cultured for 28 days in two different three dimen- sional culture systems, alginate bead culture and pellet culture. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) for the expression of alternatively spliced type II procollagen mRNAs was performed with three sets of primers during the culture periods. Immunohistochemical staining (IHC) for type II collagen and gly- cosaminoglycan content assay were done to confirm the commitment of hMSCs to chondrogenic lineage.
Results: RT-PCR revealed that the expression of type II and type IIA procollagen mRNA increased gradual- ly during chondrogenic differentiation in both culture systems. When both type IIA and IIB procollagen tran- scripts were amplified at the same time, it was found that the alternative splicing of type II procollagen mRNAs does occur and the expression levels of both forms increased gradually during the chondrogenic differentiation.
※ 통신저자: 김 희 중
서울특별시 종로구 연건동 2 8 서울대학교 의과대학 정형외과학교실
TEL: 02) 2072-2970 FAX: 02) 3672-7448 E-mail: [email protected]
본 논문의 요지는 2 0 0 2년도 대한정형외과연구학회 추계학술대회에서 발표되었음.
본 논문은 한국과학재단 지정 우수연구센터“지능형생체계면공학연구센터”의 지원에 의해 수행된 것임.
서 론
성인 골수에서 추출하여 배양할 수 있는 미분화 간엽 줄기세포(adult human bone marrow derived mesenchymal stem cell)는 자가 복제 능력이 있으며 배양 조건에 따라 체외 배양 시 골 형성 세포, 연골 세포, 지방 세포 등 여러 중배엽 기원의 조직 세포로 분화할 수 있는 능력이 밝혀 져, 조직공학적 기법을 사용한 인공 골 조직이나 연골 조직의 제작을 위한 대상 세포로 많은 연구 가 진행되고 있다2 - 1 0 , 1 3 , 1 6 - 1 9 , 2 1 , 2 4 , 2 5 , 3 2 , 3 3 , 3 5 )
. 그러나, 이 러한 응용이 실제적으로 가능하기 위해서는 아직 도 많은 의문이 밝혀져야 하며, 특히, 간엽 줄기 세포를 연골 세포로 분화하도록 유도하여 관절 연 골 결손이나 골 관절염의 치료에 응용하기 위해서 는 연골 세포로의 분화 과정 중에 나타나는 제 2 형 콜라겐의 합성이나 glycosaminoglycan 합성 과 같은 연골 세포 특이적인 세포외 기질의 형성 양상과 세포 표현형의 변화에 대한 연구가 필요하 다3 , 3 0 ).
연골 조직에서 제 2형 콜라겐은 세포외 기질을 형성하는 주된 성분이다1 2 ). 제 2형 프로콜라겐 ( p r o c o l l a g e n )의 전령 리보핵산( m R N A )은 exon 2의 전사 후 선택적 스플라이싱( p o s t t r a n- scriptional alternative splicing)에 의해 e x o n 2가 포함된 I I A형과 포함되지 않는 I I B형 두 종 류가 있음이 알려져 있다2 6 , 2 7 ). IIA형 m R N A는 연골 전구 세포(chondroprogenitor cell), 골 외 막 세포, 연골 외막 세포, 골 관절염에서 나타나 는 미분화된 연골 세포 그리고 배아 시기에 있는
발달 단계의 연골 외 조직에서 발현되는 반면, I I B형 m R N A는 분화가 이루어진 연골 세포에서 특이적으로 발현된다고 한다1 , 1 5 , 2 2 , 2 8 , 2 9 )
. 이러한 제 2형 프로콜라겐 mRNA splice form들의 시간에 따른 발현 양상에 대해서는 연골세포의 일차 배양 과 배아의 발생 과정에 대한 연구에서 보고된 바
있으나1 4 , 2 8 , 2 9 ), 골수유래 간엽 줄기세포의 연골화
분화 과정에서의 발현에 대해서는 정확한 보고가 없었다.
본 연구에서는 성인의 골수유래 간엽 줄기세포 를 일차 배양한 후, alginate bead를 이용한 삼 차원 배양과 p e l l e t을 이용한 삼차원 배양 조건에 서 각각 연골화 분화를 유도하면서 그 분화 시기 별로 I I A형 프로콜라겐과 I I B형 프로콜라겐의 발 현 양상을 확인하고자 하였다.
