Difference in Cell Characteristics among the Monoclonal Cell Populations Obtained from the Human Umbilical Cord Blood

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서 론

간엽줄기세포는 성체줄기세포 중 한 가지로 그것의 세 포원으로는 골수, 제대혈, 골막, 지방 조직, 활막, 골격근 등이 알려져 있다^1-4,14,17). 이 중 제대혈 유래 간엽줄기세 포는 골수에서 유래된 간엽줄기세포와 마찬가지로 섬유

모세포와 같은 형태를 보이며, 골, 연골, 지방 세포와 같 은 중배엽성 기원의 세포들로 분화할 수 있는 다분화능을 가지고 있다^1,11,16). 최근에는 이들 세포를 이용하여 신경 세포 또는 내배엽성 기원의 세포로도 분화 유도한 실험 결과들이 보고되어지고 있다4,6,7,10,15)

. 간엽줄기세포는

인간 제대혈 유래 간엽줄기세포군에서 얻어진 단일클론세포군 간의 세포 특성 차이

성지혜․백금옥․성기선․하철원

성균관대학교 의과대학 삼성서울병원 정형외과학교실

Difference in Cell Characteristics among the Monoclonal Cell Populations Obtained from the Human Umbilical Cord Blood

Derived Mesenchymal Stem Cell Population

Ji-Hye Sung, M.S., Geum-Ok Baek, M.S., Ki-Sun Sung, M.D., and Chul-Won Ha, M.D.

Department of Orthopedic Surgery, Samsung Medical Center, Sungkyunkwan University School of Medicine, Seoul, Korea

P u rp o s e : The aim of this study was to obtain single cell-derived clones from human umbilical cord blood (hUCB) derived m esenchym al stem cell (M SC) population, to com pare the gene expression patterns and differentiation characteristics am ong the hUCB derived M SC population and its m ono- clonal cell populations, and to determ ine if the M SC population is hom ogenous.

M a te ria ls a n d M e th o d s : The single cells were isolated from a hUCB derived MSC population and cultured on each well of a culture plate. The gene expression pattern of each m onoclonal cell population expanded from the single cells w as detected by RT-PCR for osteogenic, chondrogenic, and adipogenic specific genes. The m onoclonal cell populations were differentiated into osteogenic, chondrogenic, and adipogenic lineages and w ere confirm ed by specific staining.

R e s u lts : Fifteen monoclonal cell populations were obtained from the total seeding of 864 single cells. The cell m orphology and gene expression patterns am ong the hUCB derived M SCs and its m onoclonal cell population w ere different. Tri-lineage differentiation potency w as different am ong the m onoclonal cell populations.

C o n c lu s io n : The difference in the cell morphology, gene expression patterns, and differentiation characteristics am ong the m onoclonal cell populations suggest heterogeneity of the MSC population isolated using the currently available m ethod.

K e y W o rd s : Human umbilical cord blood, Mesenchymal stem cells, Monoclonal cell population, Gene expression, RT-PCR, Differentiation

통신저자：하 철 원

서울시 강남구 일원동 50 성균관의대 삼성서울병원 정형외과

TEL: 02-3410-0275․FAX: 02-3410-0084 E-mail: hacw@smc.samsung.co.kr

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Tel: +82.2-3410-0275, Fax: +82.2-3410-0084 E-mail: hacw@smc.samsung.co.kr

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배아줄기세포와 달리 윤리적 문제에 제약을 받지 않으며, 면역 반응 회피의 특성이 있어 조직 공학이나 세포 기반 치료를 함에 있어 좋은 소재로 주목받고 있다.

