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Effects of Thujae Orientalis Folium (TOF) on Gene Expression of Human melanoma cells (SK-MEL-2)

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(1)

교신저자 : 최정화, 광구광역시 남구 월산동 동신대학교부속광주한방 병원 안이비인후피부과학교실 (Tel. 062-350-7217, eu211@hanmail.net)

접수 2010/07/06 수정 2010/07/31 채택 2010/08/03 한방안이비인후피부과학회지 제23권 제2호(2010년 8월) The Journal of Korean Oriental Medical Ophthalmology &

Otolaryngology & Dermatology 2010;23(2) : 81-108

側柏葉이 인간 유래 악성 흑색종 세포의 유전자 발현에 미치는 영향

정민영·김종한·박수연·최정화 동신대학교 한의과대학 안이비인후피부과학교실

Effects of Thujae Orientalis Folium (TOF) on Gene Expression of Human melanoma cells (SK-MEL-2)

Min-Young Jung·Jong-Han kim·Su-Yeon Park·Jeong-Hwa Choi

Objecitve : Thujae Orientalis Folium (TOF) can cool the blood and stop bleeding, eliminate phlegm and relieve cough in Oriental medicine. In addition, the fresh is used alone externally. Recently, TOF is known to have anti-tumor component. And also known to have tyrosinase inhibitory effect.

Method : For these reasons, this study was designed to investigate anti-cancer and whitening activities of TOF. In this experiment, effects of TOF on proliferation rates of melanoma cells and on changes in genetic profiles were investigated. The genetic profile for the effect on human derived melanoma cell, SK-MEL-2, was measured using microarray technique, and the functional analysis on these genes was conducted.

Results : Total 541 genes were up-regulated and 1,079 genes down-regulated in cells treated with TOF.

Genes induced by TOF were mainly concerned with anti-cancer effects and apoptosis. Genes suppresed by TOF were related in extracellular signalling pathway. The network of total protein interactions was measured using cytoscape program, and some key molecules, such as THAP1, MAX1, STAM2, SMAD6, CYCS, PEX5, PSEN1, NONO, MAP2K7 and CREB1 that can be used for elucidation of therapeutical mechanism of medicine in future were identified.

Conculusion : These results suggest possibility of TOF as anti-cancer drug for human melanoma. In addition, the present author also suggest that related mechanisms are involved in inhibition of several cancer pathway, activation of apoptosis pathway and suppression of general metabolic pathway.

Key words : Thujae Orientalis Folium (TOF), anti-tumor component, tyrosinase inhibitory effect, anti-cancer,

whitening activities, human melanoma.

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Ⅰ. 서 론

악성 흑색종은 멜라닌 세포에서 기원하는, 사망 률이 높은 악성 종양으로 최근 평균 수면의 연장 에 따른 노인층 인구의 증가, 경제 성장에 기인한 환경오염과 오존층의 파괴 등으로 피부 악성 종양 의 발생빈도가 증가하고 있는 실정이다1).

側柏葉(Thujae Orientalis Folium) 은 凉血止血, 止咳化痰, 生肌, 殺蟲, 烏鬚髮 等의 한 효능이 있 어 風冷歷節, 吐血, 衄血, 喀血, 便血, 肺熱咳嗽, 湯火傷, 凍傷, 鬚髮早白 등을 치료 하는데 사용된 2-7). 이러한 側柏葉은 최근 항산화 효과8)와 멜라 닌 세포 억제 작용9)이 밝혀지고, 또한 탈모에 효 과적10)이라는 연구가 발표됨에 따라 피부 및 미용 계에 주목을 받고 있다.

側柏葉의 flavonoid 성분으로서 quercetin 과 myricetin 에 대한 연구를 살펴보면 천11) quercetin 이 고농도에서 멜라닌 생성을 억제한다 고 하였고, 송12) 은 myricetin이 tyrpsinase protein 의 발현을 촉진시켜 멜라닌 생성을 증가 시킨다고 보고하였다. 이러한 상반된 결과에 준하 여 側柏葉 메탄올 추출물의 피부의 멜라닌 세포에 미치는 영향을 알아본 실험에서는 側柏葉이 유의 한 수준으로 멜라닌 생성을 억제하는 것으로 나타 났다9).

이에 저자는 악성 흑색종에 유의한 효과를 보일 것 이라 예상되는 側柏葉의 항암작용에 대한 기전 을 알아보기 위해 인간 유래 악성 흑색종 세포주 인 SK-MEL-2 에 側柏葉 추출물을 투여하고 세포 독성을 살펴 본 다음, RNA 를 추출하여 유전자의 발현 정도를 Microarray 기법으로 분석하여 유의 한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 재료 1) 세포주

인간 유래 악성 흑색종 세포주인 SK-MEL-2 세 포주는 한국 세포주 은행(서울, 한국) 으로부터 냉 동상태로 구입하여 실험에 사용하였다. 분주 받은 세포주는 해동되어 배양액 속에 분주 된 후, 2 주 이상 계대 배양하여 실험실 환경 및 기타 배양 환 경에 충분히 적응 시킨 후 증식률(Doubling Time) 이 구입처에서 제공한 자료와 거의 일치하 게 되었을 때, 충분히 적응하였다고 생각하고 실험 에 사용하였다.

2) 약재의 준비

본 실험에서 사용된 側柏葉 (Thujae Orientalis Folium, TOF)으로는 측백나무과에 속하는 상록 교목인 측백나무의 어린 가지와 잎으로 동신대학 교 광주 한방병원을 통하여 구입, 동신대학교 본초 학 교실에서 정선하여 사용하였다.

3) 시약 및 기기

Fetal bovine serum (Gibco LOT. NO.

1006842, FBS) 및 mRNA 분리를 위한 Trizol reagent (invitrogen, Cat# 15596-026) 은 진성 SMR (광주, 한국) 을 통하여 구입하였고, RPMI 1640 (Sigma, R4130), penicillin -streptomycin (100 units/㎖, 100 ㎍/㎕), Trypsin-EDTA (Sigma) 및 기타 시약은 Sigma(St. Louis, MO, USA) 제 품을 구입 사용하였다. 측정을 위해 Micro-plate reader(Bio-rad, CA) 등이 사용되었다.

2. 방법

1) 세포주 배양 환경

악성 흑색종 세포주인 SK-MEL-2 의 생육 배지

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정민영 외 3인 : 側柏葉이 인간 유래 악성 흑색종 세포의 유전자 발현에 미치는 영향

로는 RPMI 1640 (Sigma, R4130) 배지를 사용하 였고, 배지에는 10 % fetal bovine serum (Gibco LOT. NO. 1006842, FBS)와 penicillin- streptomycin(100 units/㎖, 100 ㎍/㎕) 을 첨가하 였다. 세포주의 계대 배양은 2 일 간격으로 시행 하였고, 부착세포의 탈착을 위해서 Trypsin -EDTA (Sigma, USA) 를 사용하였다. 악성 흑색 종 세포주는 5 % CO2 가 공여되는 배양기 속에 서 37 ℃를 유지하며 배양되었다.

