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J. Mushrooms 2019 September, 17(3):107-112 http://dx.doi.org/10.14480/JM.2019.17.3.107 Print ISSN 1738-0294, Online ISSN 2288-8853
© The Korean Society of Mushroom Science
*Corresponding author E-mail : [email protected] Tel : +82-31-229-6126 Received July 29, 2019 Revised September 3, 2019 Accepted September 6, 2019
상황버섯 수집균주로 기능성 우수균주 선발 및 적합 곡물배지 개발
김정한* · 백일선 · 신복음 · 권희민 · 이용선
경기도농업기술원 버섯연구소
Selection of good bioactive strains from collected Phellinus sp.
and development of suitable grain media
Jeong-Han Kim*, Il-Sun Baek, Bok-Eum Shin, Hee-Min Gwon, and Yong-Seon Lee
Mushroom Research Institute, Gyeonggi-do Agricultural Research & Extension Services, Gwangju 12805, Korea
ABSTRACT: This study was conducted to develop a healthy functional food material using mycelial extract of Phellinus sp.
Jangsoo and GMPL48007 were selected as suitable strains because of good mycelial growth and high functionality. The highest total polyphenols and reducing power were observed in the Jangsoo strain and the radical scavenging was shown in GMPL48007.
Among grains media, whole-grain wheat had the highest extraction yield from mycelia of selected strains; especially, the GMPL48007 strain showed the highest content of beta-glucan.
KEYWORDS: Beta-glucan, Functionality, Grain, Mycelial growth, Phellinus sp.
서 론
상황버섯은(Phellinus linteus) 분류학적으로 소나무 비 늘버섯과(Hyemenochaetaceae) 진흙버섯속(Phellinus)에 속하는 백색부후균으로 전 세계적으로 약 220여종이 존 재하는 것으로 알려져 있으며, 국내에서는 Phellinus baumii, Phellinus linteus가 주로 재배 및 유통되고 있다 (Son et al., 2018). 상황버섯에 함유되어 있는 다당체 및 단백다당체가 체내 면역세포를 활성화시켜 면역조절 기능 과 항암활성이 있으며(Zhu et al., 2008), 사염화탄소로 유
발된 간 손상에 대한 보호효과를 가진다고 하였다(Jeon et al., 2003). 또한 상황버섯 부탄올 추출물은 대식세포에서 nitric oxide의 생성과 활성산소를 억제시켜 염증생성을 억제하며(Kim et al., 2004), 당뇨 유발쥐를 대상으로 한 동물실험에서는 상황버섯 다당체 분획물 처리의 당뇨 억 제 활성이 보고되었다(Kim et al., 2010).
상황버섯은 다년생으로 국내에서는 원목을 이용한 인공 재배가 이루어지고 있다. 그러나 자실체를 이용하기 위해 서는 장기간이 소요되고 가격도 고가여서 가공식품의 대 중화에는 어려움이 많다. 반면 균사체는 자실체에 비해 생산성이 높고 균일한 품질을 생산할 수 있는 등 산업적 활용도가 높아 기능성 소재로의 활용가능성이 높다. 버섯 류의 균사체에는 항암성분, 면역기능 강화성분 등의 약용 성분이 자실체 보다 더 들어있다는 연구도 보고되고 있다 (Kim et al., 2013). 버섯균사체를 이용하는 기술의 발달 로 항균, 항산화 및 항암활성 물질개발, 상황버섯 균사체 배양쌀, 상황버섯 균사체 배양액에 침지한 발아현미, 상황 버섯 균사체 배양 수삼 등 연구가 많이 진행되고 있다 (Park et al., 2011). 최근에는 유산균을 발효한 현미상황 버섯 균사체의 피부 주름개선 효과도 보고되었다(Kim et al., 2016). 이에 본 연구는 상황버섯 수집균주로부터 기능 성이 있는 우량균주를 선발하고, 균사체 대량생산을 위한
곡물 배지를 선발하기 위하여 수행되었다.