간엽줄기세포가 삼배엽성 기원의 세포로 분화된다는 보고에 대하여, 이것이 줄기세포의 plasticity 때문인지, 혹은 간엽줄기세포 자체가 불균질한 세포군이기 때문인 지에 대해서는 아직 충분한 증거가 제시되지 못하고 있

다^4,6,8,13). 간엽줄기세포를 특징짓거나 분리하기 위한 특

이 표면 항원도 확립되어 있지 않다. 따라서 현재까지 알 려진 방법으로 분리하여 증식시킨 간엽줄기세포군은 여 전히 불균질한 상태로 남아 있을 것으로 생각된다. 진정 한 간엽줄기세포의 다분화능을 확인하기 위해서는 단일 세포에서 증식된 간엽줄기세포를 얻는 것이 필수적이며, 이러한 단일 세포 유래 단일클론세포군의 분화 특성을 확 인한다면 간엽줄기세포를 이용한 세포치료 혹은 조직공 학적 응용에 있어 더욱 유용한 결과를 얻을 수 있을 것이다.

본 연구에서는 인간 제대혈 유래 간엽줄기세포를 단일 세포 배양하여 단일클론세포군을 얻고, 간엽줄기세포군 과 그것으로부터 유래된 단일클론세포군 사이에 유전자 발현 양상과 분화에 어떤 차이가 있는지를 비교함으로써 간엽줄기세포군의 세포 균질성 여부를 확인하고자 하 였다.

대상 및 방법

1. 세포 및 단일클론 세포 배양

본 연구에서 사용한 인간 제대혈 유래 간엽줄기세포군 은 메디포스트(주)(용인, 한국)로부터 분양 받아 이용되 었고, 제태연령이 39.4주인 제대혈에서 분리된 세 종류 의 간엽줄기세포군을 7번의 계대 배양 후 실험에 사용하 였고 3번에 걸쳐 반복실험 하였다¹⁶⁾. 간엽줄기세포군은 α-minimum essential medium (α-MEM, Gibco, Grand Island, NY)을 기본배양액으로 하여 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco)를 첨가한 배양액에서 배양 하였다. 단일클론세포군을 얻기 위하여, 간엽줄기세포를 0.25% trypsin-EDTA (Gibco)로 배양접시에서 떼어낸 후, FBS가 포함된 배양액으로 중화시킨 후, 1,000 rpm 에서 5분 동안 원심 분리하였다. 상층액은 따라 버리고, phosphate buffered saline (PBS, Cellgro, Herndon, VA)으로 수세하였다. 다시 1,000 rpm에서 5분 동안 원 심 분리한 후, 상층액은 따라 버리고 배양액으로 부유시

켰다. 단일 세포 상태의 세포들은 얇게 뽑은 파스테르 파 이펫을 이용하여 96-well plate (Nunc) 또는 48-well plate (Nunc)에 well 당 1개의 세포를 넣어 주었고, 이때 접종된 세포의 수는 간엽줄기세포군 당 288개였다. 단일 세포 배양을 위하여 α-MEM을 기본배양액으로 하여 2 mM L-glutamine (Gibco), 20% FBS, 10 ng/ml human recombinant basic fibroblast growth factor (hrbFGF, Peprotech, Rocky Hill, NJ), 100 units/ml Penicillin (Gibco), 100 units/ml Streptomycin (Gibco) 을 첨가하여 사용하였다^6,8). 단일 세포 접종 이틀 후 광학 현미경으로 세포수를 관찰하여 세포수가 1개가 아닌 well은 단일 세포 접종이 아닌 가능성이 있어 실험 대상 에서 배제시켰으며, 11일 후에 세포수를 다시 관찰하였다.

2. 계대 배양, 유지

단일 세포 접종 13일 후에 관찰하여 well 내에 80% 이 상의 세포가 자란 경우 0.25% trypsin-EDTA를 이용하 여 계대 배양을 실시하였고, 일부는 RNA 추출을 위해 남 겨 -70^oC에 보관하였다. 계대 배양 방법은 위에서 언급 한 간엽줄기세포를 배양접시에서 떼어내는 방법과 동일 하게 실시하였고, 계대 배양 후 배양액은 일주일에 두 번 씩 교환하였다. 배양조건은 5% 이산화탄소 배양기에 온 도 37^oC, 습도 95% 이상을 유지하였다.

