Although inflammatory reactions are a mechanism to protect against microbial invasion in the body, however, in excessive cases, they develop into chronic inflammatory diseases. Macro- phages stimulated by the lipopolysaccharide (LPS), one of the outer membrane components of Gram-negative bacteria, induce an inflammatory response by activating various transcription factors and expressing inflammatory mediators. Therefore, it is important to reduce the expression of pro-inflammatory cytokines and inflammatory mediators to suppress the excessive inflammatory reaction. In this study, we report the immunosuppressive effect of Hedyosmum goudotianum Solms (H. goudotianum) extract in response to LPS using RAW264.7 macrophages and suggest the signaling mechanism. Hedyosmum goudotianum extract effectively inhibited LPS-induced expression of inflammatory mediators such as inducible nitric oxide synthase (iNOS), tumor necrosis factor (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β), and interleukin-6 (IL-6). Moreover, H. goudotianum extract sup- pressed the activation of nuclear factor-κB (NF-κB) and signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3), which are known to be important transcription factors in the expression of pro-inflammatory cytokines. Therefore, we suggest that H.
goudotianum extract has a potential value to suppress an excessive inflammation caused by the microbial invasion.
Keywords: Hedyosmum goudotianum Solms, inflammation, LPS, pro-inflammatory cytokine
Lipopolysaccharide (LPS)는 지질 다당류로 그람 음성균의 세포벽 구성 성분 중 하나이다(Sweet and Hume, 1996). LPS가 혈중에 유입되면 내독소혈증(endotoxemia)이라는 질환이 나 타나게 되며, 이로 인해 과도한 염증 반응이 일어나면 패혈증 (sepsis)과 패혈성 쇼크(septic shock)가 유발될 수 있다(Bone, 1991; Parrillo, 1993; Sweet and Hume, 1996). 패혈증은 숙주 의 과도한 면역 반응에 의해 다발성 장기 부전으로 사망에 이 르게 되므로, 원인균을 제거하기 위한 항생제와 함께 과도한 면역 반응을 조절하기 위한 스테로이드가 함께 처방된다. 그 럼에도 불구하고 패혈증으로 인한 사망률은 15~25%, 패혈성 쇼크는 사망률이 30~50%에 이른다(Hotchkiss et al., 2016). 따 라서 과도한 염증 반응을 제어할 수 있는 새로운 물질에 대한 연구는 꾸준히 이루어지고 있는 추세이다.
LPS에 의한 면역반응은 toll-like receptor 4 (TLR4)에 의해 매개되는 것으로 알려져 있으며 대식세포(macrophage), 단핵 세포(monocyte), B 세포(B cell)와 같은 다양한 면역 세포를 활 성화시킬 수 있는 것으로 알려져 있다(Poltorak et al., 1998;
Chow et al., 1999; Qureshi et al., 1999). TLR4에 LPS가 결합 하게 되면 inhibitor of nuclear factor-kappa B (IκB) kinase (IKK)가 활성화되어 IκBα를 인산화시킨다. 인산화된 IκBα는 proteasomal degradation에 의해 분해되고, nuclear factor-kappa B (NF-κB)는 핵으로 이동하여 interleukin (IL)-1β, IL-6, tumor necrosis factor-α (TNF-α)와 같은 염증성 사이토카인들의 발 현을 유도하게 된다(Libermann and Baltimore, 1990; Liu et al., 2017). 또한 LPS는 TLR4-TRAF6-TBK1 신호전달기전을
Hedyosmum goudotianum Solms 추출물의 항염증 효과
이지영† ･ 이은혜† ･ 신진학† ･ 김선숙† ･ 서수련*
강원대학교 분자생명과학과
Hedyosmum goudotianum Solms extract controls inflammation by suppressing NF-κB and STAT3 pathways in LPS-activated macrophages
Ji Young Lee†, Eun Hye Lee†, Jin Hak Shin†, Seon Sook Kim†, and Su Ryeon Seo*
Department of Molecular Bioscience, College of Biomedical Science, Institute of Bioscience & Biotechnology, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Republic of Korea
(Received June 10, 2021; Revised July 12, 2021; Accepted July 15, 2021)
†
These authors contributed equally to this work.
