Quantitative Analysis of the Three Marker Compounds in Sanguisorbae Radix by Processing Method

46(4) : 342∼ 351 (2015)

342

포제에 따른 지유의 지표성분 함량분석

서창섭¹·김정훈^1,2·신현규¹·김병수^3*

1한국한의학연구원 K-herb연구단, ²부산대학교 한의학전문대학원, ³대전대학교 한의과대학

Quantitative Analysis of the Three Marker Compounds in Sanguisorbae Radix by Processing Method

Chang-Seob Seo¹, Jung-Hoon Kim^1,2, Hyeun-Kyoo Shin¹, and Byoung-Soo Kim³*

1K-herb Research Group, Korea Institute of Oriental Medicine, 1672 Yuseong-daero, Yuseong-gu, Daejeon, 34054, Korea

2Division of Pharmacology, School of Korean Medicine, Pusan National University. Yangsan, Gyeongnam 50612, Korea

3Department of Physiology, College of Korean Medicine, Daejeon University, 62 Daehak-ro, Dong-gu, Daejeon, 34520, Korea

Abstract – In this study, we performed quantitative determination of the three marker compounds such as gallic acid, ellagic acid, and quercetin in the 70% ethanol extracts of non-processed Sanguisorbae Radix and processed Sanguisorbae Radix using a high-performance liquid chromatography coupled with photodiode array detector. The analytical column for separation of the three compounds was used a Gemini C₁₈ column (5µm, 4.6×250 mm) by the gradient elution with distilled water and ace- tonitrile containing 1.0% (v/v) acetic acid as mobile phase. The flow rate and injection volume were 1.0µL/min and 10 µL.

The concentrations of gallic acid, ellagic acid, and quercetin in non-processed Sanguisorbae Radix were 0.25, 0.26, and 0.007%, respectively, while the concentrations of gallic acid, ellagic acid, and quercetin in non-processed Sanguisorbae Radix 0.14-0.55, 0.27-2.03, and 0.001-0.007%, respectively. Among the three components, the amount of the ellagic acid was increased after processing in Sanguisorbae Radix.

Key words – Sanguisorbae Radix, Processing Method, Gallic acid, Ellagic acid, Quercetin

포제( 製)는 한의학에서 사용되는 전통 생약을 불을 비 롯하여 술, 식초 또는 소금물 등과 같은 보조제를 이용하여 치료 효능을 높이거나 독성과 부작용을 낮추거나 없애는 여 러 가지 가공방법으로 수치(修治) 또는 법제(法製) 등으로 불려왔다.^1,2) 지유(地楡)는 주로 토혈(吐血), 비출혈(鼻出血) 및 혈리(血痢) 등을 치료하기 위해 사용되어왔으며, 이러한 지혈 효능을 높이기 위해 가공 및 포제되어 사용되었다.^3,4) 지유(Sanguisorbae Radix)는 장미과(Rosaceae)에 속하는 오 이풀(Sanguisorba officinalis L.) 및 동속식물의 뿌리로써, 예 로부터 맛은 쓰고(苦) 시고(酸) 떫으며(澁) 性은 微寒하며 양 혈지혈(凉血止血)과 해독렴창(解毒斂瘡)의 효능이 있다고 알 려져 왔다.⁵⁾지유의 주요 성분으로는 sanguine H1~H11, gambiriin A-1, gambiriin B-3, procyanidin B-3 및 3- galloylprocyanidin B-3 등의 tannin류와 ursolic acid, benthamic acid, euscaphic acid 및 ziyuglycoside I 등의

triterpenoid류 및 sanguisorbic acid dilactone과 같은 phenolic acid등이 보고되었으며, 그 중에서도 tannin류가 주 를 이루고 있다.^5,6) 지유의 생리활성은 신경보호,^7,8) 면역증 강,⁹⁾ 항암,¹⁰⁾ 지혈,¹¹⁾ 항산화 및 면역조절¹²⁾ 효과 등이 보고 되었다. 그러나 지유는 초탄(炒炭) 후에 지혈(止血), 수렴(收 斂) 및 지리(止痢) 등의 효능이 증가된다고 알려져 있다.^3,13) 지유의 수치에 대한 연구는 박 등¹⁴⁾과 강 등^15,16)이 볶은 지 유의 에테르 분획으로부터 원생약에서는 존재하지 않는 aegiceradienol(28-noroleana-12, 17-dien-3β-ol), tomentosolic acid, pomolic acid 및 acetylpomolic acid의 분리 및 구조 동 정하여 보고하였다. 본 연구자들은 전보^17,18)의 결명자와 두 충의 포제에 따른 주요 성분의 함량 변화에 이어 지유의 주 요 성분인 gallic acid, ellagic acid 및 quercetin 3종에 대하 여 시간과 온도에 따라 청초법(淸炒法)으로 포제 한 후 high- performance liquid chromatography(HPLC)를 이용하여 이 들 성분의 포제 전·후에 대한 함량분석을 비롯하여 확인시 험, 건조감량, 회분, 산불용성회분, 묽은에탄올엑스함량 및 벤조피렌시험 등의 이화학적 데이터를 비교하여 지유의 최

