조선대학교 대학원

2 01 3 년 2월 석사학위 논문

TLR2의 활성이 MDPC-23세포의 부착과 이동에 미치는 영향

조선대학교 대학원

치의학과

신 동 은

TLR2의 활성이 MDPC-23세포의 부착과 이동에 미치는 영향

TLR2ac t i va t i onpr omot e sa dhe s i ona ndmi gr at i onofmur i ne de nt a lpa pi l l ade r i ve dMDPC-2 3c e l l s

2 01 3 년 월 일

조선대학교 대학원

치의학과

신 동 은

TLR2의 활성이 MDPC-23세포의 부착과 이동에 미치는 영향

지도교수 안 상 건

이 논문을 치의학 석사학위신청 논문으로 제출함

2 01 3 년 월

조선대학교 대학원

치의학과

신 동 은

신동은의 석사학위 논문을 인준함

위원장 원광대학교 교수 윤 정 훈 ( 인) 위 원 서울대학교 교수 강 건 욱 ( 인) 위 원 조선대학교 교수 안 상 건 ( 인)

2 01 3 년 월

조선대학교 대학원

- i -

목 차

목 차 ··· ⅰ 도목차 ··· ⅲ ABSTRACT ··· ⅳ

Ⅰ.서 론 ··· 1

Ⅱ.재료 및 방법 ··· 3

1.세포 배양 및 시약 ··· 3

2.Reversetranscription-polymerasechainreaction(RT-PCR)··· 3

3.MTT 분석 ··· 4

4.Westernblot분석 ···4

5.세포 부착 분석 ···4

6.세포 이동 분석 ···5

7.자료 분석 ···5

Ⅲ.결과 ··· 6

1.MDPC-23세포에서 TLR2발현 및 NF-κB와 MAPK 신호 활성화 ···6

2.TLR2agonist가 MDPC-23세포 성장에 미치는 영향 ···8

3.TLR2agonist가 MDPC-23세포 부착에 미치는 영향 ···9

4.TLR2agonist가 MDPC-23세포 이동에 미치는 영향 ···11

Ⅳ.고찰 ··· 13

V.참고문헌 ···15

- iii -

도목차

Figure1.Thegeneexpression ofTLR2 wasexamined by RT-PCR and MDPC-23cellsweretreatedwithPam3CSK (1μg/ml)andphosphorylation ofIκB-α andMAPK wasexaminedbywesternblot··· 7

Figure 2. Growth inhibition effect of Pam3CSK in MDPC-23 cells

···8

Figure3.TheeffectofPam3CSK-inducedadhesion···10

Figure4.TheeffectofPam3CSK-inducedmigration··· 12

ABSTRACT

TLR2a c t i vat i onpr omot e sadhe s i onandmi gr at i onof mur i nede nt alpapi l l ade r i ve dMDPC-2 3c e l l s

ShinDongEun

Advisor:Prof.Sang-GunAhn,Ph.D.

DepartmentofDentalScience

GraduateSchoolofChosunUniversity

Odontoblasts and/ordentalpulp cells are responsible fortooth repairas wellasdentinformation.Adhesionandmigrationarecriticalprocessesfor tissue regeneration.This study was performed to clarify whetherPam3 modulates adhesion and migration ofa murine odontoblast-like cellline, MDPC-23 celland TLR2 signaling is engaged in this process.TLR2 expression in MDPC-23cellswasexaminedby RT-PCR.Adhesion assay wasperformedusing typeⅠ collagen-coatedplates.Migrationabilitywas determined by a commercialassay kit.Phosphorylation ofIκB-α,JNK, p38, and ERK was examined by Western blot analysis. TLR2 was functionally expressed in MDPC-23 cells.Pam3CSK treatmentenhanced adhesion and migration ofMDPC-23 cells in a dose-dependentmanner.

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BlockadeofTLR2using itsantibody restored Pam3CSK-inducedadhesion and migration ofMDPC-23 cells.Thesefindings indicate thatPam3CSK, an immune activatorfrom gram negative bacteria,can promote adhesion andmigrationabilityofMDPC-23cellsviaTLR2.

I .서론

선천 면역 반응은 감염에 대항하는 첫 번째 방어체계로, 대부분 macrophages와 dendritic cells에 의해 조절된다. Pattern recognition receptors (PRRs)는 lipopolysaccharide (LPS)와 같은 pathogen associated molecular patterns (PAMPs)의 인식을 통해 선천 면역 반응이 시작된다.