*For correspondence. E-mail: [email protected];
Tel.: +82-33-250-8541; Fax: +82-33-241-4627
통해 signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) 의 인산화를 유도하고, 그 결과 염증성 사이토카인의 발현을 유도할 수 있다는 것이 보고된 바 있다(Balic et al., 2020).
LPS는 대식세포에서 nitric oxide (NO)의 합성효소 중 하나 인 inducible nitric oxide synthase (iNOS)의 발현을 유도함으 로써 NO의 생성을 증가시킬 수 있다(Xie et al., 1994; Choi et al., 2012). NO는 염증 반응과 세포 사멸의 주요 매개체로 작용 하며 비특이적 면역에 관여한다(Zamora et al., 2000).
Hedyosmum goudotianum은 약용식물이며, 잎 부위는 에콰 도르 지역에서 경증질환에 민간요법으로 사용된다(Caballero- Serrano et al., 2019). 그러나 H. goudotianum의 열매에 대한 약리효과는 아직 밝혀진 것이 없으며, 염증 억제 효과에 대한 연구는 알려지지 않았다. 따라서 본 연구에서는 LPS로 염증 반응을 유도한 RAW264.7 세포주에 H. goudotianum 열매 추 출물의 항염 효과에 대해 확인하고자 하였다.
재료 및 방법
실험 재료
Hedyosmum goudotianum의 열매를 상온에서 준비한다.
99.9% 메탄올로 3일간 2시간 간격으로 15분 동안 초음파 처리 를 하였다. 추출물은 여과 후 회전증발기를 사용하여 농축하 였고, 건조기를 통해 건조하였다. 추출 과정은 한국생명공학 연구원 해외생물소재센터에서 진행하였다. 추출물을 분양 받 은 후 DMSO에 20 mg/ml이 되도록 녹인 후 실험에 사용하였 다(분양번호 FBM138-093).
세포배양
RAW264.7 세포주는 ATCC에서 구입하였다. 10% fetal bovine serum, penicillin, streptomycin을 포함한 DMEM (Gibco) 배 지를 사용하여 37°C, 5% CO
2incubator에서 배양하였다. RAW 264.7 세포는 2일에 한 번씩 계대배양을 실시하였다.
Cell viability assay
RAW264.7 세포를 12 well plate에 24시간 배양 후, H.
goudotianum 추출물을 시간별로 6, 12, 24시간 처리하거나 50, 200, 500 µg/ml의 농도별로 처리하여 배양하였다. Cell scraper 를 사용하여 세포를 떼어낸 후 1 ml의 배지를 tube에 넣어 2,000 rpm에서 3분간 원심분리한다. 상등액을 제거한 후 1 ml 의 배지로 resuspension하여 Trypan blue dye로 염색한다.
Hemocytometer에 10 µl를 넣어준 후 광학현미경을 이용하여 살아있는 세포 수를 계산한다.
RNA 분리 및 qRT-PCR
배지를 제거 후 배양된 세포에 RiboEx (GeneAll)를 각각 1 ml 처리한다. 분리된 mRNA를 Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase (Promega)로 cDNA를 합성하였다.
합성된 cDNA은 SYBR Green real-time PCR master mix (TOYOBO)으로 quantitative-PCR을 수행하여 증폭하였다.
PCR step은 95°C에서 30초 동안 denaturation, 53°C에서 30초 동안 annealing, 72°C에서 30초간 extension을 40 cycle 수행하 였다. CFX Manager
TMsoftware version 3.0 (Bio-Rad)를 사용 하여 분석하였고, β-actin으로 normalization을 하였다. 다음과 같은 프라이머를 사용하였다. IL-1β forward : 5'-ACCTGTTC TTTGAGGCTGAC-3', IL-1β reverse : 5'-CTTCTTTGGG-TA TTGTTTGG-3', IL-6 forward : 5'-AGTTGCCTTCTTGGGA CTGA-3', IL-6 reverse : 5'-TTCTGCAAGTGCATCATCGT-3', iNOS forward : 5'-ATCATGGACCACCACACAGC-3', iNOS reverse : 5'-GGTGTTGAAGGCGTAGCTGAAC-3', TNF-α for- ward : 5'-TAGCCCA- CGTCGTAGCAAAC-3', TNF-α reverse : 5'-GGAGGCTGACTTTCTCCTGG-3', β-actin forward : 5'-AG AGGGAAATCGTGCGTGAC-3', β-actin reverse : 5'-CGATA GTGA- TGACCTGACCGT-3'.