대상 및 방법
1. 골수유래 간엽 줄기세포의 분리 및 배양
전신적인 질환이 없었고 인공 고관절 재치환술 을 시행 받으려는 6명의 공여자로부터 사전에 동 의를 얻은 후, 수술 도중 장골 능에서 골수를 2 0 ml 정도 채취하여 실험에 사용하였다. 줄기세포 는 Pittenger 등의 방법2 4 )에 준하여 P e r c o l l solution (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)을 사용한 비중 경사법으로 분리하였으며, 유핵세포를 2×1 05 c e l l s / c m2의 밀 도로 p l a t i n g한 후 D u l b e c c o’s modified E a g l e’s medium에 10% fetal bovine serum 과 L-glutamine 200 mM, penicillin 25 In the undifferentiated cells, none of them was detected. During the chondrogenic differentiation of hMSCs, type II collagen was detected with IHC staining and glycosaminoglycan content increased gradually.
C o n c l u s i o n: In this study, it was confirmed that the alternative splicing of type II procollagen gene does occur and type IIA procollagen mRNA increased gradually during the chondrogenic differentiation. The pre- sent results indicate that the expression levels of type II procollagen splice forms (type IIA and IIB) should be evaluated simultaneously for the better assessment of chondrogenic differentiation of hMSCs and the chondro- genic differentitation of hMSCs in alginate bead or pellet culture system can be used as an in vitro model for the research on the biological processes of type II procollagen.
Key Words: Type II procollagen, Alternative splicing, Chondrogenesis, Mesenchymal stem cell, Bone marrow
U/ml, streptomycin 25 μg / m l을 첨가한 m e s- enchymal stem cell growth media (MSCGM) (Clonetics, Walkersville, USA) 를 추가하여 3 7°C, 5% CO2의 조건에서 배양을 시작하였다. 세포가 c o n f l u e n t해지면 0 . 0 5 % trysin+0.53 mM EDTA (GibcoBRLⓇ, Gaithersburg, MD, USA)를 사용하여 5 - 6×
1 03 c e l l s / c m2의 밀도로 계대 배양하였다.
2. 유 세포 분석법(Flow cytometry)
유 세포 분석은 3번 계대 배양한 후 연골화 분 화를 시작하기 직전에 시행하였다. 2×1 05 개로 정량한 세포를 conjugated monoclonal anti- b o d y인 anti-CD105-FITC (Serotec, Oxford, U K )와 anti-CD44-RPE (Serotec), 또는 anti-CD14-FITC (Serotec)와 a n t i - C D 4 5 - RPE (Serotec)로 4°C에서 2 0분간 반응시키고서 FACS Calibur (Becton Dickinson, San Joe, CA, USA)를 사용하여 형광도를 측정하였 으며 CellQuest software (Becton Dickinson) 를 이용하여 분석하였다.
3. Alginate bead와 Pellet 삼차원 배양 조건에서의 연골화 분화
4번째 계대 배양시키려 할 때 세포를 취하여 alginate bead를 만들었다. 1.2% alginate s o l u t i o n에 2 5×1 06 c e l l s / m l의 밀도로 세포를 섞은 후 22-gauge needle을 이용하여 102 mM C a C l2에 천천히 방울 방울 떨어뜨리며 b e a d를 만들고 실온에서 1 0분간 성숙시켰다. MSCGM을 이용하여 3차례 정도 세척한 후 3 7°C, 5% CO2 의 조건에서 M S C G M으로 배양하였고, 24시간 후 D u l b e c c o’s modified Eagle’s medium에 T G F -β3 10 ng/ml, dexamethasone 100 nM, ascorbate 50 ng/ml, 1% ITS-Premix, sodi- um pyruvate 1 mM, proline 40 ng/ml, L- glutamine 80 mM, penicillin 0.5 U/ml, streptomycin 0.5 ml이 첨가된 연골화 분화 배 지(chondrogenic differentiation media) ( C l o n e t i c s )를 3내지 4일 마다 한번씩 교환해 주
며 3 7°C, 5% CO2의 조건에서 배양을 하였다.
Pellet 역시 4번째 계대 배양을 할 때 제작하였 다. 2.5× 1 05 c e l l s / m l의 밀도로 세포를 M S C G M에 부유시킨 후, 1 ml 씩 15 ml poly- propylene tube에 넣고 600 g에서 5분간 원심 분리 하였다. 37°C, 5% CO2의 조건에서 2 4시간 이 경과되어 tube 밑바닥에 구형의 p e l l e t이 형 성되었음을 확인한 후, alginate bead 배양과 마 찬가지로 연골화 분화 배지를 각 tube 마다 0 . 5 m l씩 첨가하였고, 3내지 4일 마다 배지를 교환해 주었으며 3 7°C, 5% CO2의 동일 조건에서 배양 하였다.