*교신저자(E-mail):[email protected] (Tel): +82-42-280-2616

적 포제에 대한 기초자료를 제공하고자 하였다.

재료 및 방법

실험재료 − 본 실험에 사용된 지유는 광명당제약(Ulsan, Korea)에서 규격품을 구입하여 본초학 전공인 동국대학교 한의과대학 이제현 교수(Gyeongju, Korea)와 대전대학교 한 의과대학 서영배 교수(Daejeon, Korea)로부터 기원 동정 후 실험에 사용하였다. 지유 표본(2012-RISSR)은 한국한의학 연구원 K-herb연구단에 보관하였다.

시약 및 기기 − HPLC 분석에 사용된 gallic acid(순도 97.5%이상)와 ellagic acid(순도 96.0%이상) 표준품은 Sigma- Aldrich Co. (St Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, quercetin(순도 98.0%이상)은 ChromaDex(Irvine, CA, USA) 에서 구입하였다. 정성 및 정량분석을 위한 메탄올, 아세토 나이트릴 및 물은 J.T. Baker(Phillipsburg, NJ, USA)에서 구 입하였으며, 초산은 특급시약으로 Junsei(Tokyo, Japan)에서 구입하였다. 그 외의 시약은 HPLC 또는 특급시약을 구입하 여 사용하였다. 3종의 정량분석은 CBM-20A communications bus module, LC-20AT pump, DGU-20A₃ online degasser, CTO-20A column oven, SIL-20AC autosampler 및 SPD- M20A photodiode array(PDA) detector로 구성된 Shimadzu Prominence LC-20A series(Kyoto, Japan)를 사용하였다. 데 이터 수집과 처리는 LCsolution software(Version 1.24, SP1, Kyoto, Japan)를 사용하였다. 회화로는 Thermolyne 48000 furnace(Barnstead, Dubuque, IA, USA), 건조기는 OF- 22G(JeioTech, Daejeon, Korea), 초음파추출기는 Branson 8510E-DTH(Branson Ultrasonic Co., Danbury, CT, USA) 및 포제는 CBR-101A(GeneCafe, Ansan, Korea)를 사용하 였다.

지유 포제 − 구입된 지유 규격품을 CBR-101A를 이용하 여 온도(160, 180, 200, 220 및 240^oC)와 시간(5, 10, 15 및 20분)별로 포제 하였다. 포제 전 해당 온도에서 예비가열을 한 후 설정 온도에 도달했을 때 지유를 넣고 조건대로 조작 을 하여 포제하였다. 지유의 온도 및 시간에 따른 포제의 조 건은 다음과 같다. 포제하지 않은 원 생약(Sanguisorbae Radix; SR1), 160^oC-5분(SR2), 160^oC-10분(SR3), 160^oC-15 분(SR4), 160^oC-15분(SR5), 180^oC-5분(SR6), 180^oC-10분 (SR7), 180^oC-15분(SR8), 180^oC-15분(SR9), 200^oC-5분(SR10), 200^oC-10분(SR11), 200^oC-15분(SR12), 200^oC-20분(SR13), 220^oC-5분(SR14), 220^oC-10분(SR15), 220^oC-15분(SR16), 220^oC-15분(SR17), 240^oC-5분(SR18), 240^oC-10분(SR19), 240^oC-15분(SR20) 및 240^oC-20분(SR21). 시간과 온도에 따 른 포제가 완료되면 실온에서 냉각시킨 후 polyethylene:

polypropylene(1:1) bag으로 포장하여 냉장 보관 후 실험에 사용하였다.

관능검사 − 청초법(淸炒法)으로 포제를 한 지유에 대하여 적절한 온도와 시간을 설정하기 위하여 위와 같이 포제 한 생약을 본초학 교재¹⁹⁾와 대한약전외한약(생약)규격집²⁰⁾을 바 탕으로 대전대학교 한의과대학 본초학교실 서영배 교수와 동국대학교 한의과대학 본초학교실 이제현 교수 2인의 전 문가에 의해 관능검사를 실시하였다.