PRRs중,Toll-likereceptors(TLRs)은 가장 잘 알려진 수용체이다.TLR을 감지하는 미생물 분자로는, LPS,lipoproteins,lipoteichoid acid (LTA), dsRNA,ssRNA와 bacterialDNA의 CPG motif를 포함하고 있다 (1,2). TLRs은 MyD88- 또는 TRIF-dependent pathway를 통해 NF-κB와 mitogen-activated protein kinases (MAPKs)가 활성화 됨으로써 염증성 cytokines의 생산을 유도한다 (1,2).

상아모세포는 신경관에서 유래된 간엽세포로,구강내 미생물을 자극시킴으 로써 치수 면역 반응을 조절한다 (3,4).최근 연구에서 사람 상아모세포에서 TLR2와 TLR4가 IL-1β,TNF-α,human betadefensin-2(hBD-2)와 같은 염증성 조절인자들의 증가를 유도함으로써 기능적으로 발현하는 것을 확인하 였다.Durand 등은 상아모세포에서 TLR1-6과 TLR9의 mRNA가 발현하고, LTA 자극이 NF-κB 활성을 유도하고 TLR2의 유전자와 단백질 수준의 증가 를 유도한다고 보고하였다 (3).이러한 사실은 상아모세포에서 TLR 신호를 통해 구강내 미생물에 대항하는 면역반응에서 중요한 역할을 할 것으로 제시 된다.

면역반응 뿐만 아니라,상아모세포에서 정확한 메커니즘이 명확하게 밝혀 지지는 않았지만,치아 형성과 같은 재생과 치아 회복에서 증가할 것으로 생 각된다.법랑질 파괴에 따른 상아모세포가 치아우식증으로부터 상아질로 들 어가는 미생물에 노출이 될 때,상아모세포의 염증 반응 뿐 만 아니라 조직 회복과정에 관여한다.또한 면역반응 뿐 만 아니라 치아 회복과 재생에서 TLR 신호가 증가함은 알려져 있다 (5-7).

그러나,상아모세포의 조직 재생과정에서 TLR 신호에 대한 역할은 거의 밝혀져 있지 않다.세포 부착과 이동은 악성종양의 전이와 마찬가지로 여러

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생리학적 병리학적 조건에서 조직 회복에 중요한 과정이다.그러므로 본 연 구에서,TLR2 agonist인 Pam3CSK를 사용하여 생쥐 치유두에서 유래된 MDPC-23세포의 부착 및 이동 효과를 확인하고자하였다.

Ⅱ.실험 재료 및 방법

1)세포배양 및 시약

18-19일 된 CD-1생쥐 치유두에서 유래된 MDPC-23세포주를 사용하였다 (8,9).MDPC-23세포는 10% fetalbovineserum,1xMEM non-essential amino acid, 100 U/ml penicillin과 100 μg/ml streptomycin이 포함된 Dulbecco’smodifiedEaglemedium (DMEM)에서 37℃,5% CO2의 조건하 에 계대 배양하였다.Pam3CSK는 Invivogen(SanDiego,CA,USA)으로부터 구 입하여 사용하였고,TLR2항체는 IMGENEX(Sandiego,CA,USA)로부터 구입 하여 사용하였다.

2)Reversetranscription-polymerasechain reaction (RT-PCR)

MDPC-23 세포 또는 생쥐 비장 조직에서 Qiagen RNeasy Mini kit (Valencia,CA,USA)을 사용하여 RNA를 추출하였다.1μg RNA를 사용하 여 cDNA를 합성한 후 Superscript^TM One-step RT-PCR with platinum^® Taqkit(Invitrogen)를 사용하였고,아래의 primer를 사용하여 PCR을 수행하 였다.

TLR2,F:5’-GATGCCTACTGGGTGGAGAA-3’

R:5’-CGCAGCTCTCAGATTTACCC-3’

GAPDH,F:5’-CCAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3’

R:5’-GTCATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3’

PCR 조건은 94℃ 30초,62℃ 30초,72℃ 30초,72℃ 10분을 포함한 TLR2는 94℃ 5분,35 cycles과 GAPDH는 25cycles을 수행하였다.1.5%

acrylamidegel과 Geldocumentation system (Bio-rad,Hercules,CA,USA) 을 이용하여 확인하였다.

