Establishment of ethanol-pretreating animal model to study Helicobacter pylori infection

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Helicobacter pylori의 in vivo 연구를 위한 ethanol-pretreating animal model의 개발

이진욱·김승희·박탄우¹·김옥진^1,*

서울대학교 의과대학 실험동물학교실, ¹원광대학교 생명자원과학대학 동물질병연구실 (게재승인: 2006년 9월 19일)

Establishment of ethanol-pretreating animal model to study

Helicobacter pylori infection

Jin-Uk Lee, Seung-Hee Kim, Tan-Woo Park

¹

, Okjin Kim

^1,

*

College of Medicine, Seoul National University, Seoul 110-799, Korea

1College of Life Science and Natural Resources, Wonkwang University, Iksan 570-749, Korea

(Accepted: September 19, 2006)

Abstract : A stable and reliable

Helicobacter pylori

(

H. pylori

) infection animal model would be necessary for evaluating vaccine efficacy and helpful for understanding the pathological mechanism of the organism.

The aim of the present study is to investigate the effect of ethanol treatment prior to

H. pylori

inoculation on associated gastric mucosal injury and to establish ethanol-pretreating animal model to study

H. pylori

infection. Male Mongolian gerbils were used for the study.

H. pylori

was orally inoculated after 12 h fasting.

3 h prior to

H. pylori

inoculation, a group of gerbils was orally treated with absolute ethanol, 60% and 40% ethanol respectively. Another group of animals was treated either with

H. pylori

culture media alone or with different concentrations of ethanol plus culture media. Gerbils were killed 4 or 8 weeks after

H.

pylori

inoculation. The colonization of

H. pylori

was confirmed by both histological examination and rapid urease test. Mucosal damage was evaluated grossly and histologically according to the criteria. The colonization of

H. pylori

and pathological changes in gastric mucosa of the animals were also observed.

Although no significant change to the gastric mucose was observed in the animals treated either with

H.

pylori

culture media alone or with different concentrations of ethanol plus culture media, persistent

H. pylori

infection was seen in the mucosa and mucosal leucocyte infiltration and severe epithelial damage was observed in the

Helicobacter

and ethanol +

Helicobacter

groups after 4 weeks. The gross and histological scores were higher in the ethanol +

Helicobacter

than in the

Helicobacter

alone group. As the results, ethanol- pretreatment with 60% concentration induced severe pathogenic changes by

H. pylori

infection in 5 weeks- old Mongolian gerbils. These results suggested that ethanol-pretreatment before

H. pylori

inoculation could increase the severity of gastric mucosal inflammation and enhance the colonization of

H. pylori

. The established ethanol-pretreating animal model would contribute to screen new drugs against

H. pylori

and be used as an useful tool for various animal experiments with

H. pylori

strains.

Key words : ethanol,

Helicobacter pylori

, mongolian gerbil, pathogenicity

*Corresponding author: Okjin Kim

College of Life Science and Natural Resources, Wonkwang University, Iksan 570-749, Korea [Tel: +82-63-850-6668, Fax: +82-63-850-7308, E-mail: [email protected]]

서 론

Helicobacter pylori

(

H. pylori

)

는급성및만성위염

,

소 화불량

,

^{흡수장애증}

,

^저산증

,

^위궤양

,

^{십이지장궤양}

,

^위

암및위림프종을유발하는병원체로알려져있다

[4-6,

20].

균과위궤양과의관련성에대한가설이

1975

년제

기된바있지만

, Marshall

^과

Warren

^{에의하여만성활동}

성위염환자의위유문부점막생검조직에서나선형의 만곡형그람음성간균을관찰하고분리배양에성공한 것은

1984

^{년의일이었다}

[14].

^{국내정상성인의H. pylori}

감염률은약

60-75%

정도로서구여러나라에비교하

여매우높은H. pylori 보균율을보이고있다

[2].

그러 나높은 H. pylori감염율에도불구하고대부분의감염

자에서증상이없고감염자중

20%

정도의일부환자

에서만위십이지장질환을유발하는것으로보고되고

있다

[13].