4. 역전사-중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 및 반응 산물 염기 서열 분석
일차 배양한 미분화 간엽 줄기세포는 계대 배양 을 시행할 때마다, 연골 세포로의 분화를 유도하 기 위한 alginate bead 배양과 pellet 배양은 1 주일 간격으로 4주까지 총 리보핵산을 추출하여 R T - P C R을 시행하였다. 총 리보핵산의 추출은 R N e a s yⓇ Mini Kit (QIAGEN, Germany)를 이용하여 생산자의 설명서에 준하여 시행하였고, 추출한 총 리보핵산은 분광흡광계( s p e c t r o p h o- tometer) (DUⓇ650, Beckman, Fullerton, CA, USA)를 이용하여 정량하였으며, 이를 주형 으로 First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Lithuania)를 이용하여 r a n d o m priming 방법으로 c D N A를 생성하였다.
P C R에 사용되는 시발체의 제작은 제 2형 콜라 겐 c D N A의 exon 2를 증폭하기 위하여, exon 2 의 양 끝에서 20 bp 크기로 제작하여 207 bp 크 기의 PCR 반응물이 생성되도록 하였다. 또 다른 시발체로서 I I A형 프로콜라겐 c D N A와 I I B형 프 로콜라겐 c D N A를 구별하기 위하여, exon 1과 exon 5에서 각각 20 bp 크기로 제작하여, IIA형 프로콜라겐 c D N A의 경우 exon 2가 포함되어 494 bp의 PCR 반응물이 생성되고, IIB형 프로 콜라겐 c D N A에서는 exon 2가 없어 287 bp 크 기의 PCR 반응물이 생성되도록 하였다. 한편, I I A형과 I I B형의 구분 없이 제 2형 프로콜라겐 전체의 발현을 분석하기 위하여 제 2형 프로콜라
겐의 3차 나선 구조(triple helix) 부분을 e n c o d i n g하는 부분에서 각각 20 bp 크기로 시발 체를 제작하여 428 bp 크기의 PCR 반응물이 생 성되도록 하였다(Fig. 1).
PCR 반응은 A c c u P o w e rⓇ PCR PreMix (Bioneer, 대전, 대한민국)를 이용하여, GeneAmp PCR system (Perkin-Elmer 9600, Norwalk, CT, USA)에서 시행하였으 며, 시발체의 염기 서열과 반응 조건은 Table 1 에 기술하였다. PCR 산물은 에티디움 브로마이 드(ethidium-bromide: EtBr)를 함유한 1% 아 가로즈 겔에서 전기 영동한 후 디지털 카메라로 촬영하였고, 얻어진 사진 영상에서 나타난 띠의 짙은 정도와 굵기를 특수한 분석 소프트웨어 (TINA Version 2.10e)를 이용하여 수치화 하였 다.
한편, 자동화 염기 서열 분석법을 이용하여 Ampli-Taq polymerase가 포함된 B i g D y e T M Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin Elmer, Forster city, CA, USA)로 PCR 산물 의 cycle sequencing을 실시한 후, ABI
P R I S MⓇ 310 Data Collection software (Perkin Elmer)와 ABI PRISMⓇ D N A Sequencing Analysis software ver.
3.3(Perkin Elmer)을 사용하여 염기 서열을 분 석하였고, 이를 G e n e B a n k의 데이터와 비교하여 반응 산물이 목표로 하였던 제 2형 프로콜라겐, I I A형 프로콜라겐, IIB형 프로콜라겐의 유전자 산물임을 확인하였다.
5. 면역 조직 화학 염색
(Immunohistochemical staining)
Alginate bead와 p e l l e t을 1주 간격으로 4주 까지 채취하여 면역 조직 화학 염색을 시행하여 제 2형 콜라겐의 합성 여부와 정도를 관찰하고 분 화 시기에 따른 연골 세포로의 분화의 정도도 파 악하였다. Alginate bead는 0.1 M cacodylate 와 10 mM CaCl2가 포함된 4% paraformalde- h y d e에서 4시간 실온에서 고정하였고 상승농도순 에틸 알콜에서 탈수화과정을 거쳐 파라핀에 포매 한 후 4 μm의 절편의 슬라이드를 제작하였다.
Fig. 1. Primer design for PCR. Primers from both ends of exon 2 of the human type II collagen sequence for type IIA transcript and primers from exon 1 and exon 5 for relative amount of both transcripts (IIA and IIB). Primers from the triple helical domain for total amount of type II procollagen mRNA.
P e l l e t은 준비된 슬라이드를 - 2 0°C acetone에 1 0분 정도 후 고정 한 후, hematoxylin에 1분 3 0초정도 염색하였고 이후 과정은 a l g i n a t e b e a d에 대한 처리 과정과 동일하였다. Anti- human collagen type II 단일클론항체( m o n o- clonal anti-human collagen type II, CP18L, OncogeneScience, Pittsburgh, PA, U S A )를 0.1 M PBS에 1 : 1 0 0 ~ 2 0 0배로 희석하 여 4°C에서 1 6 ~ 2 4시간 정도 처리하였고, 발색 반응을 위해 3´ , 3´ - d i a m i n o b e n z i d i n e (DAB) 용액(Liquid DAB Substrate kit, Zymed, San Francisco, CA, USA)에 5 ~ 1 0 분간 처리한 후, 대조 염색을 위해 h e m a t o x y l i n 으로 1분간 염색하였다.