Western blot
RAW264.7 세포주에 H. goudotianum 추출물을 50 µg/ml
과 200 µg/ml의 농도로 15분 전처리 후 LPS (100 ng/ml)를 처
리하고 6시간 배양하였다. 150 mM NaCl, 20 mM Tris-Cl; pH
7.9, 1 mM EGTA, 10% glycerol, 1% Nonidet P-40, 10 mM
NaF, 1 mM Na
3VO
4, 1 µg/ml leupeptin, 1 µg/ml aprotinin and
0.2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride이 포함된 lysis buffer
을 사용하여 세포를 lysis하였다. 단백질 정량 후 SDS-PAGE
와 transfer을 진행하였다. 5% 탈지분유를 사용하여 blocking
후 1차 항체를 4°C에서 하루 동안 incubation 하였다. TBS-T를
사용하여 멤브레인을 워싱한 후 2차 항체를 상온에서 1시간
incubation 한 후 다시 TBS-T로 3회 워싱한다. Anti-mouse
IL-1β/IL-1F2은 R&D systems에서 구입하였고 anti-β-actin,
anti-phospho-IκBα, anti-phospho-STAT3 항체들은 Cell Signaling
Technology에서 구입하였다.
통계처리
모든 실험 측정값은 반복 실험에 대한 평균(mean) ± 표준편 차(SD)로 표시하였다. 통계분석을 위해 unpaired student’s t-test를 시행하였고 p < 0.05인 경우 유의적인 것으로 판정하 였다.
결 과
Hedyosmum goudotianum에 의한 세포독성 측정
RAW264.7 대식세포주에 H. goudotianum 추출물을 처리 했을 때 세포증식에 영향을 미치는지 추출물 처리 시간과 농 도에 따른 세포생존율을 확인하였다. 생존 세포수를 측정하기 위해서 trypan blue dye exclusion 방법을 사용하였다. RAW 264.7 세포주에 H. goudotianum 추출물을 50, 200, 500 µg/ml 농도별로 나누어 6시간 처리 후 세포생존율을 확인한 결과 50 µg/ml의 농도에서 세포생존율은 100.5%, 200 µg/ml의 농도 에서 102%로 세포생존율이 유의적으로 변하지 않았다. 500 µg/ml의 추출물을 처리한 경우 세포생존율이 61.6%로 대조
군에 비해 세포생존율이 유의적으로 감소하였다(Fig. 1A). 이 를 통해 H. goudotianum 추출물은 RAW264.7 세포주에 50, 200 µg/ml의 농도에 세포독성이 없음을 확인하였다.
또한 RAW264.7 세포주에 H. goudotianum 추출물을 200 µg/ml 농도로 처리하여 시간별 세포생존율을 확인하였다.
200 µg/ml의 농도에서 세포생존율은 6시간 처리시 112%. 12 시간 106%, 24시간 처리시 106%로 나타났다(Fig. 1B).
Hedyosmum goudotianum 추출물은 RAW264.7 대식세포 주에서 최대 200 µg/ml의 농도에서 24시간까지 세포독성이 없음을 확인하였다. 이를 바탕으로 RAW264.7 세포주의 세 포생존율에 영향을 주지 않는 처리시간인 3시간과 6시간, 처 리농도는 50 µg/ml과 200 µg/ml으로 적용하여 실험을 수행하 였다.
Hedyosmum goudotianum에 의한 IL-1β의 단백질 발현 억제
Hedyosmum goudotianum이 염증반응을 억제할 수 있는지 확인하기 위해 LPS를 처리한 RAW264.7 세포주에 H. goudo- tianum 추출물을 처리한 후 대표적인 염증성 사이토카인으로 알려진 IL-1β의 단백질 발현량을 확인하였다. RAW264.7 세 포주에 H. goudotianum 추출물을 각각 50, 200 µg/ml로 15분 전처리한 후 100 ng/ml의 LPS를 6시간 처리하였다. 그 후 (A)
(B)
Fig. 1. Dose- and time-dependent cytotoxicity of H. goudotianum extract.