^{감염된환자들에서임상증상들의발현에대}

한이러한불일치한현상들을 H. pylori의병원성차이

(

병독인자

, virulence factor),

위내환경적요인에따른차 이

(

^환경인자

, environmental factor)

^{또는균에대한개인}

의유전적감수성차이

(

숙주인자

, host factor)

때문이라

는가설이제시되고있다

[12, 17].

이들가설을밝히기

위해서는 H. pylori와숙주간의면역현상

,

^{병리기전등}

에대한연구가필수적이지만임상에서감염환자의역 학자료가제한되어있기때문에연구가매우어려운상 황이다

. Hirayama

^등

[9]

^{이H. pylori}

ATCC 43504 strain

을

mongolian gerbil

에감염시켜병리소견이사람의것

과유사하다는것을보고한이후로현재H. pylori의in

vivo실험은

mongolian gerbil

^{을사용하여주로수행되고}

있다

[8].

H. pylori에감염된

mongolian gerbil

은사람의 위및십이지장에서유발되는병변과유사한상피세포

의병변과염증및궤양소견

[18]

^{을보이는것뿐만아}

니라다른동물모델에서는관찰할수없는만성감염의

유지에의한위암유발

[8, 18]

^{이가능한것으로보고되}

고있다

. Mongolian gerbil

^{이H. pylori}

ATCC 43504 strain

에의하여위점막에

colonization

이이루어지고만성감염

이유발되는것은사실이지만임상분리균주들에 대한

colonization

여부에대하여는단정할수없으며

, gerbil

에 H. pylori감염에의한위십이지장궤양병변의발현은 수개월 이상의기간이 소요되는것으로 알려져있어

mongolian gerbil

을이용하여 H. pylori 균주들의병원성

차이를알아본다는것은장기간의시간소요가요구되

어지는문제점을안고있다

[8].

^{따라서보다안정적이}

고신뢰할수있는동물모델의개발이H. pylori 균주들 의감염실험을위하여요구되어지고있다

.

한편

,

설치류 를이용한위염및위궤양유발을위하여랫드를이용 한에탄올모델이위염및위궤양치료제의 in vivo 약

효검색을위하여자주이용되고있다

[16, 19].

^그러나

mongolian gerbil

^{에서에탄올에의한위염및위궤양유}

발양상에대한유용한자료들은많지않은실정이다

.

알콜은위점막손상을유발하는인자들중의하나이며

고농도 알콜의 섭취는

acute gastric mucosal lesions

(AGML)

으로위점막상피세포의손상뿐아니라 점막

의손실도유발하는것으로알려져있다

[11].

^알콜과H.

pylori는단독으로는분명한위장관손상의위해인자이 지만이들두개인자가복합적으로작용할때에위해여 부에대한해석에대하여는연구그룹에따라불일치한

결과들이보고되고있다

[3, 21].

따라서알콜섭취후

H. pylori 감염에대한연구가필요한실정이다

.

본연구는 H. pylori 동물실험을위한안정적이고신 뢰할수있는동물모델개발을개발하고자수행되었다

.

또한본연구를통하여알콜섭취에의한

AGML

이H.

pylori감염에끼치는영향에대하여알아보고자하였다

.

재료 및 방법

실험동물

서울대학교의과대학실험동물실에서특정병원체부재

(specific-pathogen free)

^{의상태로계통이유지되고있는}

mongolian gerbil(

Meriones unguiculatus

)

을

4

주령에공급 받아

1

주일동안순화사육한후실험에사용하였다

.

사 육기간중온도는

23

^±

1

^o

C,

^습도

50

^±

5%,

^소음

60 phone

이하

,

조명시간

08:00-20:00(1

일

12

시간

),

환기시간당

10-12

^회의

SPF

^{환경에서사육되었으며}

,

^{사료는실험동}

물전용사료

(

^퓨리나

,

^한국

)

^를

2.0 Mrad

^{의방사선으로멸}

균시켜자유급식시켰으며

,

음수는자외선멸균수를자 유급수하였다

.