확인시험 − 대한약전외한약(생약)규격집²¹⁾의 확인시험법 에 따라 이 약의 가루 0.5 g에 물 10 mL를 넣어 끓여서 여 과한 여액에 염화제이철시액을 넣었을 때 어두운 자색을 나 타내는지 확인하였다. 또한 이 약 가루 0.5 g에 물 10 mL를 넣어 수욕상에서 잠시 끓인 후 냉각시킨 다음 세게 흔들어 섞을 때 지속성의 거품이 생기는지 확인하였다.

묽은에탄올엑스함량 − 대한약전 생약시험법²²⁾에 따라 분 석용 검체 약 2.3 g을 정밀하게 달아 삼각 플라스크에 넣고 묽은에탄올 70 mL를 넣어 때때로 흔들어 섞어 5 시간 침출 한 후 다시 16~20시간 방치한 다음 여과하였다. 플라스크 및 잔류물은 여액이 100 mL로 될 때까지 묽은 에탄올로 씻 어 주었으며, 여액 50 mL를 수욕에서 증발건고하고 105^oC 에서 4시간 건조하여 데시케이터(실리카겔)에서 식힌 다음 그 질량을 정밀하게 달고 2를 곱하여 묽은에탄올엑스의 양 으로 하였다. 건조감량에서 얻은 값에서 건조물로 환산한 검체량에 대한 엑스함량(%)을 산출하여 묽은에탄올엑스함 량을 계산하였다.

건조감량 − 대한약전의 생약시험법²²⁾에 따라 칭량병을 미 리 105^oC에서 1시간 건조한 후 그 무게를 정밀하게 달았다.

그 후 무게를 단 칭량병에 시료 약 2 g을 넣어 그 층의 높 이가 5 mm 이하가 되도록 편 다음 무게를 정밀하게 측정 하여 105^oC에서 5시간 건조하여 데시케이터(실리카겔)에서 식힌 후 칭량병을 꺼내어 그 무게를 정밀하게 달아 건조감 량(%)을 계산하였다.

회분 − 대한약전의 생약시험법²²⁾에 따라 도가니를 미리 550^oC에서 1시간 강열하여 데시게이터에서 방냉 한 후 그 무게를 달았다. 무게를 단 도가니에 시료 약 2 g을 넣어 무 게를 정밀하게 측정하여 550^oC에서 5시간 동안 강열하여 탄화물이 남지 않을 때까지 회화하였다. 방냉 한 후 질량을 정밀하게 달고 다시 항량이 될 때까지 회화하고 방냉 한 다 음 그 질량을 정밀하게 달아 회분함량(%)을 계산하였다.

산불용성회분 − 대한약전의 생약시험법²²⁾에 따라 회분에 묽은 염산 25 mL을 가하여 5분간 약한 열에 끓여 불용물을 정량용 여과지로 여과한 후 잔류물을 열탕으로 잘 씻어 여 과지와 함께 건조하였다. 회분과 같은 방법으로 550^oC에서 5시간 동안 강열하여 데시케이터(실리카겔)에서 방냉 한 후 그 무게를 정밀하게 달아 산불용성회분량(%)으로 하였다.

벤조피렌시험 − 벤조피렌은 불이나 숯불 등으로 가열 시 불완전연소 과정에서 생성되는 환경호르몬의 일종으로 인체 에 축적될 경우 각종 암을 유발하는 것으로 알려져 있다.²³⁾

따라서 지유의 포제시 온도와 시간을 고려하여 선택된 시 료 4종(220^oC-15분, 220^oC-20분, 240^oC-15분 및 240^oC-20 분)과 생지유에 대하여 식품의약품안전처 고시²⁴⁾에 따라 벤 조피렌시험을 실시하였다. 각각의 시료 약 5.0 g을 정밀하 게 달아 물 100 mL를 넣어 90분간 초음파 추출하였다. 여기 에 헥산 약 100 mL 및 내부표준액 1 mL을 넣어 Homogenizer 로 5분간 균질 하게 섞은 다음 30분간 초음파 추출하였다.