6. Glycosaminoglycan 합성 측정
연골화 분화 과정 중 g l y c o s a m i n o g l y c a n의 합성 정도를 양적으로 분석하기 위하여 a l g i n a t e b e a d에서 삼차원 배양을 실시한 세포를 대상으로 DMB (Dimethyl-Methylene Blue) assay를 실시하였다. 6 well 세포 배양 용기의 한 w e l l 당 3개의 alginate bead를 넣고 배양하다가 연 골화 분화 각 시기마다 3개 w e l l에서 배양한 alginate bead로부터 추출한 세포와 배양 배지 를 각각 모아 실험하였다. DMB reagent (03610, Polyscience, Niles, IL, USA)를 2 5 0
㎕씩 첨가한 후 즉시 VERSAmax tunable
microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 530 nm와 590 nm 에서의 흡광도를 측정하여 530 nm/590 nm의 비율을 분석하였고, glycosaminoglycan stan- dard curve를 이용하여 g l y c o s a m i n o g l y c a n의 절대량으로 환산하였으며, 이는 indole 방법으로 측정한 DNA 합성량으로 보정하였다.
결 과 1. 유 세포 분석
3 4세 여자 공여자에서 추출한 세포를 분석한 결 과를 보면, 98.3%의 세포에서 T G F -βtype III 수용체인 C D 1 0 5와 hyaluronate 수용체인 C D 4 4 가 모두 발현된 반면, 조혈 모 세포에서 발현되는 C D 1 4와 C D 4 5가 모두 발현된 것은 0 . 6 %에 지나 지 않았다. 이러한 결과는 음성 대조군인 쥐의 항 체로 반응시킨 결과와 거의 유사할 정도로, 조혈 모세포 특이적인 세포막 항원은 거의 발현이 안 됨 을 알 수 있었다(Fig. 2). 34세 남자 공여자에서 추출한 세포 역시 동일한 결과를 보였다.
2. 제 2형 프로콜라겐 및 제 2형 프로콜라겐 spliced form들에 대한 RT-PCR 및 염기 서열 분석
5명의 공여자들의 골수에서 미분화 간엽 줄기세 Table 1. Primer Sequences Used in RT-PCR
Target transcript Primer sequence Annealing PCR Predicted
temperature (℃) cycles size (bp)
IIA only (F) 5’-AGGAGGCTGGCAGCTGTGTG-3’ 63 29 207
(R) 5’-CACTGGCAGTGGCGAGGTCA-3’
IIA & IIB (F) 5’-GTGAGCCATGATTCGCCTCG-3’ 60 38 494/287
(R) 5’-GGCCAGGATTTCCAAGGGTC-3’
Total II (F) 5’-GAATTCGGTGTGGACATAGG-3’ 60 28 428
(R) 5’-TACAGAGGTGTTTGACACAG-3’
GAPDH (F) 5’-ATTGTTGCCATCAATGACCC-3’ 55 24 546
(R) 5’-AGTAGAGGCAGGGATGATGTT-3’
(IIA only=exon 2 in type IIA procollagen, IIA=type IIA procollagen, IIB=type IIB procollagen, Total II=total type II procollagen, GAPDH=glyceraldehyde-phosphate-dehydrogenase, (F)=forward, sense primer, (R)=reverse, antisense primer)
포를 추출하여 3대에 걸쳐 계대 배양을 시키고, alginate bead를 이용한 삼차원 배양 조건에서 T G F -β3가 첨가된 조건에서 총 4주간 연골화 분 화 과정을 유도한 후 1주 간격으로 총 리보핵산을 추출하여 역전사 중합효소 연쇄 반응을 시행하였 다. 그 결과, 제 2형 프로콜라겐 m R N A는 미분 화 간엽 줄기세포 단계에서는 전혀 발현이 없다가 연골화 분화 과정 조건에서 발현되기 시작하여 그 발현 정도가 분화 시기가 경과하면서 점차 증가하
는 양상을 보였다. Exon 2가 포함된 I I A형 프로 콜라겐 m R N A의 발현을 분석한 결과도 이와 유 사하여, 미분화 단계에서는 전혀 발현이 없다가 연골화 분화 조건에서 발현이 되면서 그 정도가 분화 시기가 경과하면서 점차 증가하는 양상을 관 찰하였다. IIA형 프로콜라겐과 I I B형 프로콜라겐 m R N A를 함께 분석한 결과, 이들은 연골화 분화 과정 2 1일 경부터 함께 분석이 되기 시작하여 2 8 일에는 그 발현 정도가 둘 모두 증가하는 양상을
Fig. 2. (A, B) Flow cytometric analysis of cultured mesenchymal stem cells isolated from bone marrow of 34 years old female donor. (A) Cells stained with antibodies against human CD105 and CD44. (B) Cells stained with antibodies against human CD14 and CD45.