2) 약물의 준비

세척되고 세절된 상태로 구입된 側柏葉 160 g을 증류수 1,200 ㎖과 함께 전기약탕기(대웅, 한국)로 100 ℃에서 3시 간 동안 전탕하여 물 추출을 시행 하였다. 전탕한 추출물을 부직포로 거른 다음 동결 건조기(삼원, 한국)를 이용하여 동결건조 분말을 얻 었다. 최종적으로 얻어진 건조분말은 16.3 g이었 다. 이렇게 하여 얻어진 분말은 실험에 사용하기 위하여 인산 완충액 (PBS, phosphate buffered saline)에 다시 녹여 진 후, 2000 rpm 에서 15 분 간 원심 분리하여 찌꺼기를 제거하고, 상층액을 얻 었다. 얻어진 상층액은 와트만 지(whatman paper) 로 거른 다음 최종 적으로 0.22 um 크기 의 필터(Syringe filter, Whatman) 로 걸러 멸균을 대신 하였다. 이렇게 하여 얻어진 검액은 소량씩 나누어 -20 ℃에 보관하였다가 사용 직전 해동하 여 사용하였다.

3) 세포 증식율 측정

세포 증식율은 변형된 3-(4,5-dimethylthiazol- 2yl)-2,5-diphenyl- 2H-tetrazolium bromide, (MTT) 방법에 의존하였는데, 모든 과정은 제조사 에서 제공한 가이드라인에 시행되었다13). 먼저 96-well plate (Nunc, Netherlands) 에 측정하고 자 하는 대상 세포주를 well당 5 x 103 개의 분량 으로 분주 하고, 37 ℃, 5 % CO2 가 공여되는 환

경에서 24 시간을 배양하여 부착 및 안정화를 시 행하였다. 24 시간의 배양이 끝난 후, 상기한 방법 으로 제조된 TOF 를 농도별로 배양액에 희석하여 부착 및 안정화된 세포주에 공급하고, 24 시간 동 안 배양 하였다. 24 시간 동안의 배양이 끝난 후, 각 well 당 10 ㎖ 의 Cell Counting Kit-8 (CCK-8 sol., Dojindo, Japan) 용액을 첨가하고 37 ℃, 5 % CO2 가 공여되는 환경에서 3 시간 동안 방치하였다. 3 시간 후, Micro-plate reader(Bio-rad, CA) 를 이용하여 450 nm 파장에 서 흡광도를 측정하였다. 정상 대조군으로는 약물 을 첨가하지 않은 well 을 사용하였고, 결과는 정 상 대조군에 대한 백분율로 환산하여 나타내었다.

4) RNA 분리를 위한 약물 처리 및 실험군 분류 1×106 개의 악성흑색종 세포를 100 Φ dish (SPL, 한국) 에 분주한 후, 37 ℃, 5 % CO2 공여되는 환경에서 24 시간을 배양하여 부착 및 안정화를 시행하였다. 24 시간의 배양이 끝난 후, 실험군은 TOF 를 250 ㎍/㎖ 농도로 투여하고 다시 24 시간 동안 배양하였다. 정상 대조군으로 는 실험군과 동일한 조건에서 배양된 후, 동일한 용량의 PBS 를 투여하였다.

5) RNA 분리

Microarray 분석을 위한 RNA 분리는 Florell 14)의 방법을 변형하여 시행되었다. 상기한 방법 으로 약물을 투여하고 24 시간이 지난 후, 생육 배지를 완전히 제거한 다음, 인산 완충액을 이용하 여 3 번 수세 하였다. 수세 과정이 끝 난 후, 각 각의 dish 에 2 ㎖ 의 Trizol reagent (invitrogen, Cat# 15596-026) 를 넣고 pipet 을 이용하여 세포 를 분리 수거 한 다음 바로 동결시킨 후 액체질소 에 보관하였다가 RNA 분리에 사용하였다. 동결세 포로부터 total RNA 를 분리하였는데, 이것은 Qiagen 에서 제시한 방법에 따라 이루어졌다.

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6) RNA 추출 정도 관리

total RNA를 아가로스겔(agarose gel) 상에서 전기영동한 후 28S/18S RNA 의 비율을 측정하여 정도 관리하여 분석 적합 판정을 확인한 후 실험 을 진행하였다. Microarray 실험에 있어서 결과에 영향을 주는 여러 가지 factor들 중 가장 중요한 것이 RNA 이며15), 이 RNA 상태를 확인하기 위 해 Agilent 사의 Bioanalyzer2100 을 사용하여 rRNA ratio (28S/18S ribosomal RNA) 를 확인함 으로써 판정하였다.

7) DNA 칩을 이용한 실험

Human Genome Microarray Kit (Agilent Technology, U.S.A) 을 이용하여 실험을 수행하 였다. 정도 관리를 통과한 total RNA 를 이용하여 cDNA를 합성하고, cDNA 로부터 dsDNA 를 합 성하였다. dsDNA 로부터 형광이 표지된 cRNA를 합성하고, 이를 Agilent Hybridization oven (Agilent Technology, USA) 에서 DNA 칩에 반 응 시켰다. 형광 표지된 cRNA 제작시 20 ㎍의 total RNA 를 사용하였다. 어레이를 씻어낸 후 ScanArray scanner (Perkin-Elmer, Boston, MA) 로 스캔하였으며, 정상 RNA 를 레퍼런스 (reference) 로 사용하여 DNA 칩상의 대다수 cDNA spots (85% 이상)이 검출됨을 확인하였다.

8) 데이터분석

이미지파일에서 IMAGENE 4.0 (Bio-discovery, Marina del Rey, CA)를 사용하여 1차 데이터를 얻은 후 LOWESS(LOcally WEighted Scatterplot Smoothing method)16) 를 사용하여 표준화하였다.

모든 칩상의 spot 에서, 각 채널의 형광 강도가 배 경의 형광 강도보다 1.5 배 더 큰 경우에 한해 제 대로 측정된 것으로 판단하여 선별하였고, 시료에 서 제대로 측정되지 않은 것은 제외시켰다. 발현 비율은 CLUSTER 를 이용하여 순차적 클러스터링

한 후 TREEVIEW (M.B. Eisen, http://rabam.lbl.

gov)17)를 이용하여 시각화하였다. 유전자 기능분석 FatiGo algorithms (Http://.babelomics.

bioinfo. cipf.es) 를 이용하여 수행하였다. 클래스 비교은 CL통해 얻어진 결과용하여alse Discovery Rate (FDR) 값이 0.05 이하일 때 의미 있용하것으로 판단하였다. 단백질 결합은 BOND 데이터베이스 (http://bond.unlicedinformatics.com) 에서 얻어진 인간 단백질 데이터베이스로 cytoscape program (버전 2.4) 을 이용하여 분석 하였다.