H. pylori 배양

H. pylori

(ATCC 43504, American Tissue Culture Collec-

tion, USA)

^균주를

10% calf serum

^{이첨가된브루셀라}

한천배지에접종후

, 10% CO

²

, 100%

습도가유지되는

37

^o

C

^{항온기에서}

3

^{일간배양하였다}

.

^{배양된H. pylori를}

멸균된

PBS(pH 7.2)

가들어있는튜브에모은후

, 1 ml

당

2.0

×

10

⁹

colony-forming unit(CFU)

의균수를포함하 게준비하여실험에사용하였다

.

Ethanol-pretreating 효과 평가

1

^{주일간의순화사육후}

5

^{주령의건강한수컷}

mongo-

lian gerbil

을시험에사용하였다

. Ethanol-pretreating

에의 한위점막의변화를 평가하고자

100%, 60%, 40%

및

20% ethanol

^{을각농도투여군으로군분리하여}

,

^각군

당

6

두를 사용하여 군 구성을 수행하였다

.

분류된

mongolian gerbil

^을

12

^{시간절식시킨후}

,

^{각농도별로에}

탄올

0.5 ml

^{씩을각각의개체에경구투여하고각군당}

2

두씩

1

시간

, 2

시간 및

3

시간 후에

,

각각의동물들을

ether

^{마취하에치사시킨후위를적출하여위내강에}

알콜잔류여부를알아보고육안및병리조직학적검사 를수행하여위점막의변화를알아보았다

.

Ethanol-pretreating

^{에의한위점막변화가H. pylori감}

염에끼치는영향을알아보고자각군당

10

두의동물들 을사용하여

PBS

적용후

culture media

투여군

(PBS + media), PBS

^적용후H. pylori 감염군

(PBS + Hp), 100%

ethanol

적용 후

culture media

투여군

(100% ETOH + media), 60%

에탄올적용후

culture media

투여군

(60%

ETOH + media), 40% ethanol

^적용후

culture media

^투

여군

(40% ETOH + media), 100% ethanol

적용 후 H.

pylori 감염군

(100% ETOH + Hp), 60% ethanol

적용후 H. pylori 감염군

(60% ETOH + Hp), 40% ethanol

^적용후

H. pylori 감염군

(40% ETOH + Hp)

의

8

개군으로나누 어실험을수행하였다

.

실험에사용된

5

주령

mongolian

gerbil

^을

12

^{시간절식시킨후각군별로}

PBS

^또는정해

진농도의에탄올을개체당

0.5 ml

씩경구투여하고

3

시

간후

,

군에따라

media

또는

1 ml

당

2.0

×

10

⁹

CFU

의 균수가포함되게준비된 H. pylori 배양액을두당

0.5

ml

씩마우스용존대를이용하여경구로투여하여 H.

pylori 감염을유발하였다

.

투여후각군의동물들은

6

시간의절식후사료를급여하였다

.

^{절식동안에음수는}

자유급이할수있도록하였다

.

각군의동물들은

4

주 및

8

^{주후에 각군의}

5

^마리씩을

12

^{시간절식시킨후}

ether

^{마취하에치사시킨후위와십이지장을적출하여}

육안병변점수를구하고

,

추가적인병리조직학적검사 를통하여조직병변의점수를산정하였다

.

또한

,

각개 체의위유문부점막일부를무균채취하여H. pylori의

colonization

을확인하기위한신속요소분해효소검사를

수행하였다

.

육안병변의 점수 산정

각시험군별로에탄올투여후적출된위는위의대 만부를따라절개하여펼친후에실체현미경

(

×

10)

을사 용하여병변을관찰하고

,

육안병변의점수를산정하였 다

.

^{육안병변의점수는각병변의}가로길이 × 세로길이

(mm

²

)

의총합으로계산하였다

.

각개체의점수를구한 후각군별로평균점수를구하였다

.

병리조직학적 검사

위점막의병리조직학적검사를위하여적출된위의

일부를

10%

^{중성포르말린에고정하고}

,

^선위

(glandular

stomach)

부위를가로방향으로

5 mm

간격으로잘라

,

개

체당

3

^{개부위를선정하였고}

,

^{이때선별된부위들은}

다른개체들간에서로동일한부위가되도록주의하여 선정하였다

.