A B
Fig. 3. Temporal patterns of expression of type II pro- collagen splice forms during the chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells (hMSCs) in alginate beads culture systems.
hMSCs were subcultured 4 times in monolayer and then cultured in alginate beads for 28 days in the presence of 10 ng/ml rhTGF-β3. (P0, 1, 2, 3 = passage 0, 1, 2, 3, respectively.)
Fig. 4. Temporal patterns of expression of type II pro- collagen splice forms during the chondrogenic differentiation of hMSCs in pellets culture sys- tems. hMSCs were subcultured 4 times in mono- layer and then cultured in pellets for 28 days in the presence of 10 ng/ml rhTGF-β3. (P0, 1, 2, 3 = passage 0, 1, 2, 3, respectively.)
보여, 골수유래 간엽 줄기세포의 연골화 분화 과 정 중 제 2형 프로콜라겐의 선택적 스플라이싱이 일어남을 확인할 수 있었다. IIA형 프로콜라겐과 I I B형 프로콜라겐 mRNA 사이의 발현 정도는 두 시기 모두 I I B형이 I I A형보다 많음을 확인하 였다(Fig. 3).
P e l l e t을 이용한 삼차원 배양 조건에서 T G F -β 3가 첨가된 조건에서 연골화 분화를 유도한 결과 역시 alginate bead 배양에서와 같은 양상을 보 여, 제 2형 프로콜라겐의 선택적 스플라이싱이 연 골화 분화 배양 조건과 무관하게 동일하게 일어남 을 알 수 있었다. 제 2형 프로콜라겐 m R N A는 미분화 단계에서는 발현되지 않다가 연골화 분화 시기가 경과하면서 점차 그 발현이 증가하는 양상 이었고 exon 2가 포함된 I I A형 프로콜라겐 m R N A의 발현 역시 연골화 분화 과정에 접어들 면서 나타나기 시작하여 분화 시기에 따라 점차 증가하였다. IIA형과 I I B형 프로콜라겐 m R N A
를 함께 분석하니, 두 가지 모두 연골화 분화 2 1 일 경부터 발현되기 시작하여 2 8일에는 둘 모두 발현이 증가하는 양상이었고 둘 사이 발현 정도는 유사하였다(Fig. 4).
자동화 염기 서열 분석법을 이용하여 PCR 산 물의 염기 서열을 분석한 후 G e n e B a n k의 데이 터와 비교한 결과, 반응 산물이 목표로 하였던 제 2형 프로콜라겐, IIA형 프로콜라겐, IIB형 프로 콜라겐의 유전자 산물임을 확인하였다.
2. 제 2형 콜라겐에 대한 면역 조직 화학 염색
Alginate bead에서 간엽 줄기세포를 연골화 분화로 유도하면서 제 2형 콜라겐에 대한 면역 조 직 화학 염색을 시행한 결과, 연골화 분화가 진행 되면서 분화 유도 2 8일에 세포막 주위로 갈색으로 염색되는 제 2형 콜라겐이 형성됨을 관찰하였다 (Fig. 5A, B). Pellet에서 연골화 분화를 유도한
Fig. 5. (A, D) Immunohistochemical staining for type II collagen of hMSCs. (A) Chondrogenesis 7th day and (B) 28th day in alginate bead. The expression of type II collagen increased during the chondrogenesis of hMSCs.
(C) Chondrogenesis 7th day and (D) 28th day in pellet. Type II collagen detected at the central portion of pel- let on 28th day (arrows). (×200 magnification)
A B
C D
결과 역시 마찬가지로 2 1일까지는 제 2형 콜라겐 의 생성을 관찰하지 못하였으나 분화 유도 2 8일에 p e l l e t의 중앙부에 짙은 갈색으로 염색되는 제 2 형 콜라겐의 침착이 확인되었다(Fig. 5C, D).
3. Glycosaminoglycan 합성 측정
연골화 분화 과정 중 g l y c o s a m i n o g l y c a n의 합성 정도를 양적으로 분석한 결과, alginate bead 배양 조건에서 연골화 분화 시기가 경과함 에 따라, 연골화 분화 2 1일이 경과하면서 점차 g l y c o s a m i n o g l y c a n의 합성양이 증가하였다 (Fig. 6).