3. 통계 처리

세포 증식율 실험 결과에 대한 통계적 분석은 통계 패키지인 Sigma plot (Sigma plot for Windows, ver. 9.0, U.S.A.) 를 이용하여 student t-test를 시행하였으며 실험 성적은 평균±

표준편차(mean±SD) 로 나타내었다. 발현 증가 및 감소된 유전자 간의 유의성 검증에는 Chi-square test 를 사용하여 p-값이 0.05 미만일 때 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.

Ⅲ. 성 적

1. 악성 흑색종 세포의 증식율에 미치는 영향 TOF 가 악성 흑색종 세포주의 증식률에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 농도별로 악성흑색종 세 포주에 처리하고 증식률을 관찰하였다. 실험 결과 를 살펴보면, TOF 는 62.5 ㎍/㎖ 이상 농도에서 악성 흑색종 세포의 증식률을 유의하게 감소시켰 다. 대조군의 증식율을 100(%)로 하였을 때, 62.5, 125, 250, 500, 1000 ㎍/㎖ 투여에 의한 증식율은 각각 92.9±3.1, 84.5±10.9, 76.9±9.3, 78.2±8.9, 76.8±5.0%였다(Fig. 1).

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정민영 외 3인 : 側柏葉이 인간 유래 악성 흑색종 세포의 유전자 발현에 미치는 영향

0 20 40 60 80 100 120

0 62.5 125 250 500 1000

ug/ml

Proliferation rates (%)

**

***

* ** **

Fig. 1. Effects of TOF on cell viabillity of SK-MEL-2 cells in vitro

SK-MEL-2 Cells were attached 96-well plate, and added TOF as indicated concentrations respectively.

After 24 hr incubation, proliferation rates were measured using altered MTT methods. Values are expressed as percentage of control. Result are presented as mean±SD. *P < 0.05, **P < 0.01, and

***P < 0.001 vs. non-treated Control. (n=6)

Fig. 2A. Migration pattern of RNA

Quality of total RNA extracted from control and herbal treated SK-MEL-2 cells were tested. RNA was extracted by using Trizol reagent. The quality and quantity was measured by spectrophotometric absorbance and migration pattern of RNA. The numbers on left side of figure indicate the standard size of RNA.

2. 추출된 RNA의 정도 관리 결과

유전자 분석을 위하여 추출된 total RNA 의 정 도 관리를 위하여 일차적으로 함량과 순도를 측정 한 결과 대조군 (control)은 0.50 ㎍/㎕, 실험군 (Herb)은 0.52 ㎍/㎕이었으며, 전기영동 결과상에 서 동일한 위치에 밴드가 관찰되어 유전자 분석을 위해 필요한 조건을 충족하였다(Fig. 2).

Fig. 2B. Peak pattern of RNA

Quality of total RNA extracted from control and herbal treated SK-MEL-2 cells were tested. RNA was extracted by using Trizol reagent. The quality and quantity was measured by spectrophotometric absorbance and migration pattern of RNA.

3. DNA 칩 이미지

Agilent Whole Human Genome 44K 올리고 칩을 사용하여 세포의 전체 유전체 변이를 분석하 였다. Cy3 와 Cy5 로 구성된 two colors system 을 사용하였기 때문에 분석 결과는 적색과 녹색 spot 으로 표현되어졌다. 대부분의 유전자는 의미 있는 변화를 보이지 않았기 때문에 대부분의 spot 이 노란색으로 나타났다(Fig. 3).

(6)

Fig. 3. Raw image of microarray

A total sequence set of ~20,000 oligo-nucleotides were printed onto glass microscope slides. The probe preparation and hybridization were performed using 3DNA array detection system with 20ug of total RNA from cells. Untreated cells was used as reference RNA.

4. DNA 칩에서의 신호강도 (signal intensity) 분 포의 표준화

칩의 이미지로부터 cy3 와 cy5 의 신호를 수치 화하여 각각의 축에 대응시킨 결과는 신호가 낮은 쪽일수록 편차가 크게 발생하고 있으며, 따라서 낮 은 신호의 유전자일 경우 분석에 유의해야 함을 보여준다. 통계학적으로 정규분포를 이루도록 표준 화 과정을 거친 후에 분석하고자 하여 원천 이미

지에서 얻어진 1 차 데이터를 LOWESS 기법을 사 용해 표준화하였다. 표준화 후 유전자의 분포를 발 현 비율 (log 비)와 강도 (log 강도)간의 관계로 나 타낸 결과 유전자의 발현 비율이 0 을 기점으로 하는 일직선 형태로 변화되었다(Fig. 4).

Fig. 4A. Intensity distribution of microarray

Data achieved from raw image was distributed.

X-axis represents Cy3-channel signal intensity. Y-axis represents Cy5-channel signal intensity.

Fig. 4B. Normalization of microarray (MA plot)

Primary data from raw image were normalized using

lowess method. Vertical axis represents log ratio and

horizontal axis represents log intensity of all spots

after normalization.

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정민영 외 3인 : 側柏葉이 인간 유래 악성 흑색종 세포의 유전자 발현에 미치는 영향

Fig. 5A. Functional annotation of up-regulated genes in cells treated with TOF

Total 541 genes were up-regulated in cells treated with TOF. The functional distribution of these genes was analyzed in biological process category in ontology. Major genes in each categories were represented in green.

The horizontal bar represents the percentage of specific functional category in Molecular Function. The list was arrayed in decreasing percentage of functional category.

Fig. 5B. Functional annotation of up-regulated genes in cells treated with TOF

Total 541 genes were up-regulated in cells treated with TOF. The functional distribution of these genes was analyzed in Molecular Function category in ontology. Major genes in each categories were represented in green.

The horizontal bar represents the percentage of specific functional category in Molecular Function. The list was

arrayed in decreasing percentage of functional category.

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Fig. 5C. Functional annotation of up-regulated genes in cells treated with TOF

Total 541 genes were up-regulated in cells treated with TOF. The functional distribution of these genes was analyzed in Cellular Component category in ontology. Major genes in each categories were represented in green.

The horizontal bar represents the percentage of specific functional category in Cellular Component. The list was arrayed in decreasing percentage of functional category.

Fig. 6A. Functional annotation of down-regulated genes in cells treated with TOF

Total 1,079 genes were down-regulated in cells treated with TOF. The functional distribution of these genes was analyzed in Biological Process category in ontology. Major genes in each categories were represented in green.