헥산층을 분액깔대기에 옮기고 다시 물층에 헥산 약 50 mL 씩을 넣고 2회 반복하여 진탕 추출한 후 헥산층을 취하여 분액깔대기에 합하였다. 합한 헥산층에 물 약 50 mL를 넣 어 세척하고, 이 헥산층을 무수황산나트륨을 넣은 여과지를 사용하여 탈수 여과한 다음 45^oC의 수욕상에서 감압하여 헥 산 약 2 mL가 될 때까지 농축하였다. 플로리실카트리지는 미리 디클로로메탄 10 mL 및 헥산 20 mL를 순서대로 초당 2~3 방울의 속도로 유출시켜 활성화시킨 후 사용하였다. 활 성화된 카트리지에 위의 추출용액을 넣어 헥산:디클로로메 탄혼합액(3 : 1) 20 mL를 초당 2~3방울의 속도로 용출시켰 다. 이 용출된 액을 35^oC이하의 수욕상에서 질소가스 하에 날려 보낸 후 잔류물을 아세토니트릴 1 mL에 녹인 다음 공 경 0.45 µm 이하의 멤브레인필터(Woongki Science, Seoul, Korea)로 여과하여 검액으로 하였다. 따로 벤조피렌표준품 및 3-메틸콜란트렌표준품 적당량을 정밀하게 달아 각각 아 세토니트릴에 녹여 mL당 1 µg을 함유하는 표준원액 및 내

부표준원액을 만들었다. 이 표준원액과 내부표준원액 적당 량을 정확하게 취하여 아세토니트릴로 mL 당 3, 5, 10, 20 및 40 ng의 벤조피렌과 각각 50 ng의 내부표준물질이 함유 되도록 희석하여 표준액으로 하였다. 검액 및 표준액 10 µL 씩을 가지고 Table I의 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하였으며, 각 표준액에서 얻은 내부표준물질 피크 면적에 대한 벤조피렌의 피크면적비[A_S/A_IS]를 Y축으로 하 고 벤조피렌의 농도를 X축으로 하여 만든 검량곡선을 작성 하고, 검액의 내부표준물질 피크면적에 대한 벤조피렌의 피 크면적비[A_SAM/A_SAMIS]를 Y축에 대입하여 벤조피렌의 농도 를 구하였다.

A_S: 검량곡선표준용액의 표준물질 피크면적 A_IS: 검량곡선표준용액의 내부표준물질 피크면적 A_SAM: 시험용액의 벤조피렌 피크면적

A_SAMIS: 시험용액의 내부표준물질 피크면적

내부표준액으로는 3-메틸콜란트렌 표준품을 정밀하게 달 아 아세토니트릴에 녹여 1 mL 중 50 ng을 함유하는 용액으 로 하였다.

정량

1) HPLC 분석조건

지유의 주요성분인 gallic acid, ellagic acid 및 quercetin (Fig. 1)에 대하여 함량 분석을 위해 Table II의 조건에 따라 분석하였다.

2) 표준액 및 검액 조제

3종의 표준품(gallic acid, ellagic acid 및 quercetin)에 대 하여 무게를 정확하게 측정한 후 메탄올로 녹여 모두 1.0 mg/mL의 농도로 표준용액을 제조한 후 4^oC에 보관하면서 사용 전에 희석하여 사용하였다. 검액은 생지유 및 포제된 지유 분말 약 500 mg을 정밀하게 달아 70% 에탄올을 넣어 50 mL로 한 후 60분간 초음파추출 하였다. 추출액은 0.2 µm syringe filter(SmartPor, Woongki Science, Seoul, Korea)로 여과하여 검액으로 사용하였다.

Table I. HPLC condition for benzo(a)pyrene analysis

Item Conditions

Detector (nm)

Fluorescence detector

(Excitation wavelength : 294 nm, Emission wavelength : 404 nm) Column Supelcosil LC-PAH (5 μm, 4.6 ×

250 mm) Column oven (^oC) 37 Flow rate (mL/min) 1.0 Injection volume (μL) 10.0

Mobile phase Acetonitrile : Water (8 : 2)

Fig. 1. Chemical structures of the three marker compounds of Sanguisorbae Radix.

결과 및 고찰

지유 포제 − 지유의 적절한 포제 방법을 설정하고자 시중 유통품인 생지유를 구입하여 시간(5, 10, 15 및 20분)과 온 도(160, 180, 200, 220 및 240^oC)에 따라 포제를 실시하였 다(Fig. 2).

관능검사 − 지유는 지혈(止血), 수렴(收斂) 및 지리(止痢) 의 효능을 증강하기 위해 초탄(炒炭)하는데 표면과 내부의 색상이 검게 변하면서 숯처럼 변하지 않는 정도를 기준으 로 하였다. 본 실험에서 포제품의 관능검사 결과 180^oC-20 분, 200^oC-10분, 200^oC-15분 및 220^oC-5분 동안 가열하는 것을 지유의 초법(炒法)에 적절한 포제 시간과 온도로 판단 하였다.