재료 및 방법
우량균주 선발 및 기능성 분석
시험에 사용된 균주는 경기도농업기술원 버섯연구소에 서 보관하고 있는 장수상황 등 8균주를 이용하였다. 우량 균주 선발을 위하여 균사생장길이는 YM배지(dextrose 10 g, peptone 5g, malt extract 3 g, yeast extract 3 g, 증류 수 1L)에 agar를 첨가하여 평판배지를 제조하여 버섯균을 접종하고 20oC에서 배양하면서 14일째 균사생장 길이를 측정하였고, 균체중량은 액체 YM배지에 버섯균을 접종 하고, 14일간 진탕배양한 후 배양액을 여과지로 여과한 후 50oC에서 2일간 건조하여 균체 중량을 측정하였다. 상황 버섯 균주별 기능성 분석은 균사체 배양물을 동결건조하 여 시료로 사용하였다. 총폴리페놀함량은 Gutfinger(1981) 방법에 따라 균사체 배양물 100 uL에 2% Na2CO3 2 mL 를 가하고 vortex한 후 2분간 정치하고 50% Folin- Ciocalteau’s phenol reagent 100 uL를 첨가하고 vortex하 여 30분간 정치한 다음 750 nm에서 흡광도를 측정하여 gallic acid를 이용하여 작성한 표준곡선으로 환산하여 나 타냈다. DPPH 라디컬소거능은 Blois의 방법(1958)에 따 라 0.2 mM DPPH (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA) 용액 (99.8% methanol, anhydrous)을 제조하였다. 시료 4 mL에 0.2 mM DPPH용액 1 mL 첨가한 후 30분간 실온 에서 방치하였다가 분광광도계 (UV-2550, Shimadzu Co., Japan)를 이용해 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 환원 력은 Oyaizu 등(1996)의 방법에 따라 측정하였으며, 1 mM의 인산염 완충용액 (0.2 M, pH 6.6)에 1 mL의 시료 추 출물에 1% potassium ferricyanide용액 1 mL를 가하고 이 혼합물을 50oC, 20분간 반응시킨 후, 10% trichloroacetic acid용액 1 mL을 넣었다. 반응이 끝난 혼합물을 12,000 rpm에서 원심분리하여 얻은 상징액 1 mL와 증류수 1 mL 을 넣고 0.1% 염화철 용액 0.1 mL을 넣고 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 철이온의 킬레이트 효과는 Shimada 등(1992)의 방법에 준하여 실시하였다. 추출물 2.0 mL에 2 mM의 FeCl2 0.05 mL를 혼합한 후 5 mM의 ferrozine 0.2 mL를 첨가하여 반응 시킨 뒤 다시 메탄올 2.75 mL를 가하여 총 용량이 5 mL가 되도록 하고 vortex mixer를 이용하여 진탕하였다. 분광광도계 (UV-2550, Shimadzu Co., Japan)로 흡광도를 562 nm에서 측정하였다.
균사체 배양 및 추출물 제조
상황버섯 선발균주의 균사체 배양을 위한 고체 배지를 선발하고자 자포니카계 벼, 인디카계 쌀, 보리, 통밀 등 4 종류의 곡물을 이용하였다. 각각의 곡물은 수분 침지를 위 해 4oC의 물로 5시간 침지한 뒤 고압살균후 선발 균주를 접종하여 배양하였고, 이때 배양기간과 균사밀도를 조사하
였다. 상황버섯 균사체 추출물 제조를 위해 균사체 배양물 1 kg에 물 10 L를 넣고 100oC에서 8시간 가열 추출하였다.
추출액은 여과지로 여과한 후 감압 농축하되 16 brix가 될 때까지 감압 농축하였다. 농축물은 다시 동결건조 시켜 갈 색의 추출물을 얻은 후 기능성 분석용 시료로 이용하였다.