선정된부위들의조직들은병리조직학적검 사를위한통상적인방법을사용하여파라핀포매한후

, 4

^µ

m

^{두께로절편하여}

hematoxylin and eosin(H&E)

^염

색후병리조직학적인검사를수행하였다

.

각조직소견

의병변에대한평가를수행하여

0: no lesion, 1: mild,

2: moderate, 3: severe

로점수를나누어기록하고

,

개체

당

3

개부위의점수의합을구하여 개체의

histologic

lesion score

^를구한후

,

^{각군의평균점수를구하였다}

.

신속요소분해효소검사

신속요소분해효소검사는무균적으로적출한위유문 부

2

부위와위체부의점막

1

부위씩의조직을채취하여

ASAN Helicobacter Test(

아산제약

,

한국

)

에각각을넣고 제조회사의설명서에따라배양하여노란색배지가적 색으로변하는경우를양성으로판정하였다

(Fig. 2).

검 사과정을간략히설명하면미리실온에방치한시약을 노란색한천겔이보이도록스티커를벗긴후무균바 늘을사용하여위점막조직을겔속에밀어넣고스티커 를다시덮은후동물번호와시간을기입하고

37

^o

C

의 따뜻한곳에서

2

^{시간동안반응시키며반응후}

1

^시간

및

2

시간에판독하였다

.

판독의결과노란색에서적색 까지색깔의등급을

3

단계

(Yellow: 0, Orange: 1, Pink:

2, Red: 3)

^{로나누어각각의점수를구하고개체당}

3

^개

부위의점수의합을구하여개체의신속요소분해효소검 사점수를구한후

,

^{각군의평균점수를구하였다}

.

결 과

Ethanol-pretreating

에의한위점막의변화를평가하고

자

100%, 60%, 40%

및

20% ethanol

을적용후

1

시간

,

2

^시간및

3

^{시간에위점막의변화를평가한결과는}

Table

1

^과같았다

.

^{에탄올투여후}

1

^{시간에는농도에상관없이}

투여된에탄올이다량위내강에저류되어있었다

.

에탄 올경구투여에의하여유발된위병변은선위부위에암 적색출혈병변을동반한궤양병소의산재가특징적이 었으며

,

에탄올농도의증가와상관적으로궤양병소들

의면적들도증가되는것을알수있었다

. 100%

^에탄올

적용에의하여매우심한위궤양병변들이유발되었으 며

,

위내강내에투여알콜과암적색혈액응고괴를포 함한 삼출물들이차있는소견이관찰되었다

. 60%

^및

40%

에탄올적용에의하여유도된병변들은그정도가

100%

에탄올 적용에비하여현격하게감소되었다

.

에

탄올투여에의한점막의병변은조직학적으로궤양

,

^미

란

,

위점막부종등의

AGML

소견이관찰되었다

. 20%

에탄올투여에의해서는위점막의변화를관찰하기어 려웠다

.

에탄올투여후

2

시간후에관찰된결과들은

1

시간에관찰된개체에비교하면소량이지만위내강에 는투여된에탄올로추정되는물질들이저류되어있었으 며

,

각개체들의병변들은투여

1

시간에관찰한병변들 과유사하였다

(Table 1).

에탄올투여후

3

시간후에관 찰된결과들은위내강에서투여된에탄올로추정되는 물질들은발견되지않았으며

,

각개체들의병변들은현

저히경감된것을알수있었다

(Table 1).

Ethanol-pretreating

^{에의한위점막변화가H. pylori감}

염에끼치는영향을알아보고자에탄올투여후

3

시간 에H. pylori 감염시킨후

4

^주와

8

^{주에위점막의변화를}

평가한 결과는

Table 2

^와

Table 3

^과같다

.

H. pylori 세 균의

colonization

은감염후

4

주와

8

주모두Helicobacter

감염군들인

PBS + Hp, 100% + Hp, 60% ETOH + Hp

및

40% ETOH + Hp

군의동물들에서신속요소분해효소검

사법과조직학적으로위점막의세균콜로니들로확인할 수있었다

.