Table II. HPLC conditions for quantitative analysis of the three marker compounds in Sanguisorbae Radix

Item Conditions

Detector (nm) 270, 370

Column Gemini C₁₈ (5 μm, 4.6 × 250 mm) Column oven (^oC) 40

Flow rate (mL/min) 1.0 Injection volume (μL) 10.0

Mobile phase A : 1.0% acetic acid in water B : 1.0% acetic acid in acetonitrile 0–5 min, 10% B; 5–30 min, 10–50%

B; 30–35 min, 50% B; 35–40 min, 50–10% B; 40–50 min, 100% B

Fig. 2. A macroscopic picture of non-processed Sanguisorbae Radix (A) and the processed Sanguisorbae Radix produced by ‘plain stir-baking’ with various times and temperatures (B).

묽은에탄올엑스함량 − 대한약전외한약(생약)규격집에는 생 지유와 지유초의 묽은에탄올엑스함량 기준은 모두 18.0%

이상으로 규정하고 있다.²¹⁾ 따라서 대한약전 생약시험법에 따른 생지유와 지유초의 묽은에탄올엑스함량 측정 결과 평 균 및 표준편차는 28.76±3.90%(n=3)이었고 각각의 시료에 따라 26.24~36.01%로 나타났다. 이는 대한약전외한약(생약) 규격집 기준치인 18.0% 이상에 모두 적합하였으며, 지유와 지유초 모두 묽은에탄올엑스함량을 18.0% 이상으로 규정하 는 것은 타당하다고 사료된다(Table III).

건조감량 − 대한약전외한약(생약)규격집에 생지유와 지유 초의 건조감량 기준은 10.0% 이하와 5.0% 이하로 각각 규 정되어 있다.²¹⁾ 따라서 대한약전 생약시험법에 따른 생지유 와 지유초의 건조감량 측정 결과 평균 및 표준편차는 6.41±0.01%(n=3)와 1.87±1.06%(n=3)로 두 시료 모두 대한 약전외한약(생약)규격집 기준치인 10.0% 이하와 5.0% 이하

로 적합하였다. 이러한 결과를 바탕으로 지유와 지유초의 건조감량을 10.0% 이하와 5.0% 이하로 규정하는 것은 타 당하다고 사료된다(Table III).

회분 − 대한약전외한약(생약)규격집에는 생지유와 지유초 의 회분 기준은 모두 12.0% 이하로 규정하고 있다.²¹⁾생지 유와 지유초의 대한약전 시험법에 따른 회분 측정 결과 평 균 및 표준편차는 9.80±1.24%(n=3)이었고 각각의 시료에 대하여 7.25~11.58%로 나타났다. 이는 대한약전외한약(생 약)규격집 기준치 12.0%이하에 모두 적합하였으며, 지유와 지유초의 회분 기준을 12.0% 이하로 규정하는 것은 타당하 다고 사료된다(Table IV).

산불용성회분 − 대한약전외한약(생약)규격집에는 생지유 와 지유초의 산불용성회분 기준은 모두 1.5% 이하로 규정 하고 있다.²¹⁾ 생지유와 지유초의 대한약전 시험법에 따른 산 불용성회분 측정 결과 평균 및 표준편차는 1.07±0.26%(n=3) Table III. The results of extract content and loss on drying for the Sanguisorbae Radix and its processed products (n=3)

Sample Extract content (%) Loss on drying (%)

Mean SD×10⁻¹ RSD×10⁻¹ (%) Mean SD RSD (%)

KHP^a ≥18.0% ≤10.0% (SR)

≤5.0% (Processed SR)

SR1 27.87 0.01 0.04 6.41 0.01 0.14

SR2 35.98 0.01 0.03 3.36 0.02 0.47

SR3 26.82 0.05 0.18 2.77 0.07 2.54

SR4 26.47 0.11 0.13 1.50 0.03 1.90

SR5 26.42 0.02 0.07 1.26 0.03 2.73

SR6 27.43 0.01 0.04 4.92 0.11 2.32

SR7 26.53 0.06 0.23 1.72 0.01 0.79

SR8 26.30 0.05 0.18 0.82 0.01 1.45

SR9 26.44 0.04 0.16 1.36 0.01 0.81

SR10 26.84 0.01 0.04 2.80 0.07 2.39

SR11 26.43 0.06 0.21 1.31 0.03 2.65

SR12 26.39 0.05 0.20 1.16 0.03 2.42

SR13 26.57 0.01 0.05 1.83 0.03 1.41

SR14 36.01 0.02 0.07 3.43 0.06 1.86

SR15 35.14 0.07 0.19 1.03 0.01 1.39

SR16 35.29 0.02 0.07 1.45 0.04 2.53

SR17 35.23 0.08 0.21 1.31 0.03 2.13

SR18 26.65 0.05 0.19 2.15 0.02 0.80

SR19 26.24 0.01 0.05 0.62 0.02 2.85

SR20 26.45 0.02 0.07 1.40 0.03 1.98

SR21 26.37 0.03 0.12 1.11 0.03 2.70

KHP: The Korean herbal pharmacopoeia.