The horizontal bar represents the percentage of specific functional category in Biological Process. The list was

arrayed in decreasing percentage of functional category.

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정민영 외 3인 : 側柏葉이 인간 유래 악성 흑색종 세포의 유전자 발현에 미치는 영향

Fig. 6B. Functional annotation of down-regulated genes in cells treated with TOF

Total 1,079 genes were down-regulated in cells treated with TOF. The functional distribution of these genes was analyzed in Molecular Function category in ontology. Major genes in each categories were represented in green.

The horizontal bar represents the percentage of specific functional category in Molecular Function. The list was arrayed in decreasing percentage of functional category.

Fig. 6C. Functional annotation of down-regulated genes in cells treated with TOF

Total 1,079 genes were down-regulated in cells treated with TOF. The functional distribution of these genes was analyzed in Cellular Component category in ontology. Major genes in each categories were represented in green.

The horizontal bar represents the percentage of specific functional category in Cellular Component. The list was

arrayed in decreasing percentage of functional category.

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Fig. 7A. Comparison of functional distribution in Biological Process

Both up- and down-regulated genes were analyzed in Biological Process category in ontology. The horizontal bar represents the percentage of specific functional category in Biological Process. The list was arrayed in decreasing percentage of functional category. Red and Green color represent percentage of up-regulated and down-regulated genes, respectively, in each functional category.

Fig. 7B. Comparison of functional distribution in Molecular function

Both up- and down-regulated genes were analyzed in Molecular Function category in ontology. The horizontal bar

represents the percentage of specific functional category in Molecular Function. The list was arrayed in decreasing

percentage of functional category. Red and Green color represent percentage of up-regulated and down-regulated

genes, respectively, in each functional category.

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정민영 외 3인 : 側柏葉이 인간 유래 악성 흑색종 세포의 유전자 발현에 미치는 영향

Fig. 7C. Comparison of functional distribution in Cellular component

Both up- and down-regulated genes were analyzed in Cellular component category in ontology. The horizontal bar represents the percentage of specific functional category in Cellular component. The list was arrayed in decreasing percentage of functional category. Red and Green color represent percentage of up-regulated and down-regulated genes, respectively, in each functional category.

5. 발현이 증가된 유전자들에 대한 기능 분석 TOF 처리에 의하여 발현이 증가된 유전자의 개 수는 총 541 개였다. 이 유전자들이 어떤 기능에 관련된 유전자들인지 살펴보기 위하여 생물학적 과정, 분자기능 및 세포 구성요소로 나누어 분석하 였다. 분석 결과 생물학적 과정 항목에서는 primary metabolic process, cellular metabolic process 등과 관련된 유전자가 많았다(Fig. 5A).

분자기능항목별 분석에서는 protein binding, ion binding 등에 관여하는 유전자가 많은 것으로 나 타났다(Fig. 5B). 세포 구성요소 관련 분석에서는 기본적인 cell part 에 존재하는 물질 관련한 유전 자가 가장 많았다(Fig. 5C).

6. 발현이 감소된 유전자들에 대한 기능 분석 TOF에 의하여 발현이 감소된 유전자의 개수는

총 1,079 개였다. 이 유전자들이 어떤 기능에 관 련된 유전자들인지 살펴보기 위하여 생물학적 과 정, 분자기능 및 세포 구성요소로 나누어 분석하였 다. 분석 결과 생물학적 과정 항목에서는 cellular metabolic process, primary metabolic process 등과 관련된 유전자가 많았다(Fig. 6A). 분자기능 항목별 분석에서는 protein binding, ion binding 등에 관여하는 유전자가 많은 것으로 나타났다 (Fig. 6B). 세포 구성요소 관련 분석에서는 기본적 인 cell part 에 존재하는 물질 관련한 유전자가 가장 많았다(Fig. 6C).

7. 생물학적 과정, 분자기능 및 세포 구성요소 항 목에서의 기능 분포 비교

발현이 감소되었거나 증가된 유전자들의 기능을 분류하였을 때, 거의 유사한 기능별 분포를 보여주 고 있다는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5, 6). 따라

(12)

Fig. 8B. DNA profile analysis related in bladder cancer pathway

Red box indicates up-regulated genes. The represented pathways were obtained from KEGG(Kyoto encyclopedia of Genes and Genomes).

서, 증가되거나 감소된 유전자를 분석하여 비교우 위를 결정할 필요가 있다. 생물학적 과정의 경우 macromolecule metaboic process, cellular metaboic process, primary metaboic process 에 관련된 유전자가 유의한 수준으로 발현 감소했 음을 알 수 있다(Fig. 7A). 분자기능 분포에 대한 유전자를 상호 비교 분석한 결과 nucleic acid binding과 관련된 유전자들의 발현이 유의한 감소 를 보였다(Fig. 7B). 세포성분에서의 분포도를 살 펴볼 때 membrane bound organelle 에 관련된 유전자들의 발현 정도가 유의한 감소를 보였다 (Fig. 7C).

8. 발현이 증가된 유전자 관련 기전 분석

TOF 처리에 의하여 발현이 증가된 유전자를 대 상으로 이 유전자들이 어떤 기전에 관여하는지 살 펴보기 위하여 세포내 기전들을 중심으로 분석한 결과 bladder cancer pathway, glioma pathway,

Fig. 8A. Integrated analysis of pathway on up-regulated genes

To measure the effect of up-regulated genes on biological pathway, integrated approach was performed using signaling pathway impact analysis (SPIA) algorithm.

cytokine-cytokine receptor interaction pathway, colorectal cancer pathway, chronic myeloid leukemia pathway, basal cell carcinoma pathway and apoptosis pathway와 관련된 유전 자의 발현이 증가한 것으로 나타났다(Fig. 8).

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정민영 외 3인 : 側柏葉이 인간 유래 악성 흑색종 세포의 유전자 발현에 미치는 영향

Fig. 8C. DNA profile analysis related in glioma pathway

Red box indicates up-regulated genes. The represented pathways were obtained from KEGG.

Fig. 8D. DNA profile analysis related in cytokine-cytokine receptor interaction pathway

Red box indicates up-regulated genes. The represented pathways were obtained from KEGG.

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Fig. 8E. DNA profile analysis related in apoptosis pathway

Red box indicates up-regulated genes. The represented pathways were obtained from KEGG.

9. 발현이 감소된 유전자 관련 기전 분석

TOF 처리에 의하여 발현이 감소된 유전자를 대 상으로 이 유전자들이 어떤 기전에 관여하는지 살 펴보기 위하여 세포내 기전들을 중심으로 분석한 결과 ECM-receptor interaction pathway, JAK-STAT signaling pathway, and systemic lupus erythematosus pathway 와 관련된 유전자 의 발현이 감소한 것으로 나타났다(Fig. 9).