3. 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)

단일클론세포군을 계대 배양하고 남긴 세포를 이용하 여 역전사 중합효소연쇄반응을 시행하였다. 총 RNA는 간엽줄기세포군과 각각의 단일클론세포군의 샘플로부터 TRIzol (Invitrogen Technology, Grand Island, NY)을 이용하여 추출하였다. cDNA 합성을 위하여 일정량의 RNA를 사용하였으며, TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver 3.0 (TaKaRa, Japan)을 이용하였다. 합성된 1μg 의 cDNA와 각각의 primer를 첨가한 후, Taq DNA polymerase (TaKaRa)를 사용하여 중합효소연쇄반응을 시행하였다. 역전사 중합효소연쇄반응을 시행한 각각의 유전자 및 annealing 온도, 반응횟수와 반응산물의 크기 는 Table 1에 나타내었다. 골세포 특이 유전자들로 alkaline phosphatase (AP), type I collagen (ColI), osteocalcin (OC), osteonectin (ON), osteopontin (OP) 등을 확인하였고, 연골세포 특이 유전자들로 Ag-

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grecan (AGC), type II collagen (ColII), type IX collagen (ColIX), Sry-type high-mobility-group box 9 (Sox9) 등을 확인하였으며, 지방세포 특이 유전자들로 adipocyte fatty acid-binding protein (aP2), CCAAT/

enhancer binding protein α (C/EBPα), Peroxisome proliferators-activated receptor-γ2 (PPARγ2) 등 을 확인하였다. 실험은 동일한 방법으로 3회 반복 수행하 였다.

4. 분화 유도

단일 세포 접종으로 얻어진 총 15개의 단일클론세포군 중 분화 실험이 가능한 정도까지 세포 증식이 있었던 5개 의 단일클론세포군 (clone 1의 6계대 세포, clone 6의 6 계대 세포, clone 8의 5계대 세포, clone 9의 5계대 세포, clone 11의 5계대 세포)에 대하여 각기 다른 조성의 분화 유도 배양액을 이용하여 골세포, 연골세포, 지방세포로 분화 유도한 후, 특이 염색을 통하여 분화 양상을 확인하 였다. 골세포 분화는 DMEM (Gibco)을 기본배양액으로

하여 10% FBS (Gibco), 0.1μM Dexamethasone, 10 mM β-glycerol phosphate, 0.25 mM ascorbic acid (이상 Sigma, St. Louis, MO)이 첨가된 배양액을 사용 하였으며, 28일 동안 분화 유도하였다⁵⁾.

골세포로의 분화는 alizarin red S (Junsei, Japan)와 alkaline phosphatase (Sigma) 염색으로 확인하였다. 연 골세포 분화는 DMEM (Cellgro)에 0.1μM Dexametha- sone, 50μg/ml Ascorbic acid, 100μg/ml Sodium pyruvate, 40μg/ml proline, 50 mg/ml ITS+ premix (이상 Sigma), 10 ng/ml TGF-β3 (R&D System, Minneapolis, MN)이 첨가된 배양액에 42일 동안 펠렛 배양하여 분화 유도하였다⁹⁾.

연골세포로의 분화는 safranin O (ALPHA Chem, UK) 염색과 type II collagen 면역염색으로 확인하였다.

Type II collagen에 대한 면역염색은 1차 항체 mouse anti-human type II collagen (Oncogene, Cam- bridge, MA)을 1：50으로 희석하여 반응시킨 후, 2차 항체 goat anti-mouse IgG-HRP (Molecular Probes, Table 1. Primer Sequences and PCR Conditions of the Target Genes

ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ

Target genes Primer sequences Annealing Tm (^oC) Cycles PCR product size

GAPDH 5'-GGGCTGCTTTTAACTCTGGT-3' 58 30 702 bp

5'-TGGCAGGTTTTTCTAGACGG-3'

Alkaline phosphatase (AP) 5'-CTACCAGCTCATGCATAACA-3' 58 30 251 bp

5'-GACCCAATAGGTAGTCCACA-3'

