Vol. 10, N o. 2, June, 2003
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2003 2 12 , 2003 3 31
50
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( R01-2000-000-00093-0) .
Objective: The rheumatoid synovium is a hypoxic environment and hypoxia has been implicated to have a role in the pathogenesis of rheumatoid arthritis (RA). In this work, we tried to investigate the effect of hypoxia on the expression of matrix metalloproteinase (MMP)-1, -3 and tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP)-1 in rheumatoid and osteoarthritis (OA) fibroblast-like synoviocytes (FLS).
Methods: FLS obtained from RA and OA patients were cultured under normoxic or hypoxic condition for 48 hours. Western blot analyses for MMP-1, -3 and TIMP-1 were performed. TIMP-1 mRNA levels were measured by Northern blot analysis.
Results: Hypoxia increased MMP-1 expression in rheumatoid FLS compared with normoxia.
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TIMP-1 expression was decreased by hypoxia in rheumatoid FLS in both protein and mRNA levels. On the other hand, hypoxia did not significantly affect MMP-1, -3 and TIMP-1 expressions in OA FLS.
Conclusion: These results suggest that microenvironment such as hypoxia may directly contribute to joint destruction in RA by increasing the ratio of MMP-1 to TIMP-1 production in FLS.
Key Words: Hypoxia, Rheumatoid arthritis, Matrix metalloproteinase, Tissue inhibitor of metalloproteinase
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― 차훈석 외：저산소증에 의한 MMP 및 TIMP-1 발현 조절 ―
― 147 ― 고 찰
류마티스 활막의 여러 종류의 세포들 중에 FLS는 연골이나 골파괴에 있어서 가장 중요한 역할을 담당 하며 아교질분해효소, stromelysin, cathepsin 등 대부 분의 기질분해효소들을 생산한다2,16). 자극을 받지 않은 FLS에서는 이들 단백분해효소들이 적은 양으 로 상시적으로 발현되지만 IL-1이나 TNF-α 등과 같 은 시토카인에 노출되었을 경우 FLS에서 MMP의 발 현이 급속히 증가하는 것으로 알려져 있다19-22). 본 연구에서는 FLS에 대한 이러한 시토카인의 영향을 배제하기 위해 모든 실험에서 혈청을 제거한 배양액 을 사용하였다. 류마티스 FLS의 생물학적 행태에 있 어서 시토카인과 같은 주변의 자극 요인이 물론 중 요하지만 FLS 주위의 물리적 환경 또한 중요한 영 향을 미치리라 생각된다. 이런 점에서 만성 염증성
관절염에서 활막이 놓여져 있는 저산소 환경은 류마 티스 관절염의 병태생리를 이해하는 데 있어서 중요 한 요소이다. 류마티스 관절염에서의 활막이 저산소 상태에 있다는 증거로는 간접적으로는 류마티스 활 막 조직에서 정상 활막 조직에 비해 해당작용 경로 (glycolytic pathway)가 활성화되어 있다는 점과6,23,24), 직접적으로는 류마티스 관절염 환자들의 활액 및 활 막 조직에서 측정한 산소 분압이 골관절염 및 정상 인에 비해 낮고 관절염의 정도가 심할수록 산소 분 압이 낮다는 점을 들 수 있다25-27).
저산소증은 류마티스 활막에 다양한 영향을 줄 수 있다. 관절의 운동으로 활막에 허혈-재관류 손상 (hypoxic-reperfusion injury)이 발생하면 반응성 산소 종이 형성되어 활막의 고분자에 손상을 주고 관절염 을 악화시킬 수 있다8-10). 또한 근래에 저산소증은 류마티스 관절염에서 판누스 형성에 필수적이라고 생각되는 신혈관생성에 있어서 중요한 역할을 하리 Fig. 3. Effect of hypoxia on TIMP-1 mRNA expression in rheumatoid and OA FLS. A. FLS obtained from seven RA
and three OA patients were cultured under normoxic (N) or hypoxic (H) conditions for 48 h. Twenty micrograms of total RNA isolated from the cell cultures were loaded per lane and analyzed by Northern blotting. To confirm the hypoxic condition, GAPDH expression was examined under the same condition. 18S and 28S rRNA were used to normalize the equal loading amounts. B. Quantitative analysis of TIMP-1 mRNA and 28S rRNA was performed by densitometry. The results are expressed as the ratio of TIMP-1 mRNA to 28S rRNA. Data are presented as mean±SEM. *p＜0.01.