Fig. 9A. Integrated analysis of pathway on down-regulated genes

To measure the effect of down-regulated genes on

biological pathway, integrated approach was

performed using signaling pathway impact analysis

(SPIA) algorithm.

(15)

정민영 외 3인 : 側柏葉이 인간 유래 악성 흑색종 세포의 유전자 발현에 미치는 영향

Fig. 9B. DNA profile analysis related in ECM-receptor interaction pathway

Red box indicates up-regulated genes. The represented pathways were obtained from KEGG.

Fig. 9C. DNA profile analysis related in JAK-STAT signaling pathway

Red box indicates up-regulated genes. The represented pathways were obtained from KEGG.

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Fig. 9D. DNA profile analysis related in systemic lupus erythematosus pathway

Red box indicates up-regulated genes. The represented pathways were obtained from KEGG.

Fig. 10. Transcription factor binding analysis

The transcription factor binding site (TFBS) were predicted using 5' upstream (-2000 bp) of transcription start site

of up-regulated genes. The transcription factor binding sequences were obtained by Transfac-database. The list

were ranked by P-value. Matrix and TF column represent transcription factor.

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정민영 외 3인 : 側柏葉이 인간 유래 악성 흑색종 세포의 유전자 발현에 미치는 영향

10. 발현이 증가된 유전자들과 관련 있는 전사인 자 분석

TOF 처리에 의하여 발현이 증가된 유전자들과 관련 있는 전사인자를 분석한 결과 SP1, OCT-1, GC box 가 우위를 차지하였다(Fig. 10).

Fig. 11. Transcription factor binding analysis

The transcription factor binding site (TFBS) were predicted using 5' upstream (-2000 bp) of transcription start site of down-regulated genes. The transcription factor binding sequences were obtained by Transfac-database. The list were ranked by P-value. Matrix and TF column represent transcription factor.

11. 발현이 감소된 유전자들과 관련 있는 전사인 자 분석

TOF 처리에 의하여 발현이 감소된 유전자들과 관련 있는 전사인자를 분석한 결과 SP1, OCT-1, GC box 가 우위를 차지하였다(Fig. 11).

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12. 발현이 증가된 유전자들과 관련된 단백질 네 트워크 분석

상기한 결과들을 통하여 TOF 처리에 의하여 다 양한 유전자들의 발현이 증가 또는 감소하는 것을 알 수 있었다. 이러한 유전자들에 의하여 발현되는

Fig. 12. Protein interactions between up-regulated genes

The network of total protein interactions was measured using cytoscape program. The database was obtained in BOND database. Circles represent proteins that involved in interactions with other proteins. Yellow circles represent the proteins identified in this experiment to be up-regulated by treatment with TOF. Lines mean the protein-protein interactions.

단백질들을 인체 시스템 내에 존재하는 단백질 네 트워크를 이용하여 분석한 결과 THAP1, MAX1, STAM2, SMAD6, CYCS 등의 유전자가 단백질 상호작용 네트워크의 중심에 위치함을 알 수 있었 다(Fig. 12).

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정민영 외 3인 : 側柏葉이 인간 유래 악성 흑색종 세포의 유전자 발현에 미치는 영향

13. 발현이 감소된 유전자들과 관련된 단백질 네 트워크 분석

TOF 처리를 통하여 발현이 감소한 유전자를 대 상으로 각각의 유전자들에 의하여 발현되는 단백 질들을 인체 시스템 내에 존재하는 단백질 네트워

Fig. 13. Protein interactions between down-regulated genes

The network of total protein interactions was measured using cytoscape program. The database was obtained in BOND database. Circles represent proteins that involved in interactions with other proteins. Yellow circles represent the proteins identified in this experiment to be down-regulated by treatment with TOF. Lines mean the protein- protein interactions.

크를 이용하여 분석한 결과 PEX5, PSEN1, NONO, MAP2K7, CREB1 등의 유전자가 단백질 상호작용 네트워크의 중심에 위치함을 알 수 있었 다(Fig. 13).

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Ⅳ. 고 찰

악성 흑색종은 멜라닌 생성능을 가진 멜라닌 세 포로부터 발생하는 악성종양으로 Laennec(1806) 가 처음으로 기술하고 Carswell(1838) 에 의하여 melanoma 라는 명칭이 사용되었다18). 우리나라에 서는 악성 흑색종의 빈도가 매우 낮은 것으로 알 려져 있었으나 최근에는 여러 증례를 모아 임상 및 병리조직학적 고찰을 시행한 보고19-22)들이 있고 최근 들어 급격한 증가를 보이는 보고도 있었다21). 이러한 발생률의 증가에 대한 원인에 대해서 여러 인자가 복합적으로 관여하고 있으리라고 생각되고 노령인구의 증가, 생활수준의 향상과 습관의 변화 에 따라 일광 및 각종 유해물질에 노출될 기회의 증가와 환경공해로 인한 대기의 오존층 두께의 감 소 등으로 추정되고 있으나 현재로서는 그 인과관 계가 명확히 밝혀진 바는 없다. 노년층에 악성흑생 종이 호발하는 이유 중 하나가 자외선 양의 축적 때문이고23) 일광 노출 부위, 특히 안면부에 호발하 고, 남자가 여자보다 많은 것도 일광 노출 때문인 것으로 알려져 있다24).

한의학에서는 이를 癌, 癰疽, 瘡瘍의 범주로 보 고 있으며25), 최근 들어 인간 유래 악성 흑색종인 SK-MEL-2 를 이용한 항암효과를 입증한 실험으로 한 등26)은 SK-MEL-2 를 이용하여 柳白皮의 항암 효과를 실험하였고, 김 등27)은 忍冬藤, 박 등28) 皂角刺를 이용하여 인간 유래 악성 흑색종 세포의 유전자 발현에 미치는 영향을 보고하였다.

側柏葉(Thujae Orientalis Folium) 은 측백나무 과에 속한 상록침엽고목인 측백나무 및 동족 근연 식물의 어린 가지와 잎을 건조시킨 약재로서, 凉血 止血, 止咳化痰, 生肌, 殺蟲, 烏鬚髮 等의 효능이 있어 風冷歷節, 吐血, 衄血, 喀血, 便血, 肺熱咳嗽, 湯火傷, 凍傷, 鬚髮早白 등을 치료 하는데 사용된 다. 성분으로는 精油로서 α-pinene, thujone, caryophyllene, fenchone 등이, flavonoid 로서,

quercetin, myricetin, hinokiflavone 등이, 이 밖 에 tannin, 수지, Vitamin C 등이 함유되어 있다

2-7). 側柏葉은 최근 항산화 효과8)와 세포 억제 작 9)이 밝혀지고, 또한 탈모에 효과적10)이라는 연구 가 발표됨에 따라 피부 및 미용계에 주목을 받고 있다. 그 중 側柏葉의 미백작용에 관한 연구가 활 발하게 진행되고 있는데 flavonoid 성분으로서 quercetin 과 myricetin 에 대한 연구를 살펴보면 11) 은quercetin 이 고농도에서 멜라닌 생성을 억 제한다고 하였고, 송12) 은 myricetin 이 tyrpsinase protein 의 발현을 촉진시켜 멜라닌 생성을 증가 시킨다고 보고하였다.