이들결과로부터Helicobacter감염군들은투 여된 H. pylori 세균이소실되지않고

gerbil

^들의위점

막에 정착하여

colonization

^{되어 있음을알수있었다}

.

PBS + media, PBS + Hp, 100% ETOH + media, 60%

ETOH + media, 40% ETOH + media, 100% ETOH + Hp, 60% ETOH + Hp, 40% ETOH + Hp

^의

8

^{개군으로나누}

어수행된실험결과에탄올만투여된군들의동물들에 서에탄올투여후

2

^{시간에관찰되었던}

AGML

^관련소

견은

4

^주및

8

^{주에육안적으로관찰할수없었다}

(Table 2). PBS + Hp

군과

100% ETOH + Hp

군의동물들은

4 Table 1. Gastric changes after inoculation of different concentration of ethanol

Gastric lesions 100% ETOH 60% ETOH 40% ETOH 20% ETOH

1 h 2 h 3 h 1 h 2 h 3 h 1 h 2 h 3 h 1 h 2 h 3 h

Alcohol in the lumen +++

^*

+

−

+++ +

−

+++ +

−

+

− −

Bleeding clots in the

lumen +++ ++ + + +

− − − − − − −

Ulcer +++ ++ ++ ++ + + +

− − − − −

Erosion +++ ++ ++ ++ + + + + +

− − −

Edema +++ ++ + ++ + + + +

− − − −

*

Lesion grade: +++; severe, ++; moderate, +; mild,

−

; no lesion Table 2. Gross lesion scores of stomach after ethanol

administration with or without

H. pylori

infection Group Inoculation

^a

Gross lesion scores

^b

Pretreatment

H. pylori

4 weeks

(n = 5) 8 weeks (n = 5)

I PBS No

^c

0 0

II PBS Yes 1.8 ± 0.58 2.3 ± 1.25

III 100% ETOH No 0 0

IV 60% ETOH No 0 0

V 40% ETOH No 0 0

VI 100% ETOH Yes 1.3 ± 0.74 2.1 ± 1.07 VII 60% ETOH Yes 12.7 ± 1.53 23.8 ± 2.51 VIII 40% ETOH Yes 6.0 ± 0.97 6.8 ± 1.46

a

Pretreatment was conducted 3 h before H. pylori inoculation.

b

Gross lesion scores were calculated with the sum of macro- scopic lesions.

c

The animals of this group were inoculated culture media alone instead of H. pylori .

Table 3. Histopathologic lesion scores of stomach after ethanol inoculation with or without

H. pylori

infection

Group Inoculation

^a

Histologic lesion scores

^b

Pretreatment

H. pylori

4 weeks

(n = 5) 8 weeks (n = 5)

I PBS No

^c

0 0

II PBS Yes 2.4 ± 0.55 2.8 ± 0.45

III 100% ETOH No 1.6 ± 0.55 0.9 ± 0.45 IV 60% ETOH No 1.4 ± 0.55 0.8 ± 0.55

V 40% ETOH No 1.2 ± 0.45 0.4 ± 0.45

VI 100% ETOH Yes 2.0 ± 1.41 2.6 ± 1.52 VII 60% ETOH Yes 4.8 ± 1.64 7.2 ± 1.64 VIII 40% ETOH Yes 3.6 ± 1.34 4.8 ± 1.64

a

Pretreatment was conducted 3 h before H. pylori inoculation.

b

Histologic lesion scores were calculated with the sum of his- tologic grades of 3 tissues in each animal.

c

The animals of this group were inoculated culture media

alone instead of H. pylori .

주및

8

^{주에일부동물들의위점막에산발적인국소충}

혈및경도의염증소견이국한적으로관찰되었을뿐실 체현미경하에서뚜렷한병변을관찰하기는어려웠다

(Fig. 1A ).