- 4 - 3)MTT 분석

MTT 시약은 ThiazolylblueTetrazolium Bromide를 최종 농도 5mg/ml 가 되도록 PBS에 녹인 후 빛을 차단하고 4℃에 보관하였다.MDPC-23세 포를 계수하여 12well배양접시에 1×10⁵개씩 넣고 배양하였다.Pam3CSK를 농도별로 24시간 처리 후,MTT 용액을 넣고,37℃에서 3시간을 배양하였 다. 세포 배양액을 제거한 후, acid-isopropanol (0.04 mol/L HCL in isopropanol)을 분주하고 darkbluecrystals을 용해시킨 후,96well배양접시 로 옮긴 후,MicroplateAutoreaderELISA를 사용하여 570 nm의 파장으로 흡광도를 측정하였다.

4)Western blot분석

단백질의 분리를 위해 Lysisbuffer(1% Triton X-100,150mM NaCl,5 mM EDTA와 protease inhibitors)를 사용하여 단백질을 추출한 후, MicropalteAutoreader를 사용하여 595nm에서 농도를 측정하였으며,20-50 μg의 단백질을 7.5-12 % SDS-PAGE gel을 사용하여 전기영동 후,PVDF membrane을 이용해 transfer를 시행하였다.Blocking은 5 % skim milk에 TBS (20mmol/L Tris,137mmol/L NaCl,pH 7.6)를 1:1000희석하여 넣은 용액에 실온에서 2 시간 하였고, 일차항체는 phospho-IκB-α, IκB-α, phospho-ERK,phospho-JNK,phospho-p38,p38 (Cellsignaling,Danvers, MA,USA)과 Actin(Santacruz,CA)을 1:1000으로 희석하여 4℃ overnight 하였다.Membranes은 0.05% tween-TBS (TBS-T)를 사용하여 3회 세척 하고,이차 항체는 1:5000으로 희석하여 실온에서 1시간 배양하였고,마지막 으로 membranes은 WestZOL PLUS reagent를 사용하여 LAS-1000 (Fuji film,Japan)으로 검출하였다.

5)세포 부착 분석

PBS에 50 μl의 type Icollagen을 희석하고,96 well배양접시의 각 well

에 넣고 4 ℃에 overnight배양한다.그 후에,각 well을 PBS로 세척하고, nonspecificbinding sites를 억제하기 위해 1% BSA를 넣고 37℃에서 1시 간 배양하였다.여러 농도의 Pam3CSK를 넣고 30분 후에 5×10⁴개의 세포를 계수하여 60 분 배양하였다.PBS를 이용하여 부착되지 않은 세포들을 세척 하고 4% paraformaldehyde에 0.5% toluidineblue용액을 넣고 5분간 배 양한 후,증류수로 세척하였다.현미경을 이용하여 부착된 세포를 확인하고, 1% SDS 100μl넣고 MicroplateAutoreaderELISA (Bio-TekInstruments Inc.,Winooski,VT,USA)595nm에서 흡광도를 측정하였다.

6)세포 이동 분석

세포 이동 분석은 ChemotaxisCellMigration Assay kit(CHEMICON)를 사용하여 확인하였다.MDPC-23세포를 계수하여 Migrationkit에 1×10⁴개씩 넣고 37 ℃,5 % CO2의 조건하에 24 시간 배양하였다.Lower surface membrane에 이동된 세포를 methanol로 고정 후,hematoxylin을 사용하여 5 분동안 염색하였다.OlympusBX41inverted microscope를 사용하여 사진을 찍고,이동된 세포수를 측정하였다.그리고,이동된 세포는 celllysisbuffer로 lysis 후, CyQUANT GR Dye를 사용하여, fluorescence palte reader (Varioskan,ThermoElectronCo,Waltham,MA,USA)로 480/520nm의 파 장에서 확인하였다.

7)자료 분석

모든 통계학적 분석은 MicrosoftExcel을 사용하였다.각각 시료에 대한 t-test를 사용하여 유의성 검정을 한 결과 p-value는 <0.05,0.01,0.001로 통 계적으로 유의하게 정의하였다.