Type I collagen (ColI) 5'-TGGAGAGTACTGGATTGACC-3' 58 30 414 bp

5'-AGTGGTAGGTGATGTTCTGG-3'

Osteocalcin (OC) 5'-CAGCGAGGTAGTGAAGAGAC-3' 58 30 155 bp

5'-GATAGGCCTCCTGAAAGC-3'

Osteonectin (ON) 5'-ACATGGGTGGACACGG-3' 58 30 405 bp

5'-CCAACAGCCTAATGTGAA-3'

Osteopontin (OP) 5'-AGGAGTTGAATGGTGCATAC-3'

5'-CTGACTTTGGAAAGTTCCTG-3' 58 30 223 bp

Aggrecan (AGC) 5'-AAACCACCTCTGCATTCCAC-3' 58 35 501 bp

5'-CCTCTGTCTCCTTGCAGGTC-3'

Type II collagen (ColII) 5'-GGACACAATGGATTGCAAGG-3' 51 30 461 bp

5'-TAACCACTGCTCCACTCTGG-3'

Type IX collagen (ColIX) 5'-CTCTGGTGAAGAAGGTGAAG-3' 58 40 256 bp

5'-AACCTGCTTAATGTGCTGAT-3'

Sry-type high-mobility- 5'-GGTTGTTGGAGCTTTCCTCA-3' 58 30 401 bp

group box 9 (Sox9) 5'-TAGCCTCCCTCACTCCAAGA-3'

Adipocyte fatty acid- 5'-GAAAGAAGTAGGAGTGGGCT-3' 58 35 255 bp

binding protein (aP2) 5'-TTTATGGTGGTTGATTTTCC-3' CCAAT/enhancer binding 5'-GTCGGTGGACAAGAACAGC-3'

proteinα (C/EBPα) 5'-ATGGCCTTGACCAAGGAGC-3' 58 35 234 bp

Peroxisome proliferator- 5'-TCAAGCCCTTCACTACTGTT-3' 58 30 250 bp

activated receptor-γ 2 (PPARγ2) 5'-TTATCTCCACAGACACGACA-3'

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Eugene, OR)를 1：100으로 희석하여 반응시켰으며, DAKO Envision^TM+System, HRP (DAB) kit (Dako- Cytomation, Carpinteria, CA)을 이용하여 면역 염색을 수행하였다. 지방세포 분화는 유도 배양액 (DMEM (Cel- lgro)에 1μM Dexamethasone, 0.5 mM 3-iso- butyl-1-methylxanthine, 0.2 mM Indomethacin, 0.01 mg/ml h-insulin (이상 Sigma), 10% FBS (Gibco) 가 첨가된 배양액)과 유지 배양액(DMEM (Cellgro)에 0.01 mg/ml h-insulin (Sigma)과 10% FBS (Gibco)가 첨가된 배양액)으로 번갈아 교체해 주면서 28일 동안 분 화 유도하였다¹²⁾. 지방세포로의 분화는 oil red O (Sigma) 염색으로 확인하였다.

결 과

1. 단일클론세포군의 세포 배양 및 형태 특성 세 종류의 인간 제대혈 유래 간엽줄기세포군을 실험에 사용하였으나, 단일 세포 배양 시 세포 증식이 잘 되지 않아 두 종류의 간엽줄기세포군에서는 실험에 사용할 정 도의 세포수로 증식한 단일클론세포군을 얻을 수 없었기 때문에 한 종류의 간엽줄기세포군에서 유래된 단일클론 세포군만을 사용하여 후속 실험을 수행할 수 있었다. 이 간엽줄기세포군으로부터 얻은 단일클론세포군의 수는 모두 15개였고, 단일클론세포군마다 증식 속도, 세포 형 태 등에서 차이가 관찰되었다. 간엽줄기세포군은 섬유모 세포 모양과 유사한 형태를 보이고 있다(Fig. 1A). 단일 세포 배양된 세포들은 섬유모세포와 유사하게 양쪽 끝이

Fig. 1. Morphology of the hUCB derived MSC population and its monoclonal cell populations. Three types were observed in the monoclonal cell culture. (A) Morphology of the hUCB derived MSC population was similar to that of fibroblasts. (B) Fibroblast-like morphology of a monoclonal cell population. (C) Morphology of another monoclonal cell population. One side is large and flattened, and the other side is sharp. (D) Star-shaped morphology of another monoclonal cell population (Original magnification, ×100).