(A) RAW264.7 cells were treated with H. goudotianum extract for the indicated concentrations. After 6 h of incubation, the viability of cells was assessed by trypan blue dye exclusion. (B) RAW264.7 cells were treated with H. goudotianum extract (200 μg/ml) for the indicated times, and the viability of cells was assessed by trypan blue dye exclusion. The results are represented as the means ± SD of three independent experiments. *p <
0.05 versus control.
(A)
(B)
Fig. 2. The effect of H. goudotianum extract in LPS-induced IL-1β expression.
(A) RAW264.7 cells were treated with the H. goudotianum extract (50 or
200 μg/ml) for 15 min followed by the treatment with LPS (100 ng/ml) for
6 h. IL-1β and β-actin protein levels were analyzed by Western blot
analysis (A) and quantified (B). The results are represented as the means ±
SD of three independent experiments. *p < 0.05.
Western blot을 통해 RAW264.7 세포주에서 IL-1β의 단백질 발현량을 확인하였다. LPS로 인해 증가된 IL-1β의 단백질 발 현량은 H. goudotianum 추출물의 농도의존적으로 감소하는 경향을 보였다(Fig. 2A and B).
이를 통해 H. goudotianum 추출물이 LPS로 유도된 염증반 응에서 증가하는 IL-1β의 단백질 발현을 억제할 수 있음을 확 인하였다.
Hedyosmum goudotianum에 의한 염증성 사이토카인과 염증 매개인자의 전사 억제
Hedyosmum goudotianum 추출물이 LPS에 의해 유도되는 염증성 사이토카인과 염증 매개인자의 발현을 억제할 수 있는 지 확인하기 위해 qRT-PCR을 실시하였다. RAW264.7 세포 주에 H. goudotianum 추출물을 15분 전처리 한 후 LPS를 처리 한 결과 LPS에 의해 증가하였던 IL-1β, IL-6, iNOS, TNF-α의 mRNA 발현량이 H. goudotianum 추출물의 농도의존적으로 감소하였다(Fig. 3A~D). 특히 IL-1β, IL-6, iNOS의 경우 H.
goudotianum 추출물의 농도가 50 µg/ml과 200 µg/ml일 때 억 제 정도에 큰 차이를 보이지 않을 정도로 뛰어난 억제효과를
보였고, TNF-α의 경우 50 µg/ml에서는 유의한 수준의 억제효 과를 보이고 200 µg/ml일 때는 완전한 억제 효과를 보였다. 이 를 통해 H. goudotianum 추출물이 LPS에 의해 유도되는 다양 한 염증 매개인자들의 발현을 전사 수준에서 억제할 수 있음 을 확인하였다.
Hedyosmum goudotianum에 의한 신호전달기전 조절
LPS에 의한 염증성 사이토카인과 염증 매개인자의 발현은 NF-κB와 STAT3 전사인자의 활성화에 의해 유도될 수 있음이 알려져 있다(Kim et al., 2017; Taniguchi and Karin, 2018). H.
goudotianum 추출물에 의한 염증 매개인자들의 발현량 감소가 이러한 전사인자들의 활성화 억제와 관련이 있는지 확인하기 위해 IκBα와 STAT3의 인산화 정도를 확인하였다. RAW264.7 세포주에 H. goudotianum 추출물을 15분 전처리 한 후 LPS를 처리하자 STAT3의 인산화가 추출물의 농도의존적으로 감소 하는 결과를 확인하였다(Fig. 4). IκBα의 경우 H. goudotianum 추출물의 농도가 50 µg/ml일 때는 인산화 감소 정도가 크지 않 았으나 200 µg/ml의 농도로 처리하자 인산화가 크게 감소되 는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 H. goudotianum 추출물
(A) (B)
(C) (D)
Fig. 3. The effect of H. goudotianum extract in LPS-induced mRNA level. RAW264.7 cells were treated with the H. goudotianum extract (50 or 200 μg/ml)
for 15 min followed by the treatment with LPS (100 ng/ml) for 3 h. The mRNA levels of IL-1β (A), IL-6 (B), iNOS (C), and TNF-α (D) were determined by
RT-PCR. The results are represented as the means ± SD of three independent experiments. *p < 0.05, ***p < 0.001.