SR1, Non-processed; SR2, 160

C-5 min; SR3, 160

C-10 min; SR4, 160

C-15 min; SR5, 160

C-20 min; SR6, 180

C-5 min;

SR7, 180

C-10 min; SR8, 180

C-15 min; SR9, 180

C-20 min; SR10, 200

C-5 min; SR11, 200

C-10 min; SR12, 200

C-15 min;

SR13, 200

C-20 min; SR14, 220

C-5 min; SR15, 220

C-10 min; SR16, 220

C-15 min; SR17, 220

C-20 min; SR18, 240

C-5

min; SR19, 240

C-10 min; SR20, 240

C-15 min; SR21, 240

C-20min

이었고 각각의 시료에 대하여 0.62~1.47%로 나타났다. 이 는 대한약전외한약(생약)규격집 기준치 1.5%이하에 모두 적 합하였으며, 지유와 지유초의 회분 기준을 1.5% 이하로 규 정하는 것은 타당하다고 사료된다(Table IV).

벤조피렌 − 최근 한약재를 초(炒), 탄(炭)과 같은 전통적 포제법에 의하여 벤조피렌과 같은 유해물질의 생성 가능성 이 제기되고 있다.²³⁾ 따라서 지유를 220^oC 이상의 고온에서 볶을 경우 유해물질인 벤조피렌의 생성여부 및 생성량을 확 인하고자 식품의약품안전처 고시²⁴⁾에 따라 시험을 실시하 였다. 시료 중 생지유와 220^oC-15분, 220^oC-20분, 240^oC-15 분 및 240^oC-20분에서 볶은 시료 4종을 샘플링 하여 총 5 종의 시료에 대해서 벤조피렌 시험을 실시한 결과 0.2, 0.8, 0.3, 0.5 및 0.7 μg/kg으로 각각 나타났다. 현재 우리나라에 서 벤조피렌의 기준이 설정되어 있는 생약은 지황과 숙지

황으로 5 µg/kg 이하로 허용하고 있다.²⁵⁾ 지유에 대한 기준 은 설정되어 있지 않은 실정이며, 지황과 숙지황의 기준과 비교할 경우 지유를 포제 할 때 가해진 고온의 온도(220^oC 및 240^oC)에서는 모두 5 mg/kg 이하로 벤조피렌의 생성에 영향을 미치지 않는 것으로 사료된다.

정량 − 지유의 성분연구에서는 gallic acid와 ellagic acid 등과 같은 phenolic acids, kaempferol과 quercetin 등과 같 은 flavonoids, 3β, 19α-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid와 같은 triterpene glycoside 및 sanguidiosides A, B, C 및 D 와 같은 dimeric triterpene glucoside 등이 보고되었다.^8,26-29) 지유의 성분 분석에 대한 연구는 Chen과 Liu³⁰⁾가 RP-HPLC 를 이용하여 서로다른 지역에서 수집된 시료에 대하여 hyperoside의 함량을 분석 비교하였다. Sha 등³¹⁾과 Zhang 등³²⁾ 은 지유의 품질관리를 위해 hyperin과 gallic acid 및 ellagic Table IV. The results of ash and acid-insoluble ash for the Sanguisorbae Radix and its processed products (n=3)

Sample Ash (%) Acid-insoluble ash (%)

Mean SD RSD (%) Mean SD RSD (%)