A B

C D

500 mµ

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뾰족하고 길쭉한 형태, 끝이 크고 넓적하며 반대쪽 끝은 길고 뾰족한 형태, 성상 형태 등 크게 3가지 양상을 보였 다(Fig. 1B-D). 이 중 섬유모세포와 유사한 형태(Fig.

1B), 끝이 크고 넓적한 형태(Fig. 1C)를 보이는 단일클론 세포군인 경우에 다른 형태의 세포군들보다 세포 증식 속 도가 빠르고 계대 배양이 용이하였다. 이러한 단일클론세

포군의 경우 한 개의 세포가 증식하여 96-well dish의 한 well에 약 80% 정도 채워져, 첫 번째 계대 배양이 가 능하기까지 약 2주가 소요되었고, 그 이후에는 4-7일 간 격으로 계대 배양을 할 수 있었다. 같은 조건으로 배양하 였을 때 성상 형태를 띠는 단일클론세포군의 경우(Fig.

1D) 다른 세포군의 세포들보다 세포의 크기가 컸으며, 첫

Fig. 2. Patterns of tissue specific gene expression by RT-PCR in the hUCB derived MSC population and its monoclonal cell populations.

(A) Osteogenic specific genes. AP, OC and OP genes showed different expression patterns among the hUCB derived MSC population and its monoclonal cell populations. (B) Chondrogenic specific genes. AGC, ColIX and Sox9 showed different expression patterns. (C) Adipogenic specific genes. C/EBPα and PPARγ2 showed different expression patterns. “p” of the name of clone means the passage.

A

AP ColI

ON OC

OP

Marker MSC population 7p. Clone12 2p.

Clone11 5p.

Clone10 2p.

Clone9 5p.

Clone8 5p. Clone13 3p.

Clone6 6p.

Clone5 3p.

Clone3 2p.

Clone2 2p.

Clone1 6p. Clone14 3p. Clone15 3p.

Monoclonal cell populations

AGC ColII

Sox9 ColX

Clone11 5p.

Clone10 2p.

Clone9 5p.

Clone6 6p.

Clone5 3p.

Clone3 2p.

Clone2 2p.

aP2 C/EBPα PPAR 2 γ

Clone11 5p.

Clone10 2p.

Clone9 5p.

Clone6 6p.

Clone5 3p.

Clone3 2p.

Clone2 2p.

GAPDH

House-keeping gene

B

C

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번째 계대 배양이 가능하기까지 약 4-6주가 소요되었으 며, 추가적인 계대 배양이 거의 불가능하였다.

2. 인간 제대혈 유래 간엽줄기세포군과 단일클론세포 군 간의 유전자 발현 양상 비교

간엽줄기세포군 및 이로부터 유래된 단일클론세포군들 간에 골, 연골 및 지방세포 특이 유전자의 발현 양상이 모두 차이가 있었다. 골세포 특이 유전자의 발현 양상을 보면, ColI과 ON 유전자는 일정하게 강한 발현 양상을 보이고 있으나, AP, OC, OP 유전자들의 경우 간엽줄기

세포군 및 단일클론세포군들에서 세포군에 따라 발현 정 도에 큰 차이를 보이고 있다(Fig. 2A). 연골세포 특이 유 전자들의 발현 양상은 AGC과 Sox9 유전자의 경우 대부 분 발현되고 있지만, 발현 정도에 있어 세포군에 따라 약 간의 차이를 보이고 있다. ColIX 유전자는 대부분의 세포 군에서 발현되지 않았으나 clone 13에서만 발현되었다.