^반면

60% ETOH + Hp

^군과

40% ETOH + Hp

군의동물들은실체현미경하에서위점막의궤양및미 란

,

점막상피의증식성병변등을볼수있었으며

, 60%

ETOH + Hp

^{군의동물들에서이들병변은뚜렷하게관}

찰되었다

(Fig. 1B).

음성대조군으로사용된

PBS

적용후

culture media

투여군

(PBS + media)

에서는어떠한병변도 관찰되지않았다

.

병리조직학적으로도에탄올만투여된군들의동물들 에서에탄올투여후

2

^{시간에관찰되었던위점막상피}

세포의괴사및탈락과같은

AGML

^{관련소견은}

4

^주에

일부동물들에서매우경미한소견으로관찰되었고

8

주

에는대부분의동물들에서병변을관찰할수없었으며

lesion score

는매우낮았다

(Table 3).

이러한결과로부터 에탄올단독인자의작용에의한위점막의손상은시간 이경과됨에따라정상위점막상피세포로재생되어대

체되어 있음을 알 수 있었다

. PBS + Hp

군과

100%

ETOH + Hp

^{군의동물들은}

4

^주및

8

^{주에일부동물들의}

위점막층에염증세포의침윤과점액질분비증가소견이 관찰되었다

(Fig. 2A).

반면

60% ETOH + Hp

군과

40%

ETOH + Hp

^{군의동물들은병리조직학적으로위점막층}

에염증세포의침윤과위점막의궤양및미란

,

점막상피

세포의증식성병변등을볼수있었으며

, 60% ETOH

+ Hp

^{군의동물들에서병변의정도가다른군의동물들}

보다심한것을알수있었다

(Fig. 1B).

이러한결과로

부터에탄올로손상된위점막은이후감염되는H. pylori 의병원성을증폭시키는것으로판단되었다

.

^에탄올투

여에의한위점막손상후H. pylori 감염에의하여유

Fig. 2. Histopathological findings of stomach 8 weeks after

Helicobacter pylori

infection with or without ethanol pretreatment. A. PBS +

H. pylori

. Mild inflammatory cell infiltration in the mucous layer. H&E,

×

400. B. 60%

ethanol +

H. pylori.

Hyperplastic lesions and inflammatory cell infiltration in the mucous layer. H&E,

×

400.

Fig. 1. Gross findings of stomach 8 weeks after

Helico- bacter pylori

infection with or without ethanol pretreat- ment. A. PBS +

H. pylori

. There were several inflamatory lesions on the gastric mucosa. B. 60% ethanol +

H. pylori.

There were hyperplastic and inflammatory changes on the

gastric mucous layer. H&E,

×

400.

도되는병변의정도는

60%

^에탄올

, 40%

^에탄올

, 100%

에탄올순이었으며가장큰병증을보여주는에탄올모

델로는

60%

^{에탄올을적용하는 것임을알수있었다}

(Fig. 2B).

^{조직학적으로위점막의표면에서관찰되는세}

균들의수또한

60%

에탄올

> 40%

에탄올

> 100%

에탄 올순으로평가되었다

. 100%

^{에탄올투여후H. pylori}

감염은연구시작전의예상결과와다르게H. pylori 단

독감염

(PBS + Hp)

동물들과유사한정도의병변과위

점막층의세균수를보여주었다

.

^{같은군의동물들에서}

4

주와

8

주의관찰시점의차이와병변의차이를비교하

였을때

, 8

주에관찰하는것이다소높은

score

들을보

여주었다

(Table 3).

^{음성대조군으로}

PBS + media

^에서는

병리조직학적으로어떠한병변도관찰되지않았다

.

신속요소분해효소검사 결과는

Table 4

와같았으며

,

Helicobacter 감염군들인

PBS + Hp, 100% + Hp, 60%

ETOH + Hp

및

40% ETOH + Hp

군의동물들에서는 H.

pylori 세균의감염후

4

주와

8

주모두양성반응을관찰

할수있었다

(Table 4).

H. pylori 세균의 감염이없는

PBS + media, 100% ETOH + media, 60% ETOH + media

및

40% ETOH + media

군의동물들은시약의기질에변

화가없어노란색으로관찰되었다

(Fig. 3A).