균사체 추출물의 기능성 성분 분석
베타글루칸 함량은 식약처 건강기능식품공전 시험법 (2012)에 준하여 균사체 추출물을 2 g씩 삼각플라스크에 넣고 증류수 100 mL, amylase(20 U) 약 40~200 mg을 넣 고 0.1N NaOH를 이용하여 pH 6.9로 조정한 후 20oC에 서 2시간동안 진탕하여 효소분해시켰다. 위 용액에 0.1N HCl으로 pH 5.0으로 맞추고 cellulase(50 U)을 넣고 37oC 에서 2시간동안 반응시킨 후, 다시 protease(10 U) 약 15~80 mg을 넣고 0.1N NaOH으로 pH 7.5로 조절한후 37oC에서 2시간동안 진탕분해하였다. 여기에 amylo- glucosidase(70 U)을 약 20~100 mg을 넣고 0.1 N HCl으 로 pH 4.8로 조절한 후 60oC에서 2시간 진탕분해하고, 효 소분해물에 95% 에탄올 400 mL를 가하여 4oC에서 12시 간 침전시키고 원심분리(10,000 rpm, 10분)하여 침전물을 취하였다. 침전물에 80% 에탄올 500 mL를 가하여 4oC에 서 1시간동안 침전시킨 후 다시 원심분리(10,000 rpm, 10 분)하였다. 원심분리된 침전물에 증류수 200 mL를 가한 후 침전물을 혼합하여 균질화 시키고 증류수로 100 mL가 되도록 한 후, 이를 적정농도가 되도록 희석하여 시험용 액으로 사용하고, 농도별 표준용액과 시험용액을 25 mL 시험관에 구분하여 각각 5% 페놀용액 1 mL를 넣었다. 표 준용액은 농도별 glucose 1 mL를 가한다. 시험용액은 시 험용액 0.1 mL와 증류수 0.9 mL, 공시험은 증류수 1 mL 를 가하고 10초간 vortex 하고, 위 시험관에 각각 황산 5 mL를 가하여 혼합해서 20분간 반응시켜 기능성식품공전 법에 준하여 베타글루칸 함량을 분석하였다. 에르고티오 닌 함량은 Lee 등(2009)의 방법에 따라 동결건조된 균사 체 추출물 0.2 g에 10 mL cold ethanolic extraction buffer (10 mM DTT, 100 uM betain, 100 uM MMI in 70%
ethanol)를 첨가하여 vortex한 후 3분 동안 초음파처리하 고, 1% ethanolic solution 2 mL을 첨가하였으며, 1분 동 안 상온에 정치한 후, 4,500 rpm에서 20분 동안 원심분리 를 하였다. 상등액 3 mL을 유리바이얼에 담아 농축하여 HPLC 분석 용액 (50 mM sodium phosphate, 3% acetonitrile) 에 녹여서 분석하 였다. 이동상으로는 50 mM sodium phosphate에 3% acetonitrile 를 첨가한후 0.1% triethylamine 를 이용하여 pH를 7.3으로 조절하였으며, 유속은 1 ml/min, 흡광도는 254 nm를 이용하였고, column은 C18 colume (4.6 × 250 mm, 5µm)를 사용하였다.
통계 분석
모든 측정은 3회 반복하여 행하여졌으며, 그 결과의 통
계처리는 SAS(Statisical Analysis System)을 이용하여 p<0.05 수준에서 Duncan의 다중범위검정(Duncan’s-multiple range test)을 통하여 평균값들에 대한 유의성을 검정하였다.
결과 및 고찰
상황버섯 수집 8균주에 대하여 균사생장도 우수하면서 기능성도 우수한 균주를 선발하기 위하여 첫 번째로 균사생 장길이와 균체중량을 측정하였다(Table 1). GMPL48007균 주의 균사생장길이 6.3 mm로 생육이 가장 빨랐고(Fig.
1.), GMPL48013, 48011, 장수, 48022가 4.6~5.4 mm, GMPL48005, 48006, 480104이 3.5~3.9 mm순으로 나타 났다. 액체배양에서의 균체중량은 GMPL48013, 48014, 장수상황이 660~694 mg으로 가장 많았고, GMPL48007, 48011이 531~567 mg, GMPL48005, 48006이 395~408 mg, 48022가 219~267 mg 순으로 나타났다. 본 시험에서 수집균주별 균사생장길이와 균체중량은 일치하지 않았는 데, 이는 고체 배양은 정치상태로 배양된 반면, 액체배양 은 진탕 배양에 따른 충격과 산소 공급 등의 환경 차이에 의한 것으로 추측된다.