ColII 유전자는 모든 세포군들에서 강한 발현을 보였다 (Fig. 2B). 지방세포 특이 유전자의 발현 양상의 결과, C/EBPα의 발현이 단일클론세포군들 사이에 큰 차이를 보이고 있고, PPARγ2는 대부분의 경우에 발현되지만

Fig. 3. Single cell derived monoclonal cell populations were differentiated into multiple lineages. Osteogenic differentiation was indicated by alizarin red S staining (A-E; ×200) and alkaline phosphatase staining (F-J; ×200). Chondrogenic differentiation was indicated by safranin O staining (K-O; ×400) and type II collagen immunostaining (P-T; ×400). Adipogenic differentiation was indicated by the accumulation of lipid vacuoles within the cells that were stained with oil red O (U-Y; ×400). The difference in osteogenic, chondrogenic, and adipogenic differentiation potential was identified among the five clones which were induced to differentiate for the same period.

Osteogenic differentiation was more dominant in clone 1 and chondrogenic differentiation was more dominant in clone 9 than the other clones. Adipogenic differentiation was also prominent in clones 1, 8, 9, and 11.

A

B

C

D

E

F

G

H

I

J

K

L

M

N

O

P

Q

R

S

T

U

V

W

X

Y

Clone 1Clone 6Clone 8Clone 9Clone 11

Alizarin red S Alkaline phosphatase Safranin O Type II collagen Oil red O Osteogenic differentiation Chondrogenic differentiation Adipogenic differentiation

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발현 정도에 약간의 차이를 보였다. aP2 유전자는 모든 세포군에서 비교적 강한 발현을 보였다(Fig. 2C).

3. 단일클론세포군에서의 분화 양상

단일클론세포군별로 같은 기간 동안 분화 유도하였을 때 골세포, 연골세포, 지방세포 계열로의 분화 정도에 차 이가 있었다(Fig. 3). 다른 clone들에 비해 clone 1은 골 세포로의 분화가 좀더 잘 이루어졌고, clone 9는 연골세 포로의 분화가 잘 이루어지는 것으로 확인되었다. 지방세 포로의 분화는 clone 6에서는 약하게 분화되었고, clone 1, 8, 9, 11에서는 유사한 정도로 분화되었다.

고 찰

간엽줄기세포는 자가증식 능력을 가지며 중배엽성 기 원의 세포로의 다분화능을 가진 것으로 알려져 있다. 또 한 최근에는 신경세포나^4,6,15) 내배엽성 기원의^6,7,10) 세포 로도 분화 가능한 것으로 보고되고 있다. 그러나 이러한 보고들은 이용된 간엽줄기세포군의 균질성이 완전히 확 인된 상태에서 수행된 연구결과가 아니며, 또한 간엽줄기 세포군 유래 단일클론세포군으로부터 중배엽성 또는 비 중배엽성의 조직들로 분화가 될 수 있다는 것을 보여주지 는 못하고 있다. 즉, 전체 단핵세포로부터 접종되어 부착 된 세포군들이 간엽줄기세포로 여겨져 사용되고 있고, 그 것은 불균질한 세포군이 삼배엽성 계열의 전구세포를 포 함할 수도 있다는 가능성과 각기 다른 분화유도 조건이 다양한 전구세포의 증식이나 분화에 영향을 미칠 수도 있 다는 가능성을 증가시켜 오해를 불러 일으킬 수도 있기 때문에 간엽줄기세포군으로부터 단일클론세포군을 얻어 각 세포군의 특징을 확인하는 과정이 간엽줄기세포군의 특성을 확인하는 데 필요하다고 하겠다.