본 연구에서는 악성 흑색종 세포에 대한 TOF 추출물의 투여의 효과를 분자수준에서 파악하기 위하여 DNA 칩을 이용하여 유전자들의 발현정도 를 측정하였다. 본 연구에서 사용한 세포주는 인간 유래 악성 흑색종 세포주인 SK-MEL-2 세포주 이 다. SK-MEL-2, B16F10 과 같은 세포주들은 종양 에 대한 연구뿐 만 아니라 피부 미백효과를 검증 하는 데에도 사용되고 있다29). 본 연구에서는 TOF 가 악성 흑색종 세포에 어떠한 영향을 미치는지, 그리고 microarray 를 시행할 적절한 농도를 알기 위하여 SK-MEL-2 세포주에 농도별로 TOF 를 투 여하고 세포 증식율의 변화를 살펴본 결과 62.5

㎍/㎖ 이성 농도에서 악성 흑색종 세포의 증식율을 유의하게 감소시켰으며, 250 ㎍/㎖ 부터 1000 ㎍/

㎖ 농도 사이에서는 농도에 관계없이 유사한 수 준의 세포 증식율을 보였다(Fig. 1). 이러한 결과로 부터 TOF 가 100 ㎍/㎖ 의 저농도에서도 악성 흑 색종 세포의 증식을 유의한 수준으로 억제함을 알 았으며, 추후 진행될 실험에서는 250 ㎍/㎖ 농도의 TOF 추출물을 사용하기로 결정하였다.

유전자 발현 정도의 측정은 total RNA 를 분리 하여 cRNA 를 제작한 다음 cRNA 를 chip 에 적용함으로써 이루어진다. 따라서 세포로부터 추출 된 total RNA 의 순도와 함량은 실험 결과에 직

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정민영 외 3인 : 側柏葉이 인간 유래 악성 흑색종 세포의 유전자 발현에 미치는 영향

접적인 영향을 미칠 수 있다30,31). total RNA의 Quality Control 에는 RNA Integrity Number (RIN) 값이 사용되는데, RIN 값은 migration 및 peak pattern, 28s/18s ribosomal RNA 의 비율을 근거로 한 통계적인 수치로서 1~10 의 범위를 가 지며, 진핵생물 total RNA samples 의 quality 지 표로 사용되고 있다. High quality 시료를 요하는 DNA microarray analy셳 1~를 위한 권장 값은 일반적으로 7 이상이다32). 본 연구의 결과에서 TOF 처리 후 세포로부터 얻어낸 total RNA 를 전기영동으로 migration 시킨 결과 28s/18s 의 비 가 control 과 sample 군이 각각 1.3, 1.4 를 기 록 하였고 RIN 값은 각각 9.4 와 9.3 으로 계산 되어 total RNA 가 분석에 적합한 상태임을 알 수 있었다(Fig. 2).

질적 평가를 통과한 total RNA 를 이용하여 형 광이 표지된 cRNA 를 합성한 다음, DNA 칩을 이용하여 유전자발현 정도를 측정하였다. 이 때 대 조군 대 실험군과 같이 서로 비교되어지는 두 시 료에서 얻어지는 cDNA spot은 서로 다른 2 가지 의 형광물질로 표지되어진다. 이렇게 만들어진 탐 침을 이용하여 hybridization 과 스캐닝 과정을 거 쳐 cy3 와 cy5 각각의 형광강도를 측정하였다. 본 연구의 결과를 살펴보면 250 ㎍/㎖ 농도의 TOF 투여에 의하여 대다수의 유전자들의 발현이 크게 변 화하지 않고 있다는 것을 확인할 수 있었다(Fig 3).

DNA 칩으로부터 얻어진 기초 자료는 그대로 분석에 사용 할 수 없다. 신호 강도가 약한 경우 경미한 발현 정도의 차이만으로도 유의성이 있는 것처럼 보일 수 있기 때문이다. 따라서 신호 비와 신호 강도를 정규분포가 되도록 보정하는 작업이 필요하다. 본 연구의 결과에 제시한 바와 같이 비 교적 넓게 펴져 분포하던 spot 이 normalization 과정을 통하여 0 을 기점으로하는 일직선 형태로 변화되어 통계 분석에 적합하게 되었다(Fig. 4).

칩에서 얻어진 raw data 를 표준화 한 후, 본격

적인 분석 작업을 시행하였다. 발현증가의 경우 2 배 이상, 발현감소의 경우 1/2 이하의 발현량을 보 일 때를 증가 감소의 기준으로 삼았다. 분석 결과 약물처리에 의해 발현이 증가된 유전자는 541 종, 발현이 감소한 유전자는 1,079 종으로 총 1,620 종의 유전자들의 발현이 변화되었으며 이는 DNA 칩에 존재하는 유전자를 기준으로 약 7.4 % 정도 에 해당한다. 이들 유전자들이 가지는 발현 정도와 기능을 개별적으로 분석하는 것 보다는 유전자 주 해에 기반을 둔 기능분류를 이용하여 유사한 기능 을 하는 유전자들을 계통적으로 분석하는 것이 유 리하다. TOF 처리에 의하여 발현이 증가한 유전 자들을 분석한 결과 생물학적 과정 항목에서는 primary metabolic process, cellular metabolic process 등과 관련된 유전자가 많았다(Fig. 5A).

분자기능항목별 분석에서는 protein binding, ion binding 등에 관여하는 유전자가 많은 것으로 나 타났다(Fig. 5B). 세포 구성요소 관련 분석에서는 기본적인 cell part 에 존재하는 물질 관련한 유전 자가 가장 많았다(Fig. 5C). TOF 에 의하여 발현 이 감소된 1,079 개의 유전자에 대하여 생물학적 과정, 분자기능 및 세포 구성요소로 나누어 분석한 결과 TOF 에 의하여 발현이 증가한 유전자들과 동일한 분포가 관찰되었다(Fig. 6). 상기한 바와 같 이 발현이 감소되었거나 증가된 유전자들의 기능 을 분류하였을 때, 동일한 기능별 분포가 나타났으 므로, 이들 유전자들 사이의 발현율을 상호 참작하 여 비교우위를 살펴보았다. 그 결과 생물학적 과정 의 경우 nucleic acids, proteins, carbohydrates, and lipids 같은 biopolymer의 대사 작용 기전인 macromolecule metabolic process, 세포의 생존에 필수적인 대사과정인 cellular metabolic process 와 primary metaboic process 등에 관련된 유전 자가 유의한 수준으로 발현 감소했음을 알 수 있 다(Fig. 7A). 분자기능 분포에 대한 유전자를 상호 비교 분석한 결과 nucleic acid binding 과 관련

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된 유전자들의 발현이 유의한 감소를 보였다(Fig.