KHP^a ≤12.0% ≤1.5%

SR1 10.02 0.61 6.13 1.21 0.14 11.43

SR2 11.20 0.68 6.06 1.38 0.18 12.76

SR3 11.58 0.36 3.08 1.22 0.17 13.71

SR4 9.09 0.44 4.79 1.34 0.07 5.07

SR5 8.47 0.55 6.47 1.14 0.15 13.25

SR6 8.72 0.52 5.96 1.51 0.08 5.07

SR7 10.51 0.44 4.21 1.40 0.07 5.15

SR8 10.27 0.57 5.51 1.46 0.11 7.53

SR9 7.25 0.26 3.62 0.86 0.13 14.85

SR10 11.23 0.69 6.12 0.77 0.08 9.96

SR11 10.59 0.43 4.07 0.79 0.11 14.06

SR12 11.13 0.62 5.55 1.05 0.11 10.80

SR13 10.35 0.60 5.85 1.27 0.07 5.60

SR14 10.99 0.41 3.71 0.93 0.09 9.37

SR15 10.98 0.43 3.89 0.87 0.09 9.74

SR16 8.46 0.43 5.02 1.11 0.09 7.85

SR17 9.26 0.42 4.49 0.72 0.10 13.25

SR18 8.15 0.45 5.55 0.87 0.07 7.62

SR19 9.37 0.42 4.47 1.15 0.14 11.95

SR20 9.93 0.44 4.40 0.84 0.08 10.02

SR21 8.26 0.31 3.78 0.62 0.02 2.45

a

KHP: The Korean herbal pharmacopoeia.

SR1, Non-processed; SR2, 160

C-5 min; SR3, 160

C-10 min; SR4, 160

C-15 min; SR5, 160

C-20 min; SR6, 180

C-5 min;

SR7, 180

C-10 min; SR8, 180

C-15 min; SR9, 180

C-20 min; SR10, 200

C-5 min; SR11, 200

C-10 min; SR12, 200

C-15 min;

SR13, 200

C-20 min; SR14, 220

C-5 min; SR15, 220

C-10 min; SR16, 220

C-15 min; SR17, 220

C-20 min; SR18, 240

C-5

min; SR19, 240

C-10 min; SR20, 240

C-15 min; SR21, 240

C-20min

acid를 지표물질로 설정하여 HPLC 분석법을 확립하고 분 석법 검증을 실시하였다. 또한 Chen 등³³⁾은 지유, 지유편(片) 및 지유탄(炭)에서 gallic acid에 대한 분석법을 설정하고 함 량을 비교하였다. 이에 본 저자들은 여러 가지 선행 연구를 바탕으로 지유의 지표물질을 gallic acid, ellagic acid 및 quercetin 등으로 정하고 포제 전·후에 대하여 함량의 변화 를 분석하였다. 정량분석을 위하여 gallic acid 1.56-100.00 μg/

mL, ellagic acid 7.81-500.00 μg/mL 및 quercetin 0.31- 20.00 μg/mL의 농도 범위에서 검량선을 작성한 결과 3종 모 두 상관계수(r²)가 0.9998이상의 양호한 직선성을 나타내었 다(Table V). 지유 표준품과 지유 추출물에 대한 대표적인 크로마토그램은 Fig. 3에 나타내었으며, gallic acid, ellagic

acid 및 quercetin 등 3종의 성분은 4.26, 19.42 및 26.52분 에 각각 검출되었다. 확립된 HPLC 분석법을 이용하여 지 유의 지표성분인 3종에 대하여 시간과 온도에 따라 포제를 실시 한 후 이들 성분의 변화를 분석하였다(Fig. 4). 생지유 와 지유초에서의 gallic acid, ellagic acid 및 quercetin의 함 량 분석 결과 0.14-0.62, 0.26-2.03 및 0.001-0.007%로 각각 나타났다(Table VI). Gallic acid의 경우 220^oC-10분에서 포 제할 경우 그 함량이 0.62%로 가장 많이 검출되었다. 또한 ellagic acid의 경우 온도와 시간이 증가할수록 함량이 증가 되는 것을 확인하였으며, 240^oC-20분에서 최고인 2.03%로 검출되었다. 반면에 quercetin은 시간과 온도가 증가할수록 함량은 감소하였다.

Table V. Calibration curves of the three compounds

Component Linear range (μg/mL) Regression equation^a Correlation coefficient (r²) Gallic acid 1.56 – 100.00 y = 35366.57x – 960.50 1.0000

Ellagic acid 7.81 – 500.00 y = 19127.60x – 67883.17 0.9998 Quercetin 0.31 – 20.00 y = 37292.17x – 724.95 1.0000

a

y: peak area (mAU) of compounds; x: concentration (

g/mL) of compounds.

Fig. 3. HPLC chromatograms of a standard solution (A, each 100 mg/mL) and 70% ethanol extract of non-processed Sanguisorbae Radix (B) at wavelength 270 nm (I) and 370 nm (II).

결 론

본 연구에서는 대한약전외한약(생약)규격집에 수록되어 있는 지유를 시간(5, 10, 15 및 20분)과 온도(160, 180, 200, 220 및 240^oC)에 따라 포제 할 때 지유의 주요 성분인 gallic

acid, ellagic acid 및 quercetin에 대하여 포제 전·후 함량변 화를 비교하였다. 그 결과 gallic acid와 ellagic acid는 RS15(220^oC-10분)와 RS21(240^oC-20분)에서 0.62%와 2.03%

로 가장 높은 함량으로 검출되었다. 반면에 quercetin의 경 우는 포제를 진행할수록 함량이 감소하는 경향을 보였다.