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Ⅲ.결과

1)MDPC-23세포에서 TLR2발현 및 NF-κB와 MAPK 신호 활성화

MDPC-23세포에서의 mRNA 발현을 확인하기 위해,대조군으로 생쥐 비 장에서 추출한 RNA를 사용하여 RT-PCR을 시행하였다. 대조 유전자로 GAPDH를 이용하여 그 발현 정도를 관찰한 결과,생쥐 비장에서 추출한 RNA와 MDPC-23세포에서 추출한 RNA에서 TLR2가 발현함을 확인할 수 있었다 (Fig 1A).다음으로,TLR 신호에서 중요한 역할을 하는 NF-κB와 MAPK 신호를 western blot방법으로 확인하였다.MDPC-23 세포에 TLR agonist인 Pam3CSK 1μg/ml처리하고 30~90분 후에 단백질을 추출하여 westernblot를 시행한 결과,IκB-α는 큰 변화는 없었지만,phospho-IκB-α가 시간별로 증가하는 것을 확인하였다.또한,phospho-ERK,phospho-JNK, p38,phospho-p38의 수준이 시간별로 증가하는 것을 확인하였다 (Fig 1B). 이 결과로 MDPC-23세포에서 TLR2가 발현함을 확인하였고,TLR2가 NF-κ B와 MAPK 신호를 통해 조절된다는 것을 확인하였다.

Figure 1.The gene expression ofTLR2 was examined by RT-PCR in mouse spleen and MDPC-23 cells (A). MDPC-23 cells were treated with Pam3CSK (1 μg/ml)and phosphorylation ofIκB-α and MAPK wasexaminedby western blot(B).

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2)TLR2agonist가 MDPC-23세포 성장에 미치는 영향

MDPC-23세포에서 TLR2agonist인 Pam3CSK에 의해 세포성장 및 증식 에 미치는 영향을 관찰하기 위해,MTT 분석을 시행하였다.Pam3CSK를 0.1, 1,10μg/ml의 다양한 농도로 MDPC-23세포에 처리하고 MTT 검사를 시행 한 결과,Pam3CSK 0.1,1 μg/ml농도에서 세포 성장 억제효과가 없었으나, Pam3CSK 10 μg/ml농도에서 MDPC-23 세포성장 억제효과를 나타내었다 (Fig 2).이 결과로,TLR2agonist인 Pam3CSK에 의한 MDPC-23세포 부착 및 이동에 Pam3CSK 농도를 1μg/ml로 사용하여 실험을 진행하였다.

Cont 0.1 1 10

25 50 75 100

Pam

CSK (mg/ml)

**

C e ll V ia b ili ty ( % )

Figure 2.Growth inhibition effectofPam3CSK in MDPC-23 cells.

Pam3CSK inhibited cell proliferation in MDPC-23 cells was measured by MTT assay.Thegraph representstherelativenumber of cells from three separated experiments. ** p-value <0.01, statistically significantwhen comparedwiththecontrol.

3)TLR2agonist가 MDPC-23세포 부착에 미치는 영향

Pam3CSK가 MDPC-23세포의 세포 부착을 유도하는지 확인하기 위해 세 포 부착 분석을 시행하였다.PBS에 50μl의 typeIcollagen을 희석하고,96 well배양접시의 각 well에 넣고 4℃에 밤새 배양하였다.그 후에,각 well 을 PBS로 세척하고,nonspecificbinding sites를 억제하기 위해 1% BSA를 넣고 37℃에서 1시간 배양하고,여러 농도의 Pam3CSK를 넣고 30분 후에 5×10⁴개의 세포를 계수하여 60분 배양하였다.PBS를 이용하여 부착되지 않 은 세포들을 세척하고 4% paraformaldehyde에 0.5% toluidineblue용액을 넣고 5 분간 배양한 후, 증류수로 세척하고, 1 % SDS 100 μl 넣고 Microplate Autoreader ELISA (Bio-Tek Instruments Inc.,Winooski,VT, USA)595 nm에서 흡광도를 측정하였다.실험 결과,Pam3CSK 처리군에서 대조군과 비교하여 유의성있게 MDPC-23세포의 세포 부착이 증가하는 것을 확인하였다 (Fig.3).다음으로,TLR2-특이 항체를 사용하여 Pam3CSK에 의 해 유도되는 MDPC-23 세포의 부착에 영향을 미치는지 알아보았다.