7B). 이러한 결과는 Fig. 1 에서 제시한 증식율 감소 결과와 일맥상통하며, TOF 가 SK-MEL-2 세 포의 대사에 대하여 전반적인 억압작용을 가지는 것으로 해석된다. 세포성분에서의 분포도에 따른 분석에서 membrane bound organelle 에 관련된 유전자들의 발현 정도가 유의한 감소를 보였는데, 가장 대표적인 유전자가 Tuftelin interacting protein 11 (TFIP11) 이었다(Fig. 7C). TFIP11 은 mRNA 를 이용하여 단백질을 합성할 때 중요한 역할을 하는 물질로 TFIP11 의 감소는 결국 세포 대사의 억제에 관여할 가능성이 매우 높다33). TOF 처리에 의하여 발현이 증가하거나 감소한 유전자들을 유전자 주해에 입각한 기능별로 분석 한 후, 세포 내에서 일어나는 일련의 작용 경로별 로 분석 하였다. 본 연구의 결과에서 발현이 증가 한 유전자들은 bladder cancer pathway, glioma pathway, cytokine-cytokine receptor interaction pathway, colorectal cancer pathway, chronic myeloid leukemia pathway, basal cell carcinoma pathway and apoptosis pathway 관련 있는 것으로 분석되었다(Fig. 8). 이 중에서 항암작용과 관련 있는 5 가지 경로 중에서 basal cell carcinoma pathway 를 제외한 4가지 경로를 억압하는 것으로 나타났다. 특히 apoptosis pathway 를 활성화 시키는 것으로 나타난 것을 고려할 때, TOF 가 항암효과가 있을 가능성은 높 다고 해석되며, Fig. 1 에서 제시한 증식율 억제 작용에도 상기한 항암 작용 관련 기전과 apoptosis 기전이 관여할 가능성이 있다고 생각된다.

본 연구의 주제와 가장 관련이 깊은 apoptosis 관련 기전에 대하여 자세히 살펴 보면, Tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand receptor (TRAIL-R), Interleukin 3 receptor (IL-3R) 와 같은 cell death 에 관여하는 수용체를 만들어내는 유전자인 Tumor necrosis

factor receptor superfamily, member 10c, decoy without an intracellular domain (TNFRSF10C), type I cytokine receptor의 common subunit인 CSF2RB 와 같은 유전자의 발현이 증가하였고, Mitochondria 에서 유리되어 apoptosis 에 관여하 는 중요한 물질인 cytochrome c 를 만들어내는 유전자인 cytochrome c (CytC) 의 발현이 증가하 였다. 이러한 결과는 TOF 가 SK-MEL-2 세포를 사멸 시킨 기전에 Caspase 8 과 Caspase 9 경로 가 관여할 가능성이 있는 것으로 해석된다.

Caspase 8 은 apoptosis-related cysteine peptidase familly 에 속하며, 세포에서 apoptosis 를 일으키 는 중추적 역할을 시행한다34). Caspase 8 은 Tumor necrosis factor receptor (TNFR) 에 의한 apoptosis 의 하위 경로에 위치하여, TNF, Fas ligand (FasL) 등의 death signal 을 받아 직접적 으로 apoptosis 를 유발한다35,36).

Caspase 9 은 mitochondrial death pathway 에 속하는 과정으로 JNK/SAPK signalling pathways 에 의하여 활성화되어 mitochondria 에 서 cytochrome c 를 배출 시키고, apaf-1 (apoptosome) 를 활성화 시키게 된다37,38).

TOF 처리에 의하여 발현이 감소된 1,079 개의 유전자를 대상으로 관련 경로를 분석한 결과 Extracellular matrix (ECM)-receptor interaction pathway, JAK-STAT signaling pathway, and systemic lupus erythematosus pathway 등의 기 전에 관련된 유전자의 발현이 감소한 것으로 나타 났다(Fig. 9).

ECM-receptor interaction pathway 는 성장 (growth), 치유 (wound healing), 섬유화 (fibrosis) 에 필수적인 경로이며, 암종의 침습 (invasion) 과 전이 (metastasis) 상태를 분석하는데 중요한 자료로 사용된다39). 본 연구의 결과에서 TOF 투여에 의하여 ECM-receptor interaction pathway 의 활성이 감소하였다는 것은 TOF 가

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악성 흑색종 세포의 전반적인 대사활동을 저해하 였다는 의미로 해석되며, 악성 흑색종의 침습과 전 이를 방지하는 것으로 항암작용을 나타 낼 수 있 는 가능성으로 해석된다.

JAK-STAT signaling pathway 는 각종 성장 인자 또는 cytokine 의 반응에 관여하는 경로로 Employing Janus kinases (JAKs) 나 Signal Transducers and Activators of Transcription (STATs) 중 하나, 또는 둘 다와 관련된 경로를 말 한다. JAK-STAT signaling pathway 는 세포 외 부의 자극을 핵으로 전달하여 관련 유전자를 활성 화 시키는 작용을 하며, 일반적으로 세포의 증식, 분화, apoptosis 등에 관여한다40). 본 연구 결과에 서 JAK-STAT signaling pathway 가 활성화는 세포의 증식, 분화 또는 apoptosis 의 두 가지 상 반된 경로 모두에 관여할 수 있으므로 본 연구의 결과만으로 어떤 의미를 지니는지 해석하기는 어 렵다. 추후, 명확한 기전 연구를 위한 후속 연구가 진행되어야 한다고 생각한다.

발현이 증가 또는 감소된 유전자와 관련된 세포 내 대사경로 분석 후, TOF 처리에 의해 발현이 변화된 유전자들과 관련 있는 전사인자를 분석하 였다. TOF 처리에 의하여 발현이 증가 또는 감소 된 유전자들과 관련 있는 전사인자를 분석한 결과 두 군 모두에서 공통적으로 SP1, OCT-1, GC box 가 우위를 차지 하였다 (Fig. 10, 11). SP1 과 GC box 는 장기의 발생 초기에 관여하는 전사인자이 41), OCT1 은 POU2F1 (POU domain, class 2, transcription factor 1) 이라고도 불리며, 전반적인 cell cycle 에 관여한다42). 본 연구의 결과에서 전 사인자로서 SP1, OCT-1, GC box 등이 우위를 보 인 것은 발현 증가 또는 감소와 관련 없이 TOF 처리에 의하여 변화된 유전자들은 SP1, OCT-1, GC box 등의 전사 인자를 통해 단백질을 합성하 는 것으로 생각된다.