고 찰
최근 조직 공학 기법에 대한 연구가 활발히 이 루어지면서 다양한 분화 능력을 보이는 골수유래 간엽 줄기세포를 인공 장기 형성의 대상 세포로 사용하려는 시도가 이루어지고 있다2 , 5 , 7 - 9 , 2 0 , 3 1 , 3 2 ). 골 수에서 추출된 간엽 줄기세포를 사용하여 인공 연 골을 만들고자 하는 시도에 국한하여 고찰한다면, 이러한 인공 연골 조직이 임상적으로 사용되고 만 족스러운 결과를 보이기 위해서는 간엽 줄기세포 가 정상적인 연골 세포로 완벽하고 충분하게 분화 가 이루어져야 하고, 형성된 세포외 기질 역시 정
상 연골 조직에서 관찰 될 수 있는 것과 그 조성 과 성분, 그리고 생역학적 특성 등이 정확히 일치 하여야 한다는 점이 전제 조건이 된다. 간엽 줄기 세포의 연골화 분화 과정에 대한 최근의 연구 동 향은 이러한 분화를 보다 촉진시킬 수 있는 방법 이 무엇인지를 찾고자 하는 시도들이며1 9 , 3 0 , 3 4 ), 이 를 위해서는 연골 조직 특이적인 세포외 기질의 형성에 대한 연구가 필요하다.
제 2형 콜라겐은 세 개의 α1(II) chain에 의해 형성되는 h o m o t r i m e r로서 연골 조직에 특징적 으로 존재하는 콜라겐으로 연골 조직의 세포외 기 질을 형성하는 주된 성분으로 알려져 있다1 2 ). 그 러나 이러한 제 2형 프로콜라겐( p r o c o l l a g e n )의 m R N A는 exon 2의 전사 후 선택적 스플라이싱 에 의해 exon 2가 포함된 I I A형과 포함되지 않는 I I B형 두 종류가 있음이 알려졌으며, 사람의 경 우, 207개의 염기쌍으로 형성된 exon 2는 제 2 형 프로콜라겐의 아미노 프로펩타이드에서 시스테 인이 다량 함유된 부분(cystein rich domain of N H2- p r o p e p t i d e )을 e n c o d i n g한다고 밝혀졌다
2 6 , 2 7 )
. 이러한 I I A형 m R N A는 연골 전구 세포, 골 외막 세포, 연골 외막 세포, 골 관절염에서 나 타나는 미분화된 연골 세포 그리고 발생 단계에 있는 배아의 연골 외 조직에서 발현되는 반면, I I B형 m R N A는 분화가 이루어진 연골 세포에서 특이적으로 발현된다1 , 1 5 , 2 2 , 2 8 , 2 9 ). 또한, 정상 연골 세포를 일차 배양할 경우 시간이 경과하면서 연골 세포의 탈분화( d e d i f f e r e n t i a t i o n )가 일어나면서 I I A형과 I I B형 m R N A가 함께 나타난다고 하며
1 4 , 2 8 ), 배아의 발생 과정에서 간엽 세포가 연골 세
포로 분화가 되면서 발생 초기에는 I I A형 m R N A만 발현하다가 발생이 진행하면서 I I A형 m R N A의 발현이 감소하고 I I B형 m R N A의 발 현은 점차 증가함이 보고되었다2 9 ). 최근 연구 결 과, exon 2는 인간 태아의 지아(human fetal limb bud)에서 연골 조직 분화에 작용하는 성장 인자가 결합하는 부위인 제 2형 프로콜라겐의 아 미노 프로펩타이드 중 시스테인이 다량 함유된 부 분을 e n c o d i n g한다고 한다. 결국 exon 2의 발현 정도에 따라 이러한 성장 인자가 국소적으로 존재 하는 양이 조절되고 궁극적으로는 미분화 간엽 조 직에서 연골 조직으로의 분화 과정 역시 조절될 Fig. 6. Glycosaminoglycan (GAG) content normalized
by DNA content during the chondrogenic differ- entiation of hMSCs in alginate bead culture sys- tem. Triplicate analyses were performed on algi- nate beads (n=3) at each time point. Data points represent the mean±SD (n=3).