이에 본 연구에서는 인간 제대혈 유래 간엽줄기세포군 으로부터 단일 세포 배양과정을 통해 15개의 단일클론세 포군을 얻었다. 실험에 사용된 인간 제대혈 유래 간엽줄 기세포군은 유세포 분석 결과 인테그린(integrin) 수용체 관련항원인 CD29, 기질(matrix) 수용체 관련항원인 CD44, 간엽줄기/전구세포 관련항원인 SH2, SH3, SH4, 기타 항원인 CD90에서 양성을 보이고, 조혈관련항원인 CD14, CD34, CD45, 파골세포 항원인 CD51/61, 기질 수용체 관련 항원인 CD106, 조직 적합 항원인 HLA-DR에서 음 성을 보임이 확인되었다¹⁶⁾. 단일 세포 배양된 세포들은

섬유모세포와 유사하게 양쪽 끝이 뾰족하고 길쭉한 형태, 끝이 크고 넓적하며 반대쪽 끝은 길고 뾰족한 형태, 성상 형태를 보였다. 간엽줄기세포군과 같이 섬유모세포와 유 사하게 양쪽 끝이 뾰족하고 길쭉한 형태 또는 끝이 크고 넓적하며 반대쪽 끝은 길고 뾰족한 형태를 보이는 단일클 론세포군에서 세포 증식 속도가 빨랐고, 세포를 배양하는 동안 세포의 형태가 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 단 일 세포 접종 시부터 성상 형태를 보였거나 계대 배양을 거치면서 세포 형태가 성상 형태로 변화하는 양상을 보인 단일클론세포군의 경우, 세포 증식 속도가 느리고 사멸하 는 세포의 수가 증가되어 결국에는 계대 배양이 불가능한 상태에 이르기도 하였다. 이와 같이 서로 다른 형태의 세 포들이 확인되었고, 이들 간에 세포 성장 및 증식 특성이 다른 점이 확인된 바 현재 많은 연구에서 사용되고 있는 간엽줄기세포군은 순수한 한가지 종류의 세포들의 집단 이 아닌 불균질한 세포의 집단이라는 것을 보여준다 하겠 다. 본 연구에서 경험한 바 단일 세포 배양이 매우 어려웠 으며, 세포가 잘 증식하지 않아 그 수율은 매우 낮았다.

총 864개의 단일 세포를 접종하였으나 15개에서만 단일 클론세포군을 얻을 수 있었으며, 이러한 결과는 현재까지 알려진 방법으로 얻어진 간엽줄기세포군 내의 세포 중 진 정한 줄기세포라고 할 수 있는 세포는 극히 일부일 수도 있다는 것을 시사한다 하겠다.

본 연구를 통하여 확보된 단일클론세포군들이 서로 다 른 특성을 보이는 것을 고려할 때 이들 중 어떠한 것이 진정한 줄기세포인지, 또한 서로 다른 단일클론세포군이 어떠한 의의를 가지는가에 대해서는 추가적인 연구가 되 어야 할 것으로 사료된다. 역전사 중합효소연쇄반응을 시 행하여 인간 제대혈 유래 간엽줄기세포군과 단일클론세 포군 사이의 유전자 발현 양상을 확인한 결과 각각의 세 포군들 사이에 차이가 있음이 확인되었다. 골세포 특이 유전자의 경우 AP, OC, OP에서 차이를 보이고 있고, 연 골세포 특이 유전자들에서 AGC, ColIX, Sox9이 차이를 보이고 있다. 또한 지방세포 특이 유전자의 경우 C/EBP α, PPARγ2에서 눈에 띄는 차이를 보이고 있음을 알 수 있었다. 15개의 단일클론세포군 중 분화 유도 실험을 수 행하였던 5개의 단일클론세포군들 사이의 분화 양상을 비교해본 결과, 각각의 세포군들 사이에 유전자 발현 양 상뿐 아니라 분화능에서 차이가 있음을 확인할 수 있었는 데, 이러한 역전사 중합효소연쇄반응의 결과와 분화능에

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서 보여지는 차이 또한 다양한 세포원으로부터 기존의 방 법으로 분리 및 확인된 간엽줄기세포군이 불균질한 세포 의 집단이라는 것을 시사한다 하겠다.