유전자 발현의 증가 또는 감소는 결국 그 유전

자가 만들어 내는 단백질의 증가 또는 감소로 이 어진다. 따라서, 이러한 유전자들에 의하여 발현되 는 단백질들을 인체 시스템 내에 존재하는 단백질 네트워크를 이용하여 분석해 보면 악성 흑색종 및 피부 미백 효과를 보임에 있어서 TOF 의 주요 target molecule 를 확인할 수 있다. TOF 처리에 의해 발현이 증가된 유전자들에 의하여 발현되는 단백질 상호작용 네트워크를 분석한 결과 THAP1, MAX1, STAM2, SMAD6, CYCS 등의 유전자가 단백질 상호작용 네트워크의 중심에 위치함을 알 수 있었다(Fig. 12).

THAP domain containing apoptosis associated protein 1 (THAP1) 은 apoptosis 관련 단백질이면서 정상 세포에는 존재하지 않고 암세 포에서만 발현되는 PRKC, apoptosis, WT1, regulator (PAWR)/ Prostate apoptosis response-4 (PAR-4) 의 활성에 관여43)하기 때문에 proapoptotic factor 로 분류된다44). MAX dimerization protein 1 (MAX1) 은 MAX-interacting protein 에 속하며 원암유전자 (oncogene) 인 MYC 과 경쟁관계를 가짐으로써 전사억제제 (transcriptional repressor) 로 작용하며, tumor suppesso 로 인식된다45). Signal transducing adaptor molecule (SH3 domain and ITAM motif) 2 (STAM2) 는 JAK kinases 와 관련된 cytokine stimulation 에 관여 한다46). SMAD family member 6 (SMAD6) 는 SMAD family 에 속한 단백질이며, SMAD family 는 trans forming grow factor beta (TGFβ) family 에 속하며, TGFβ family 에 대한 regulator 로 작용한다47). STAM2 와 SMAD6 는 TOF 에 의하여 발현되는 주요 단백질에 속하지 만, 본 연구의 목적과의 연관성은 비교적 작은 것 으로 판단된다. 마지막으로, Cytochrome c, or cyt c (CYCS) 는 작은 heme 단백으로 mitochondria 의 membrane 에 존재하며, 전자전달계의 필수적 인 요소이다48). 또한, 감염이나 DNA 손상에 의하

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여 유발되는 apoptosis 의 매개물질로서도 매우 중 요하게 다루어지고 있다49).

TOF 처리에 의하여 발현이 감소된 유전자들에 의하여 발현되는 단백질들을 인체 시스템 내에 존 재하는 단백질 네트워크를 이용하여 분석한 결과 PEX5, PSEN1, NONO, MAP2K7, CREB1 등이 단백질 상호작용 네트워크의 중심에 위치함을 알 수 있었다(Fig. 13).

Peroxisomal biogenesis factor 5 (PEX5) 는 세 포 내에서 fatty acids 와 다른 많은 물질의 대사 에 관여하는 Peroxisome 내의 물질 생합성에 관 여하는 단백질이다50,51). 따라서, 본 연구의 결과는 TOF 가 peroxisome 의 기능 일부를 저해함으로 써 악성 흑색종 세포의 전반적인 물질 대사를 억 제할 수 있는 것으로 해석된다. Presenilin 1 (Alzheimer disease 3, PSEN1) 은 Alzheimer's disease (AD) 관련 유전자로 알려져 있다52). Presenilin 1 의 변화는 본 연구 목적과 상관성이 떨어지나, 추후 TOF 의 Alzheimer's disease 관련 연구에 기초 자료로서 활용될 수 있다고 생각한다.

Non-POU domain containing, octamer-binding (NONO) 는 RNA-binding protein 을 만드는 유 전자로 신세포암에서 비정상적으로 배열된 NONO 유전자를 발견할 수 있다53). TOF 처리에 의하여 발현 감소한 핵심 단백질로 NONO 가 선정된 것 은 TOF 의 항암작용의 한 기전으로 해석될 수 있 다. Mitogen-activated protein kinase kinase 7 (MAP2K7) 은 MAP kinase kinase family 에 속 하며, 염증 관련 cytokine의 생성 및 전반적 외부 자극을 세포 내로 전달하는 경로이다54). cAMP responsive element binding protein 1 (CREB1) 은 cAMP가 관여하는 신호전달 체계의 하위에 위 치하는 전사인자로서 세포 내 다양한 대사에 관여 한다55). MAP kinase pathway 는 세포 외 자극을 세포 내로 전달할 수 있는 가장 대표적인 경로이 며, CREB1 은 다양한 세포 대사에 관여하는 전사

인자로 이 둘의 선정은 TOF 가 악성 흑색종 세포 의 대사를 전반적으로 억제할 수 있는 것으로 해 석된다.

이상의 결과들을 바탕으로 본 저자는 側柏葉이 악성 흑색종 세포에 의한 암종에 항암제로 활용 될 수 있을 것이라는 가능성을 제기하는 바이며, 側柏葉이 악성 흑색종 세포의 증식율을 억제하는 기전에는 bladder cancer, glioma pathway 등과 같은 경로의 억제, apoptosis 경로의 활성화 및 ECM-receptor interaction pathway 와 같은 외부 자극에 의하여 발생하는 세포 내 신호 전달체계를 억압함으로써 발생되는 전반적인 세포 내 대사억 제가 관여한다고 생각한다.

Ⅴ. 결 론

TOF 가 인간 유래 악성 흑색종 세포의 증식율 및 유전자 발현 양상에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, SK-MEL-2 세포에 側柏葉 추출물을 처리 하고 증식율을 관찰한 다음, total RNA 를 추출한 후 DNA 칩을 이용하여 유전자 발현 양상을 관찰 한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.

1. 62.5 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 유의하게 악성 흑 색종 세포의 증식율을 억제하였다.

2. Total RNA의 정도관리를 위하여 측정한 RIN 값은 각각 9.4와 9.3이었다.

3. 발현이 증가된 유전자는 541 종, 발현이 감소 한 유전자는 1,079 종으로 총 1,620 종의 유 전자들의 발현이 변화되었다.

4. 발현이 증가 또는 감소된 유전자들은 공통적 으로 primary metabolic process, cellular metabolic process, protein binding, ion binding 등의 기전과 관련이 많았으며, cell part 에 존재하는 물질 관련 유전자가 많았다.

수치

Fig. 2B. Peak pattern of RNA
Fig. 4A. Intensity distribution of microarray  Data  achieved  from  raw  image  was  distributed
Fig. 5A. Functional annotation of up-regulated genes in cells treated with TOF
Fig. 6A. Functional annotation of down-regulated genes in cells treated with TOF
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참조

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