Fig. 4. HPLC profiles of Sanguisorbae Radix and its processed products at wavelength 270 nm (A) and 370 nm (B). SR1 (1), SR2 (2), SR3 (3), SR4 (4), SR5 (5), SR6 (6), SR7 (7), SR8 (8), SR9 (9), SR10 (10), SR11 (11), SR12 (12), SR13 (13), SR14 (14), SR15 (15), SR16 (16), SR17 (17), SR18 (18), SR19 (19), SR20 (20), and SR21 (21)

이상의 결과는 지유의 최적 포제법을 설정하기 위한 기초 자료로 사용할 수 있을 것으로 사료된다.

사 사

본 논문은 2012년도 지식경제부의 재원으로 지역연고산 업육성사업(R0001989) 중 우수 한약재 유통을 위한 공동브 랜드 육성사업(D12030)의 지원을 받아 수행된 연구임.

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9. Tong, H., Mao, D., Zhai, M., Zhang, Z., Sun, G. and Jiang, G.

Table VI. Analytical results (%) of the three marker compounds in Sanguisorbae Radix and its processed products (n=3)

Samples

Content (%)

Gallic acid Ellagic acid Quercetin

Mean (%) SD×10⁻¹ RSD (%) Mean (%) SD×10⁻¹ RSD (%) Mean×10⁻¹ (%) SD×10⁻⁴ RSD (%)

SR1 0.25 0.03 1.01 0.26 0.02 0.75 0.07 0.61 0.87

SR2 0.28 0.01 0.32 0.33 0.03 0.76 0.06 0.07 0.12

SR3 0.34 0.04 1.20 0.30 0.02 0.75 0.07 0.57 0.77

SR4 0.29 0.01 0.33 0.37 0.04 1.21 0.06 0.79 1.24

SR5 0.44 0.02 0.38 0.47 0.04 0.77 0.06 0.25 0.40

SR6 0.30 0.01 0.38 0.27 0.02 0.66 0.06 0.75 1.23

SR7 0.43 0.02 0.54 0.36 0.02 0.41 0.05 0.50 0.99

SR8 0.50 0.08 1.60 0.50 0.01 0.25 0.05 0.76 1.61

SR9 0.43 0.03 0.59 0.44 0.03 0.74 0.04 0.55 1.50

SR10 0.38 0.07 1.98 0.32 0.04 1.13 0.07 1.50 2.07

SR11 0.55 0.05 0.82 0.56 0.06 1.04 0.03 0.30 1.10

SR12 0.55 0.02 0.40 0.58 0.04 0.71 0.02 0.21 0.97

SR13 0.50 0.01 0.23 0.68 0.09 1.33 0.02 0.41 1.69

SR14 0.50 0.02 0.50 0.43 0.06 1.49 0.07 1.63 2.40

SR15 0.62 0.02 0.28 0.93 0.09 1.01 0.02 0.21 0.86

SR16 0.46 0.03 0.75 0.94 0.29 3.15 0.03 0.24 0.76

SR17 0.47 0.03 0.60 1.25 0.04 0.28 0.03 0.43 1.52

SR18 0.50 0.03 0.62 1.78 0.06 0.34 0.03 0.45 1.56

SR19 0.46 0.02 0.44 1.85 0.10 0.56 0.03 0.02 0.05

SR20 0.24 0.04 1.67 1.97 0.12 0.59 0.02 0.35 1.66

SR21 0.14 0.01 0.80 2.03 0.18 0.89 0.01 0.14 1.06

SR1, Non-processed; SR2, 160

C-5 min; SR3, 160

C-10 min; SR4, 160

C-15 min; SR5, 160

C-20 min; SR6, 180

C-5 min;

SR7, 180

C-10 min; SR8, 180

C-15 min; SR9, 180

C-20 min; SR10, 200

C-5 min; SR11, 200

C-10 min; SR12, 200

C-15 min;

SR13, 200

C-20 min; SR14, 220

C-5 min; SR15, 220

C-10 min; SR16, 220

C-15 min; SR17, 220

C-20 min; SR18, 240

C-5

min; SR19, 240

C-10 min; SR20, 240

C-15 min; SR21, 240

C-20min

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(2015. 9. 11 접수; 2015. 10. 22 심사; 2015. 10. 30 게재확정)