것이라고 한다1 1 , 2 3 , 3 6 )
. 따라서, 연골 세포의 분화에 따른 발현의 변화로 인해, 위의 두가지 I I형 프로 콜라겐 m R N A들은 연골 세포 분화의 중요한 가 늠자( m a r k e r )로서의 기능이 있을 것으로 여겨지 고 있으며, 각기 다른 생물학적 역할을 보일 것으 로 기대되고 있다. 그러므로 간엽 줄기세포를 연 골 세포로 분화시키는 과정을 검증하기 위해서는 단순히 제 2형 콜라겐의 발현만을 파악하는 것보 다는 선택적 스플라이싱 과정을 통하여 생성되는 I I A형과 I I B형 프로콜라겐의 발현을 함께 분석, 파악하는 것이 그 분화 단계에서의 세포 표현형의 변화 양상을 확인하는 데 더욱 도움이 될 것이다.
본 연구에서 성인 골수유래 간엽 줄기세포를 각 기 다른 두 가지 배양 환경에서 연골화 분화 과정 으로 유도하면서 제 2형 프로콜라겐 m R N A의 발현을 관찰하였다. 그 결과, 체외 연골화 분화 과정 중에도 제 2형 프로콜라겐의 전사 후 선택적 스플라이싱이 일어나며, 제 2형 프로콜라겐의 발 현과 유사하게 exon 2를 가지고 있는 I I A형 프로 콜라겐 역시 미분화 단계에서는 전혀 발현이 없다 가 연골화 분화 과정이 지속되면서 점차 그 발현 이 증가함을 확인하였다. 본 연구자의 문헌고찰에 의하면, 간엽 줄기세포의 연골화 분화 과정에서 I I A형 프로콜라겐의 발현을 관찰한 보고로는 J o h n s t o n e이 가토에서 추출한 골수 간엽 줄기세 포를 pellet 배양하면서 연골화 분화 7일에 I I A형 프로콜라겐이 발현함을 역전사 중합효소 반응으로 확인한 것이 유일하였다1 3 ). 그는 이러한 사실을 관찰하고 I I A형 프로콜라겐이 연골 전구 세포나 미성숙 연골 세포에서 발현됨을 상기하여, 자신이 사용한 pellet 배양 조건이 배아의 발달 과정에서 나타나는 연골 조직 형성 과정을 재현한 것이라고 해석하였다. 그러나 그는 연골 분화 제 7일에 단 한번만 관찰한 사실을 보고했을 뿐으로, IIA형 프 로콜라겐의 발현이 연골 분화가 진행되면서 어떤 양상으로 변화되는지는 밝히지 않았다.
Exon 2가 포함된 I I A형 프로콜라겐만을 분석 하기 위하여 exon 2의 양끝에서 시발체를 제작하 여 P C R을 실시하면 연골화 분화 1주부터 발현이 확인되는 반면, IIA형과 I I B형 프로콜라겐의 발 현을 함께 볼 수 있도록 exon 1과 exon 5에서 시발체를 제작해서 P C R을 해보면 연골화 분화 3
주에 접어들어서야 발현을 확인할 수 있었다. 이 처럼 시발체의 제작 위치 선정에 따라 I I A형 프로 콜라겐의 분화시기에 따른 발현 정도가 달리 나타 나는 것은 명확히 설명하기 어렵다. 다만, IIA형 과 I I B형 프로콜라겐을 함께 증폭하여 각기 다른 길이의 전사 물질들이 만들어지면서 시발체가 c D N A에 부착되고 역전사 되는 과정 중 시발체의 작용 효율이 감소하였을 것으로 생각된다. 따라 서, 상대적으로 적은 양의 프로콜라겐 c D N A가 존재하는 분화 초기 2주간에는 전사 물질들이 확 인될 수 있는 양 이하로 만들어졌을 것으로 사료 되며, 분화가 진행되면서 발현되는 프로콜라겐 c D N A의 양이 증가하면서 전사 물질들이 확인되 게 된 것으로 생각된다.
Pellet 배양에서는 I I A형과 I I B형 프로콜라겐 이 같은 정도로 발현되는 반면, alginate bead 배양에서는 I I B형이 I I A형보다 많이 발현되는 양 상이었다. 이러한 분화 유도 배양 조건에 따른 두 종류의 splice form들의 발현 차이를 본 연구 결 과로는 명확히 설명할 수는 없다. 다만, 배양 조 건 차이라는 외부적 환경 차이가 확인되지 않은 세포내 신호 전달 경로를 통하여 두 종류 s p l i c e f o r m들의 발현에 각기 달리 영향을 주었을 가능 성을 생각할 수 있다. 이점에 대해서는 향후 추가 적인 연구가 필요할 것이다. 그러나, 본 연구 결 과만을 보자면, alginate bead 배양 조건이 p e l- let 배양보다 정상 연골 세포로 분화시키는데 보 다 유리한 조건인 것으로 여겨진다.