A
N H N H N H N H N H N H N H N H N H N H
RA OA
TIMP-1
GAPDH 28S 18S
TIMP-1 mRNA/28S rRNA ratio
2
RA OA
Hypoxia Normoxia
0 2.5
1.5 1 0.5
B
― 대한류마티스학회지 제 10 권 제 2 호 2003 ―
― 148 ― 라고 생각되고 있다. 즉, 류마티스 관절염에서 저산 소증은 시토카인(transforming growth factor- and in- terleukin-1)에 의한 FLS에서의 vascular endothelial growth factor 생성을 증폭시키는 것으로 보고된 바 있다28).
본 연구에서 저산소증은 Western blot 분석에서 보 여준 바와 같이 류마티스 FLS에서의 MMP-1 단백질 의 발현을 증가시켰다. 반면에 저산소의 배양조건은 류마티스 FLS에서 TIMP-1 발현을 현저하게 감소시 키는 사실을 알 수 있었다. 즉, 류마티스 FLS에서의 TIMP-1은 저산소증에 의해 단백질 및 mRNA 수준 에서 일관되게 감소되는 것을 관찰할 수 있었다. 류 마티스 관절염에서 골 및 연골의 파괴가 궁극적으로 MMP 및 TIMP 체계의 균형에 의해 결정된다는 점 을 상기하면 저산소증으로 인한 MMP-1의 발현 증 가와 TIMP-1 발현의 감소는 MMP/TIMP-1 비의 증가 를 초래하여 관절 파괴에 기여할 수 있을 것으로 생 각된다. TIMP-1에 대한 Northern blot 분석에서 본 실험에서는 mRNA 정량의 내부 기준으로 28S rRNA 를 사용하였는데 그 이유는 저산소 배양 조건에서 GAPDH는 해당 경로의 활성화로 인해 발현이 증가 하는 반면 28S rRNA는 저산소 배양 조건과 상관없 이 일정하게 발현되는 것으로 보고되었기 때문이다18). 실제로 본 연구에서 저산소 조건하에서는 류마티스 및 골관절염의 FLS에서의 GAPDH 발현이 증가하는 것을 관찰할 수 있었고 이는 본 연구에서의 저산소 실험 조건이 실제로 저산소 환경을 제공하였다는 사 실을 반증한다고 할 수 있으리라 생각된다. 또한 저 산소 상태하에서 p53, p21, Bax 단백질 등의 아포프 토시스에 관여하는 유전자의 발현이 증가하지 않은 소견으로 저산소증에 의한 TIMP-1 발현의 감소가 아포프토시스와 연관되어 있지 않다는 사실을 알 수 있었다.
Western blot 분석에서 보는 바와 같이 MMP 발현 의 양상은 각각의 재료에 따라 다소 차이가 있음을 알 수 있었다. 그 이유는 활막조직을 얻은 환자들의 유전적인 배경이 다르고 질병 활성도나 유병기간 등 의 차이가 있기 때문일 것으로 추정된다. 이러한 개 개 환자의 특성에 따라 저산소증에 대해 반응하는 FLS의 반응에도 차이가 있을 것으로 생각된다.