MDPC-23세포를 계수하여 세포 부착을 확인한 결과,TLR2항체에 의한 세 포 부착은 대조군과 비교하였을 때 차이가 나지 않았지만,Pam3CSK에 의해 증가되었던 군과 비교하였을 때,Pam3CSK와 TLR2항체를 처리한 군에서는 세포 부착이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다 (Fig 3). 이 결과로 MDPC-23세포에서 TLR2agonist인 Pam3CSK에 의해 세포 부착이 유도됨 을 확인하였다.

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Figure 3.The effectofPam3CSK-induced adhesion.MDPC-23 cells were incubated with or without Pam3CSK (1 μg/ml) and TLR2 antibody (10 μg/ml) for 2 h. Cell adhesion was quantified by counting the number of adhesion cells.The graph represents the relativenumberofcellsfrom threeseparatedexperiments.*p-value

<0.05, ** p-value <0.01, statistically significant when compared withthecontrol.

4)TLR agonist가 MDPC-23세포 이동에 미치는 영향

Pam3CSK가 MDPC-23세포의 세포 이동을 유도하는지 확인하기 위해 세 포 이동 분석을 시행하였다.MDPC-23 세포를 계수하여 1×10⁴개씩 넣고 37

℃,5% CO2의 조건하에 Pam3CSK 10μg/ml을 24시간 처리하여 배양하였 다. Lower surface membrane에 이동된 세포를 methanol로 고정 후, hematoxylin을 사용하여 5 분동안 염색하였다. Olympus BX41 inverted microscope를 사용하여 사진을 찍고,이동된 세포수를 측정하였다.실험 결 과,Pam3CSK 처리군에서 대조군과 비교하여 유의성있게 MDPC-23 세포의 세포 이동을 유도하는 것을 확인하였다 (Fig.4).TLR2특이 항체를 사용하 여 Pam3CSK에 의해 유도되는 MDPC-23세포의 이동에 영향을 미치는지 알 아보았다.실험 결과,TLR2항체를 처리함으로써 Pam3CSK에 의해 유도되는 세포 이동이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다 (Fig. 4). 이 결과로 MDPC-23 세포에서 Pam3CSK에 의해 유도되는 세포 이동이 TLR2를 통해 이루어진다는 것을 확인하였다.

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Figure4.TheeffectofPam3CSK-induced migration.MDPC-23cells were incubated with or without Pam3CSK (1 μg/ml) and TLR2 antibody (10 μg/ml) for 2 h. Migrated cells were counted by transwell assay. Cell migration was quantified by counting the numberofcells thatmigrated into the innermembrane.The graph represents the relative number of cells from three separated experiments. * p-value <0.05, ** p-value <0.01 statistically significant.

Ⅳ.고찰

TLR의 활성은 microbialproducts와 endogenousligands를 포함한 두가지 종류를 통해 상처 치유에 관여한다 (5).장과 피부와 같은 조직에서 보호 장 벽의 파괴에 따른 조직 손상 후에 LPS와 lipoprotein과 같은 bacterial products에 의해 TLR이 활성된다.더욱이,간,신장,심장과 같은 많은 조직 에서 조직 손상은 heat shock proteins, high mobility group box 1 (HMGB1)과 죽거나 죽어가는 세포로부터 나오는 uric acid와 같은 endogenousligands의 유도의 결과로 TLR이 활성화되고,염증이 억제된다.

조직 손상에 있어 TLRs의 효과는 양날 칼이 되는데,국소 빈혈 영향과 알 코올성 간 상해에서 TLR2또는 TLR4는 상피성 손상의 악화를 증가시킨다 (10,11).반면에,장에서,TLR2/TLR4-MyD88신호는 DSS에 의해 유도되는 손상에 따르는 상피조직의 재생에 필수적이다 (12,13).게다가,LPS 신호는 TLR4/MyD88비의존적 경로를 통해 TGF-β 신호를 통해 간의 섬유화를 높 인다 (14).이러한 연구 결과는 TLR 신호가 뚜렷한 메커니즘을 통한 조직 재 생에서 밀접하게 연관되어 있을 것으로 생각된다.

치아의 재생은 손상된 치아의 교체가 가장 유망한 치료 전략으로 간주된다 (15-17).치수의 바깥 표면의 일부분인 상아모세포는 염증반응과 마찬가지로 치아 재건과 재생 역할을 한다.비록 TLR 신호가 골모세포의 면역반응에서 증가하지만 (3),어떻게 TLR 신호가 상아모세포의 조직 재생과정 조절되는지 명확하게 밝혀지지 않았다.창상 치유 과정은 첫째,염증과 섬유화 유도 단 계,두 번째,재생 단계,세 번째 리모델링 단계의 세 가지로 구분된다 (18). 이 세 가지 단계 중에,세포 부착과 이동은 조직 재생에서 중요한 과정이다.