현재 줄기세포를 연골화 분화 과정으로 유도하 기 위해 사용하는 두 가지 배양 환경인 a l g i n a t e b e a d와 pellet 배양 조건 모두에서 연골화 분화 가 진행함에 따라 I I A형과 I I B형 프로콜라겐의 발현 모두가 증가하였다는 점은 매우 흥미로운 사 실이다. Sandell은 배아의 발생 과정에서 간엽 세포가 연골 세포로 분화가 되면서 분화 초기에 주로 나타나던 I I A형 m R N A의 발현이 감소하고 I I B형 m R N A의 발현은 점차 증가함을 보고하였
다2 9 ). 이러한 배아 발달 과정 결과와는 달리 두
종류의 splice form들이 분화 기간 동안 계속 증 가하는 양상을 보였다는 점은 간엽 줄기세포가 아 직은 완전한 연골 세포로 분화되지는 못 하였음을 반영하는 것이다. 이번 연구에서는 총 4주간 연골
화 분화를 유도하였다. 결국, 4주 정도의 분화 유 도만으로는 연골 세포로의 완전한 분화를 확인하 기 어려울 것으로 생각되며 보다 정확한 결과 확 인을 위해서는 4주 이상의 장기간의 분화 유도가 필요할 것으로 생각된다.
하나의 세포가 I I A형 프로콜라겐과 I I B형 프로 콜라겐을 모두 함께 발현할 수 있어 분화 정도나 배양 조건 등 외부의 자극 정도에 따라 두 가지의 발현 정도가 조절되는지, 그렇지 않으면 I I A형을 발현하는 세포군과 I I B형을 발현하는 세포군이 서 로 달리 존재하여 외부의 자극 정도에 따라 두 가 지 세포군의 증식과 발현 정도에 차이가 발생하면 서 연골화 분화 시기에 따른 이러한 선택적 스플 라이싱 결과가 나타나는지에 대하여 아직까지 명 확한 설명을 할 수는 없다. 그러나, 본 연구를 통 하여 성인 골수 유래 간엽 줄기세포의 연골화 분 화 과정에서 나타나는 제 2형 프로콜라겐 중 상당 량은 미성숙 연골 세포나 연골 전구 세포 등에서 발현되는 I I A형 프로콜라겐이라는 점을 확인할 수 있었다. 이는 결국, 골수에서 추출한 간엽 줄 기세포를 연골화 분화 과정으로 유도하면서 관찰 하였던 제 2형 프로콜라겐의 발현 양상에 대한 기 존의 보고들이 사실은 I I A형 프로콜라겐과 I I B형 프로콜라겐이 함께 발현한 양상을 모두 합하여 본 결과였다는 점을 시사한다.
그러므로, 연골화 분화 과정을 보다 객관적이고 정확하게 확인하기 위해서는 제 2형 프로콜라겐의 발현만을 확인하고 검증할 것이 아니라, 선택적 스플라이싱 과정을 거쳐 나타나는 I I A형 프로콜 라겐과 I I B형 프로콜라겐 모두를 함께 분석하는 것이 연골 세포로의 표현형 변화 판단에 바람직할 것이며, IIB형 프로콜라겐만이 주로 발현될 수 있 는 배양 조건의 개발이 간엽 줄기세포를 이용한 세포 치료법의 성공 여부의 관건이 될 것으로 생 각된다. 아울러, 현재까지 제 2형 프로콜라겐의 선택적 스플라이싱에 관한 연구가 모두 배아 조직 이나 퇴행성 변화 과정에 있는 조직에서 이루어 진 점을 고려할 때, 간엽 줄기세포의 a l g i n a t e b e a d나 p e l l e t에서의 연골화 분화 유도 환경이 이러한 선택적 스플라이싱을 포함한 제 2형 콜라 겐에 대한 연구를 위하여 좋은 실험 모델이 될 것 으로 여겨졌다.
결 론
본 연구에서 성인 골수유래 간엽 줄기세포를 alginate bead와 p e l l e t을 이용한 삼차원 배양 조건에서 연골화 분화로 유도하면서 그 분화 시기 별로 I I A형 프로콜라겐과 I I B형 프로콜라겐의 발 현 양상을 확인한 결과, 제 2형 프로콜라겐의 전 사 후 선택적 스플라이싱이 일어나며, 분화가 경 과하면서 I I A형 프로콜라겐의 발현도 계속 증가 함을 알 수 있었다. 그러므로, 연골화 분화 과정 의 평가를 위해서는 선택적 스플라이싱 과정을 거 쳐 나타나는 I I A형 프로콜라겐과 I I B형 프로콜라 겐 모두를 함께 분석하는 것이 보다 바람직할 것 이며, 이러한 간엽 줄기세포의 연골화 분화 조건 이 제 2형 콜라겐에 대한 연구를 위하여 좋은 실 험 모델이 될 것으로 사료되었다.
R E F E R E N C E S
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