이 NF-κB와 STAT3의 활성화를 감소시킴으로써 염증성 사이 토카인과 염증 매개인자의 전사 억제가 나타나는 것임을 예상 할 수 있다(Fig. 5).
고 찰
염증 반응은 세포 및 조직의 손상이나 감염으로부터 신체 를 방어하기 위해 국부적 혹은 전신적으로 일어나는 면역계의 작용을 지칭한다(Ferrero-Miliani et al., 2007). 염증 반응을 통 해 손상된 세포나 조직, 병원성 미생물을 제거하는 동시에 조 직을 재생하게 된다(Oishi and Manabe, 2018). 하지만 이러한 염증 반응이 비정상적으로 지속되어 만성화되거나 과도하게
일어날 경우 천식이나 비염과 같은 호흡기질환, 아토피 피부 염과 건선 등의 피부질환, 위염과 염증성 장염 등의 소화기질 환을 비롯한 심장질환과 당뇨, 암의 원인이 되기도 한다(Libby, 2007; Furman et al., 2019). 이러한 불필요한 염증 반응을 제어 하기 위해 사용되는 약물을 소염제라고 하며, 소염제는 스테 로이드 계열과 비스테로이드 계열로 나눌 수 있다. 스테로이 드 계열은 장기간 사용할 경우 쿠싱증후군, 감염, 피부 이상 등 의 심각한 부작용이 생길 수 있어 사용에 제한적이다. 비스테 로이드 계열의 경우 위장관과 신장에 부작용이 유발될 수 있 으며, 심혈관계 질환의 발생 위험성이 증가될 수 있다. 때문에 효과는 뛰어나지만 부작용이 적은 항염 효능 물질을 발굴하기 안전성이 입증된 식물이나 해조류로부터 유래된 물질에 대한 연구가 많이 이루어지고 있다.
본 연구에서는 홀아비꽃대과(Chloranthaceae)에 속하는 식 물인 Hedyosmum goudotianum Solms 열매의 메탄올 추출물 을 이용하여 LPS에 의해 유도된 염증 반응을 억제할 수 있는 지 확인하였다. Hedyosmum goudotianum은 코스타리카, 파 나마, 콜롬비아, 에콰도르, 베네수엘라, 페루와 같은 남아메리 카에 자생하며, 이 지역에서는 민간요법으로 위에 통증이 있 을 때 잎을 달여서 마셨다(Radice et al., 2019).
LPS를 RAW264.7 세포주에 처리하여 염증 반응을 유발하 는 모델은 항염 효능 확인을 위한 연구에서 널리 활용되고 있는 in vitro 모델이며, 그 신호전달기전 역시 많이 알려져 있다. 본 연구에서는 RAW264.7 세포주에 LPS를 처리하여 염증 반응을 유도한 뒤, 이로 인해 증가하는 염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6) 과 염증 매개인자(iNOS, TNF-α)의 발현량이 H. goudotianum 추출물에 의해 감소할 수 있는지 확인하고, 이들의 전사를 조 절하는 것으로 알려진 전사인자인 NF-κB와 STAT3의 활성화 여부를 확인하였다. 추출물은 200 µg/ml의 농도로 24시간까 지 처리하였을 때 세포독성이 나타나지 않았다. Hedyosmum goudotianum 추출물이 염증반응을 억제할 수 있는지 확인하 기 위해 H. goudotianum 추출물을 15분간 전처리한 후 LPS로 염증반응을 유도하였다. 세포실험의 경우 LPS 처리 초기에 염 증반응 매개 신호전달 단백질의 인산화가 시작되므로 일반적 으로 항염효능 물질을 전처리하고 LPS에 대한 염증 신호 조절 을 확인한다(Xu et al., 2017; Han et al., 2019; Lee et al., 2019a, 2019b). LPS에 의한 염증 신호에서 IκBα의 인산화는 IκBα의 proteasome을 통한 분해를 유도하고 NF-κB를 자유롭게 해주 어 핵으로의 이동을 촉진시켜 타겟 사이토카인의 발현을 유도 한다. 세포 실험에서는 50 µg/ml과 200 µg/ml의 두 농도로 처 리한 후 항염 효능을 확인하였는데, IL-6와 iNOS, IL-1β의 경 우 50 µg/ml에서도 높은 발현량 감소를 나타냈으나, TNF-α의
Fig. 4. The effect of H. goudotianum extract in LPS-induced signaling pathway. RAW264.7 cells were incubated with H. goudotianum extract (50 or 200 μg/ml) for 15 min followed by the treatment with LPS (100 ng/ml) for 6 h. P-IκBα, p-STAT3, IκBα, STAT3, and β-actin protein levels were analyzed by Western blot analysis.