^양성검체

들의발색정도차이를비교해본결과

60% ETOH + Hp

가짧은시간에강한발색반응을보이는것을알수있 었다

(Fig. 3B).

^반면

, 100% + Hp

^{군의검체들은}

PBS + Hp

군의검체들과유사한정도로발색의속도가늦고발색 정도도낮아 이들검체에 H. pylori의세균 수가

60%

ETOH + Hp

^군과

40% ETOH + Hp

^{보다도상대적으로낮}

게존재함을알수있었다

(Table 4).

같은군의동물들에

서

4

주와

8

주의관찰시점의차이와발색정도차이를 비교해본결과 H. pylori 감염군들에서

8

^{주에검사하는}

것이다소높은등급들을보여주었다

(Table 4).

고 찰

위십이지장질환환자에서항생제를이용한H. pylori

Table 4. Results of rapid urease test with gastric mucosal tissues after ethanol inoculation with or without

H. pylori

infection

Group Inoculation

^a

Rapid urease test

^b

Pretreatment

H. pylori

4 weeks ( n = 5) 8 weeks (n = 5)

1 h 2 h 1 h 2 h

I PBS No

^c

0 0 0 0

II PBS Yes 3.4 ± 0.55 6.0 ± 0.71 3.6 ± 0.55 6.2 ± 0.45

III 100% ETOH No 0 0 0 0

IV 60% ETOH No 0 0 0 0

V 40% ETOH No 0 0 0 0

VI 100% ETOH Yes 3.2 ± 0.45 3.4 ± 0.55 3.2 ± 1.30 3.4 ± 0.89

VII 60% ETOH Yes 6.4 ± 0.55 8.4 ± 0.89 8.2 ± 0.84 8.8 ± 0.45

VIII 40% ETOH Yes 3.4 ± 0.55 6.2 ± 0.84 5.6 ± 1.14 6.8 ± 0.84

a

Pretreatment was conducted 3 h before H. pylori inoculation.

b

Test scores were calculated with the sum of color grades of 3 tissues in each animal.

c

The animals of this group were inoculated culture media alone instead of ^{H. pylori} .

Fig. 3. Rapid urease test of gastic tissue 8 weeks after experiment. A. 60% ethanol + PBS. Negative result. The color of test reagent was not changed after 2 h incubation.

B. 60% ethanol +

H. pylori

. Positive result. The color of

test reagent became red after 2 h incubation.

의치료는위염및위궤양재발을낮출수있으나

,

^항생

제내성균주들의출현과

,

^{H. pylori의유병율이높기때}

문에치료후주변감염자들로부터흔히재감염이일어 나H. pylori의완전박멸은어려운것으로전망되고있 으며

,

^{다른대안으로병원성이높은균주를선별적으로}

선택하여

,

그균주에감염된환자들을선택적으로치료

하는방법들이현실적인것으로거론되고있다

[7, 15].

따라서 H. pylori의병원성차이를알아낼수있는시스 템의개발은H. pylori의연구에매우중요한의미를가 지고있으며

,

^{개발된시스템들을이용하여병원성이높}

은균주들의 선별과연구를통하여 H. pylori 병원성에 관련되는인자들의발견과고병원성H. pylori 균주의확 보를통한H. pylori 백신개발에기여할수있을것으

로기대되어진다

[7, 15].

또한

,

개발된시스템을통하

여고병원성균주에관여하는병독인자를알아내고알 아낸인자를표적으로하는약제개발과그를통한효과 적인질병발현전치료를얻어낼수있을것으로기대 되어지며

,

H. pylori 감염증의역학연구에있어서도기

존의역학

(epidemiology)

^{자료와차별화된병독인자를포}

함한고병원성 H. pylori 감염증의역학자료를산출해

낼수있을것으로기대하고있다

[12, 15].

또한궁극적

으로는 H. pylori에대하여강력한체액성면역과세포 성면역반응을유도할있는백신이개발되어야할것이 다

.

성공적인 백신 개발이 이루어진다면

Class I

carcinogen

^{으로분류되는 H. pylori감염의차단으로위}

암을예방할수있는획기적인성과를얻어낼수있을

것으로예상되고있다

[10, 15].