일반적으로 천연물에서 기능성을 신속하게 검증하기 위 한 방법으로 총폴리페놀함량과 항산화활성 분석법이 많이 이용되고 있다(Kim et al., 2012). 상황버섯 수집균주별 항산화활성 및 총폴리페놀 함량은 Table 2와 같다. 총폴 리페놀 함량은 장수상황이 20.5 mg/g으로 가장 많이 함유 되어 있고 GMPL48011, 48005가 각각 11.0 mg/g, 10.4 mg/g 함유되어 있었고, 이외의 균주들은 10 mg이하로 상 대적으로 낮았다. 항산화활성중 DPPH 라디컬 소거능은 GMPL48007 균주가 89.4%로 가장 우수하였고, 48011균 주가 70.1% 이외의 균주는 50% 이하로 나타났다. 환원력 은 장수상황이 1.307로 가장 우수하고, GMPL48006, 48007, 48011, 48013이 1.0 이상으로 높았다. Fe2+이온 킬
레이팅 능력은 GMPL48005균주가 시험균주중 34.6%로 가장 높았고, 48006, 48007 균주가 각각 26.7%, 24.6%순 으로 나타났다. 이상의 결과 균사생장도 상대적으로 좋고 기 능성이 우수한 균주로 장수상황(환원력 우수), GMPL48007 (라디컬 소거능 우수)을 기능성 소재개발을 위한 우량 균 주로 선발하였다.
선발균주의 균사체 배양용 적합한 곡물배지를 선발하기 위하여 4가지 종류의 곡물별 베타글루칸 함량을 분석한 결과는 Table 3과 같다. 베타글루칸 함량은 통밀이 21.4 mg/g, 인디카계 쌀이 20.3 mg/g, 보리 19.5 mg/g, 자포니 카계 벼(왕겨 포함)가 9.2 mg/g 각각 함유되어 있었다.
Lee와 Lee(2009)의 연구에 따르면 곡물별 베타글루칸 함 량을 분석한 결과 현미, 보리, 밀, 옥수수 및 대두가 각각 1.30%, 5.11%, 0.75%, 1.12% 및 1.06%라고 하였는데, 우리의 연구결과를 %농도로 환산하면 밀 2.14%, 보리 1.95%, 인디카계 쌀 2.0%, 자포니카계 벼 0.92%로 유사
Fig. 1. Morphology of mycelial growth of Phellinus sp. strains on YM media
Table 1. Mycelial growth and of Phellinus sp. strains Strain Colony diameter
(mm/14 days)
Dried weight (mg/14 days)
Jangsu 4.7b 660a
GMPL48005 3.9c 409c
GMPL48006 3.9c 395c
GMPL48007 6.3a 567b
GMPL48011 5.3b 531b
GMPL48013 5.4b 694a
GMPL48014 3.5cd 663a
GMPL48022 4.6b 219d
a-d Different superscript letters within the same column indicate sig- nificant differences among treatments by Duncan‘s multiple range test (P < 0.05)
한 범위로 측정된 것으로 나타났다.
곡물배지 4종에 대한 배양기간 및 균사밀도를 조사한 결과(Table 4, Fig. 1), 장수상황 GMPL48007 두 균주가 인디카계 쌀, 보리, 통밀로 배양시에 균사생장 완료일이 30일로 짧았으며, 자포니카계 벼에서는 다소 늦었다. 균사 밀도는 두 균주 모두 인디카계 쌀과 통밀에서 높은 것으 로 나타났다.
곡물재료별 상황버섯 균사체 추출물의 수율 및 기능성 분 함량은 Table 5와 같다. 장수상황은 보리와 통밀에서 추출수율이 각각 6.5, 6.2%로 높게 나타났으나, 베타글루 칸 함량은 곡물배지종류에 따른 차이가 없었다. 버섯류에 함 유되어 있는 강력한 항산화성분인 에르고티오네인은 보리와
통밀에서만 각각 9.4, 10 ug/g 검출되었다. GMPL48007균주 는 통밀 배지에서 추출수율이 8.2%로 가장 높았고, 인디 카계 쌀과 자포니카계 벼 배지는 상대적으로 수율이 낮았 는데, 이는 곡물배지 원재료와 균사배양 과정중 생성되는 수용성물질 함량 등의 차이에 의한 것으로 추측된다. 베 타글루칸 함량은 통밀 배지에서 140 mg/g으로 가장 높고, 보리 배지가 85.5 mg/g, 자포니카계 벼 배지가 41.7 mg/g, 인디카계 쌀이 18.3 mg/g 순으로 기질에 따라 베타글루칸 함량도 차이를 보였는데, 향후 이에 대한 추가 연구가 필 요할 것으로 판단된다.