Fig. 5. Schematic representation of H. goudotianum-mediated anti-
inflammatory mechanism. Hedyosmum goudotianum exerts anti-inflammatory
effects by inhibiting NF-κB and STAT3 signaling pathways.
경우 50 µg/ml보다 200 µg/ml을 처리한 경우 확연한 감소 효과 를 확인할 수 있었다. 또한 이러한 염증성 사이토카인과 염증 매개인자의 전사를 유도하는 것으로 알려진 전사인자인 NF-κB 와 STAT3 신호전달 기전의 활성화 정도를 IκBα와 STAT3의 인 산화 여부로 확인하였다. 그 결과 STAT3의 인산화는 50 µg/ml 로 처리한 경우에도 크게 감소하는 반면, IκBα의 인산화는 200 µg/ml에서 확연히 감소하는 효과를 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 종합적으로 확인하였을 때 H. goudotianum 추출물은 200 µg/ml의 농도로 사용하였을 때 확연한 염증 반응 억제효 과를 나타냈다.
Hedyosmum goudotianum의 항염 효능에 대한 연구는 열매뿐 만 아니라 잎이나 줄기와 같은 부위 추출물에 대해서도 전무하 므로 본 연구는 H. goudotianum의 항염 효능을 최초로 밝혔다는 데 의의가 있다. 향후 추가적인 연구를 통해 H. goudotianum 추 출물 중 항염 효능을 나타내는 단일 성분을 밝히고, 그 작용 기 전을 밝힘으로써 새로운 천연물 유래 항염 물질로 발굴하여 신규 소염제로 개발될 가능성이 있을 것이다.
적 요
염증 반응은 체내의 미생물 침입에 방어하는 기작으로, 과도 한 경우 만성적인 염증성 질환으로 발전한다. 그람 음성균의 세 포벽 구성 성분 중 하나인 lipopolysaccharide (LPS)에 의해 자 극된 대식 세포는 다양한 전사 인자와 염증 매개인자를 활성화 하여 염증 반응을 유도한다. 따라서 과도한 염증 반응을 억제하 기 위해서 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)과 염 증 매개인자의 발현을 줄이는 것이 중요하다.
본 연구에서는 Hedyosmum goudotianum Solms (H. goudoti- anum) 추출물이 LPS에 의해 유도된 염증반응을 억제하는 효 과가 있는지 확인하고, 그 신호전달기전에 대해 알아보았다.
RAW264.7 대식 세포주에서 LPS로 염증 반응을 유도하였을 때 H. goudotianum 추출물은 염증 매개인자인 inducible nitric oxide synthase (iNOS)와 TNF-α, 염증성 사이토카인인 IL-1β, IL-6의 발현을 효과적으로 억제하였다. 또한 염증반응 신호전 달기전에서 중요한 전사인자로 알려진 STAT3와 NF-κB 활성 화를 억제함으로써 염증성 사이토카인과 염증 매개인자의 발 현량을 감소시킬 수 있음을 확인하였다.
본 연구 결과는 H. goudotianum 추출물을 활용하여 향후 세 균 감염에 의해 유발되는 과도한 염증 반응을 억제하는 의약 품 개발 및 화장품 원료의 신규 후보 물질 발굴의 기본 데이터 로 활용될 수 있을 것으로 예상된다.
감사의 말
이 논문은 2019년도 강원대학교 대학회계 연구비, 연구재 단(NRF-2021R1A2C1008170)의 지원을 받아 수행되었음.
Conflict of Interest
The authors have no conflicts of interest to report.
References