본 연구에서는 인간 제대혈 유래 간엽줄기세포군과 단 일클론세포군 사이의 차이를 세포의 형태, 유전자 발현 양상 및 분화 유도 후 분화능의 비교 등의 방법으로 확인 하였지만, 이러한 차이를 보이는 단일클론세포군에 대한 표면 항원 확인 실험을 수행하지 못한 것은 제한점으로 생각된다. 표면 항원을 비교하기 위해서는 많은 수의 세 포를 확보해야 하는데, 단일 세포 접종 후 배양하는 방법 으로는 세포수를 많이 얻기가 힘들었고, 또한 표면 항원 의 확인은 많은 연구비가 소요되는 바 수행하지 못하였 다. 총 15개의 단일클론세포군 중에서 분화 실험까지 수 행하는데에 필요한 충분한 세포수를 확보할 수 있었던 5 개의 단일클론세포군에 대해서만 분화 실험을 수행할 수 있었는데, 나머지 세포군들에 대해서도 분화 실험을 수행 하여 분화 양상을 비교할 수 있었으면 더 좋은 결과를 얻 을 수 있었을 것으로 생각되지만, 다른 측면에서 고려해 볼 때, 증식 능력이 좋았던 5개의 단일클론세포군이 그렇 지 못했던 세포군들보다 증식 능력 보유 자체만으로도 진 정한 줄기세포의 특성을 지닌 세포군일 수 있을 것으로 사료된다. 향후 개체가 다른 인간 제대혈 유래 간엽줄기 세포군으로부터 단일클론세포군을 얻어 본 연구에서와 동일한 방법으로 실험을 수행하여 그 결과를 확인하고 개 체군 사이에서 단일클론세포군의 차이를 비교한다면 더 욱 흥미로운 결과를 얻을 수도 있을 것으로 생각된다.

이와 같이 인간 제대혈 유래 간엽줄기세포군 내의 세포 불균질성 및 그 특성을 면밀히 고려하면 인간 제대혈 유 래 간엽줄기세포를 이용한 조직재생이나 세포치료를 함 에 있어 더 나은 결과를 얻을 수 있는 유용한 자료로 활용 될 것으로 생각된다.

결 론

인간 제대혈 유래 간엽줄기세포군에 대해 단일 세포 접 종을 시행하여 단일클론세포군을 얻을 수 있으며, 이러한 단일클론세포군의 형태학적 특성, 유전자 발현 양상 및 분화 특성의 다양성은 현재 사용되고 있는 방법으로 분리 된 간엽줄기세포군이 불균질한 세포 집단인 것을 시사한 다고 판단된다.

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= 국문초록 =

목 적: 인간 제대혈 유래 간엽줄기세포군에서 단일클론세포군을 얻고, 간엽줄기세포군과 이로부터 유래된 단일 클론세포군의 유전자 발현 양상 및 분화 특성을 비교하여 간엽줄기세포군의 세포 균질성 여부를 확인하고자 하였다.

대상 및 방법: 인간 제대혈 유래 간엽줄기세포군을 단일 세포 접종하여 배양하였다. 이렇게 얻어진 각각의 단일 클론세포군에 대하여 골세포, 연골세포, 지방세포 특이 유전자의 발현 양상을 확인하였다. 일부 단일클론세포군 은 골세포, 연골세포 및 지방세포로 분화 유도한 후 특이 염색으로 확인하였다.

결 과: 총 864개의 단일 세포 접종 배양으로 15개의 단일클론세포군을 얻었다. 간엽줄기 세포군 및 이로부터 유래된 15개의 단일클론세포군들 사이에 세포의 형태 및 유전자 발현 양상에 차이가 있음이 확인되었다. 또한 세 가지 계열로 분화를 유도하였던 5개의 단일클론세포군 사이에 분화 양상에 큰 차이가 있음을 확인하였다.

결 론: 인간 제대혈 유래 간엽줄기세포로 얻어진 단일클론세포군 간의 세포 형태, 유전자 발현 양상 및 분화 특성의 차이는 현재 사용되고 있는 방법으로 분리된 간엽줄기세포군이 불균질한 세포 집단인 것을 시사한다고 판단된다.

색인 단어: 인간 제대혈, 간엽줄기세포, 단일클론세포, 유전자 발현, 역전사 중합효소연쇄반응, 분화