MMP나 TIMP의 생산에 미치는 저산소증의 영향
은 세포의 종류나 실험의 조건에 따라 다양한 것으 로 보고되고 있다. 저산소 분압은 인체 영양막(tro- phoblast)에서 젤라틴분해효소의 활성을 증가시키는 것으로 보고된 바 있으며29), 인체 각질세포(kera- tinocyte)에서 저산소증은 92-kDa type IV 아교질분해 효소의 분비를 증가시킴으로써 결체조직에서의 활동 성을 증가시키는 데 공헌을 하는 것으로 알려져 있 다30). 또한 신생아 쥐 심근세포(neonatal rat cardio- myocytes)를 저산소 상태에서 배양했을 때 심근세포 에서의 92-kDa 아교질분해효소의 생산이 증가된다31). 반면에 이와 일치하지 않는 보고들도 있는데, 저산 소증은 횡문근육종 세포주(rhabdomyosarcoma cell line)를 제외한 다양한 종양 세포주에서 MMP-9의 생 성을 증가시키지 않았으며32), 정상 인체 피부 섬유 모세포에서 MMP-3는 저산소 상태에 의해 감소되는 것으로 보고된 바 있다33). 또한 신장 섬유모세포에 서 저산소증은 시간에 비례하여 TIMP-1 mRNA 발 현의 양을 증가시키는 것으로 보고되었다34). 그러나 현재까지 류마티스 관절염의 FLS에서 저산소증이 MMP나 TIMP의 발현에 어떠한 영향을 주는지에 대 해서는 알려진 바가 없었다.
저산소 환경이 류마티스 FLS에서 MMP-1 발현을 증가시키고 TIMP-1 발현을 감소시키는 기전은 본 연구를 통해서는 알기 어렵다. 그러나 FLS가 아닌 다른 세포에서 이루어진 몇몇 연구 결과들을 통해 그 기전을 추정해 볼 수는 있을 것으로 생각된다.
저산소증은 혈관내피세포에서 IL-1 mRNA의 발현을 증가시키는 것으로 보고되었으며35) 인체 말초혈액 단핵세포에서 IL-1 및 TNF-α의 생산을 증가시키는 것으로 보고된 바 있다36). 저산소증은 또한 인체 대 식세포 세포주에서 TNF-α와 TNF-α의 용해 수용체 (soluble receptor)의 분비를 유도한다37). 저산소 환경 은 류마티스 FLS에서 TNF-α나 IL-1, 또는 그 밖의 시토카인의 발현을 유도할 가능성이 있고 분비된 시토카인이 다시 FLS를 자극함으로써 MMP나 TIMP 발현에 영향을 미칠 가능성이 있을 것으로 생각된 다. 실제로 저자들은 최근 저산소증에 의해 류마티 스 FLS에서 IL-6와 IL-8의 분비가 증가되고 류마티 스 FLS에 IL-6나 IL-8을 처리하였을 경우 MMP-1, -2, -3의 발현이 증가하는 것을 관찰한 바 있다38). 본 연구에서 저산소 환경에 의한 FLS에서의 MMP-1 발현
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― 149 ― 의 증가와 TIMP-1 발현의 감소는 류마티스 FLS에서 는 특징적이었지만 골관절염 환자로부터 얻은 FLS 에서는 뚜렷하지 않았다. 류마티스 FLS의 저산소증 에 대한 반응이 골관절염 FLS에서와 구별되는 이유 는 아마도 류마티스 FLS이 이미 많은 연구자들에 의해 주장되어온 바와 같이 변형된 형질을 지니고 있기 때문일 것으로 추정된다1). 저산소증에 의해 MMP 및 TIMP 발현이 변화하게 되는 세포 내 기전 에 대하여는 추후 연구가 필요할 것으로 생각된다.
결 론
류마티스 관절염에서 FLS이 실제로 놓여져 있는 생체 내 환경은 흔히 실험실에서 류마티스 관절염에 대한 연구를 위해 FLS를 배양하는 생체 외 정상 산 소 분압 상태와는 다르다. 따라서 류마티스 관절염 의 병태생리에 있어서 FLS의 역할에 관해 연구하고 자 할 때 시토카인 등의 영향뿐만 아니라 저산소증 이나 허혈-재관류와 같은 FLS 주변의 물리적 환경에 대한 고려도 반드시 필요하다고 판단된다. 본 연구 를 통해 저산소증과 같은 미세환경이 실제로 류마티 스 FLS에 작용하여 골 및 연골 파괴에 가장 중요한 효소인 MMP 및 TIMP-1 발현에 영향을 주는 것을 알 수 있었다. 즉, 저산소증은 류마티스 FLS에 작용 하여 MMP-1의 발현은 증가시키는 반면 TIMP-1의 발현을 감소시킴으로써 류마티스 관절염의 진행에 직접적인 영향을 줄 수 있을 것으로 생각된다.
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