이상의 결과, 상황버섯 우량 균주용 적합한 곡물배지는 통밀배지로서 균사체 추출수율이 높고, 특히 GMPL48007 Table 2. Antioxidant activities and total phenolic contents of collected Phellinus sp. strains
Strain Total Polyphenolics (mg/g)
Antioxidant activity DPPH radical scavenging ability
(%)
Reducing power (Abs700nm)
Fe2+ chelating ability?(%)
Jangsoo 20.5 a 44.6 cd 1.307 a 10.9 d
GMPL48004 9.5 c 30.1 g 0.930 e 12.9 cd
GMPL48005 10.4 b 46.2 c 0.824 f 34.6 a
GMPL48006 8.7 d 42.9 de 1.001 d 26.7 b
GMPL48007 8.8 d 89.4 a 1.113 c 24.6 b
GMPL48011 11.0 b 70.1 b 1.011 d 14.8 c
GMPL48013 9.3 c 41.7 e 1.159 b 12.5 cd
GMPL48014 7.4 e 27.7 h 0.971 d 15.3 c
a-d Different superscript letters within the same column indicate significant differences among treatments by Duncan‘s multiple range test (P<0.05)
Table 3. Beta-glucan contents of four species of grains (Unit : mg/g)
Rice (Indica)
Unhulled rice grain
(Japonica) Whole-grain wheat Barley grain
20.3 9.2 21.4 19.5
Table 4. Incubation periods and mycelial density of selected Phellinus sp. strains on the different grain media
Strain
Rice (Indica)
Unhulled rice grain
(Japonica) Whole-grain wheat Barley grain Spawn run
(days)
Mycelial densitya
Spawn run (days)
Mycelial density
Spawn run (days)
Mycelial density
Spawn run (days)
Mycelial density
Jangsoo 30 +++ 35 ++ 30 +++ 30 ++
GMPL48007 30 +++ 45 + 30 +++ 30 ++
a +++ : compact, ++ medium, + weak
균주의 베타글루칸 함량은 140.3 mg/g으로 처리구 가운데 가장 높은 함량을 보였다.
적 요
상황버섯 균사체 추출물을 이용한 건강 기능성 소재로 개발하기 위하여 수행한 연구는 다음과 같다. 수집균주 8 종 가운데 균사생장과 항산화활성이 우수한 장수상황과 GMPL48007을 선발하였다. 장수상황은 폴리페놀 함량 (20.5mg/g)과 환원력이 1.307로 우수하였고, GMPL48007 균주는 DPPH 라디컬 소거능이 89.4%로 우수하였다. 곡 물재료별 추출수율은 통밀배지에서 장수와 GMPL이 각각 6.2%, 8.2%로 우수하였고, 베타글루칸 함량은 GMPL48007 균주를 통밀배지에서 배양시에 가장 높은 함량을 보였다.
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Kim HS, You JH, Jo YC, Lee YJ, Park IB, Park JW, Jung Fig. 2. Conditions of mycelial growth of selected Phellinus sp. in bottle on the different grain media. Left: Jangsoo, Right:
GMLE48007. A: rice(Indica), B: unhulled rice grain, C : whole-grain wheat, D: barley grain.
Table 5. Functional component and yield of extraction from mycelia of Phellinus sp. on different grain media
Strain Cereal media Extraction yield
(%)
Contents of β-glucan (mg/g)
Ergothioneine (ug/g)
Jangsoo
Rice(Indica) 3.7b 66.9ns nd
Unhulled rice grain(Japonica) 3.5b 67.3 nd
Whole-grain wheat 6.2a 62.4 10.0
Barley grain 6.5a 79.5 9.4
GMPL 48007
Rice(Indica) 2.5c 18.3d nd
Unhulled rice grain(Japonica) 3.7bc 41.7c nd
Whole-grain wheat 8.2a 140.3a nd
Barley grain 6.2b 85.5b 65.1
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