그러므로 이 연구에서 TLR2의 활성화가 MDPC-23세포 부착과 이동에 미 치는 영향을 실험하였다.

사람 상아모세포에서 TLR1-6과 TLR9이 기능적으로 발현한다는 보고가

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되었다 (3).Lipopolysaccharide (LPS)가 NF-κB의 핵의로의 전사의 유도와 TLR4의 증가를 유전자와 단백질 발현을 증가시킨다.이 연구에서,생쥐 치유 두에서 유래된 MDPC-23세포를 사용하였다.MDPC-23 세포에 Pam3CSK를 처리하여 TLR2의 발현을 확인하였고, IκB-α의 인산화 및 MAPK 신호의 증가를 확인하였다.이 결과는 MDPC-23세포에서 TLR2가 기능적으로 작용 을 한다는 것을 나타낸다.세포 부착과 이동 분석에서 Pam3CSK 자극이 MDPC-23 세포의 부착과 이동의 증가에 영향을 미치는 것을 확인하였고, TLR2항체를 사용하여 TLR2의 기능을 억제하였을 때 세포 부착과 이동이 억제됨을 확인하였다. 이러한 소견은 상아모세포의 조직 재생 과정에서 TLR2가 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.

이전의 연구에서 Porphyromonas gingivalis fimbriae가 Phosphoinositide 3-kinase (PI3K)신호를 통해 세포 부착에 영향을 미친다는 보고가 있었다 (19).PI3K는 Focaladhesion kinase(FAK)의 신호를 조절한다고 알려져 있 고,이러한 FAK는 integrin에 의해 조절되는 신호를 조절한다 (20,21).이러 한 ligand를 통한 integrin에 신호가 전달되면,FAK가 인산화가 되고,Akt, ERK,JNK와 같은 하위 신호들의 인산화가 유도된다.이 연구에서는 β 1-integrin의 신호는 확인하지 않았지만,Pam3CSK에 의한 MAPK 신호들의 변화를 관찰하였고,앞으로 명확한 메커니즘에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다.

결론적으로,이 연구를 통해 Pam3CSK가 TLR2ligand를 통해 MAPK 하 위 신호를 거쳐 생쥐 치유두에서 유래된 MDPC-23세포의 부착과 이동의 증 가에 영향을 미치는 것을 확인하였고,이 결과는 TLR2가 치아 재생에 중요 한 역할을 할 것이라고 생각된다.상아모세포에서 지금까지 여러 TLR 신호 의 발현을 확인하였고,이러한 TLR 신호는 상반된 효과를 나타내고 있기 때 문에,이러한 결과를 바탕으로 상아모세포의 여러 종류의 TLRs이 어떻게 조 절되는지에 대한 연구를 통해 조직 재생 과정에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다.

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저작물 이용 허락서

학 과 치의학과 학번 20117150 과정 석사

성 명 한글:신 동 은 한문:申 東 恩 영문:Shin Dong Eun 주 소 서울 양천구 신정동 1307번지 경남아너스빌 1503동1103호 연락처 e-mail : 145125@hanmail.net

논문 제목

한글 : TLR2의 활성이 MDPC-23 세포의 부착과 이동에 미치는 영향

영문 : TLR2 activation promotes adhesion and migration of murine dental papilla derived MDPC-23 cells

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- 다 음 -

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3. 배포ㆍ전송된 저작물의 영리적 목적을 위한 복제, 저장, 전송 등은 금지 함

4. 저작물에 대한 이용기간은 5년으로 하고, 기간종료 3개월 이내에 별도의 의사 표시가 없을 경우에는 저작물의 이용기간을 계속 연장함

5. 해당 저작물의 저작권을 타인에게 양도하거나 출판을 허락을 하였을 경 우에는 1개월 이내에 대학에 이를 통보함

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7. 소속 대학의 협정기관에 저작물의 제공 및 인터넷 등 정보통신망을 이용 한 저작물의 전송ㆍ출력을 허락함

동의여부 : 동의( ○ ) 반대( )

2012년 11월 일

저작자: 신 동 은 (인)

조선대학교 총장 귀하