^암은

1983

^{년한국인의}

사망원인

1

^{위에처음오른이후사망률과발생률모두}

매년증가하고있으며

, 2002

년중암암등록통계에따르

면한국인전체암발생중위암은그발생율이성인남 성의

1

^위

(24%),

^여성의

2

^위

(15.3%)

^{를차지하는주요암}

으로분류되고있다

.

한국인의연간위암발생율은

10

만명당남성

57.9

^와여성

25.1

^{로보고되고있다}

[1, 2,

12].

^{한국인의위암발생율이다른나라사람들에비교}

하여매우높은발생율을보이고있으며

,

H. pylori에감

염율또한매우높은국가로분류되고있다

[1].

^암에대

한많은연구가진행되고있으나효과적인치료법은현 재까지도 확보되어있지 않은실정을 감안한다면 H.

pylori백신을통한

cancer prevention

^{은획기적인전기를}

마련하는계기가될것이다

.

그러나현재까지유전공학 기술을이용한백신이활발히연구되고있으나상품화

된백신은없는실정이다

[7, 15].

^{안정적이고신뢰할수}

있는H. pylori감염동물모델의확립은개발중인백신 후보들의효력검사및 H. pylori병리기전연구에필수 적이다

.

^또한

,

^{H. pylori}

eradication

^{을위한치료약제는}

metronidazole

과같이다른대부분의세균들에사용하는

약물과차이가많기때문에동물실험을이용한치료약 물후보물질의 in vivo효력검사는약물개발과정의매 우중요한단계이며

,

신뢰할 수있는동물모델의개발 및사용은성공적인약물개발을위한관건이다

[8, 15].

본연구자들은에탄올에의한위점막손상이 H. pylori 감염에미치는영향을알아보고그결과를이용하여안 정적인동물모델을개발하고자하였다

.

^{알콜과H. pylori}

감염의관계에대한연구결과들은현재불일치되는보 고들이 나오고있어 보다많은연구가필요한 실정이 다

.

^{본연구결과를통하여에탄올 투여후오랜시간}

동안위내강에 에탄올이잔류되어있다는것을 알았 다

.

본연구에서

ethanol-pretreating

에의한 H. pylori 감 염의영향을알아보기위한실험은투여된에탄올이모 두흡수된것으로확인된

3

시간후로정하였다

.

또한

20%

에탄올은위점막변화유발작용이낮은것으로판

명되었기때문에

ethanol-pretreating

^{모델에서배제하였}

다

.

위내강에잔류된에탄올의존재는유입된H. pylori 세균을죽이는항균작용으로작용할가능성이있다

.

따 라서위내강에에탄올잔류가없는시기에H. pylori 감 염을유발하는것은매우중요하며

,

에탄올투여후

3

시 간에 H. pylori 감염을유발하는

protocol

을확립하였 다

.

^{위내강에잔류된에탄올의존재는유입된H. pylori}

세균을죽이는항균작용으로가능성이있다

.

알콜과H.

pylori에관한불일치한연구결과들

[3, 21]

은 이러한이 유에기인할수도있을것으로생각되었다

.

^따라서위

내강에에탄올잔류가없는시기에H. pylori 감염을유 발하는것이매우중요하다는것을확인하였다

.

^본연구

를통하여에탄올투여후

3

^시간에H. pylori 감염을유

발하는

protocol

을확립하였다

.

본연구에서는에탄올

투여후흡수되어잔류되지않을충분한시간을확인하 고H. pylori 세균을감염시켰기때문에잔류에탄올에 의하여투여된 H. pylori가영향을받지않았을것으로 판단되었다

.

^연구결과

100% ethanol-pretreating model

^은

60%

^및

40% ethanol-pretreating model

^{보다병변의정}

도가낮았으며

,

조직에서관찰되는균의수도적어위점

막에

colonization

^{된H. pylori수도적을것으로추정되}

었다

.

이러한원인은고농도

ethanol-pretreating

에의한

AGML

의유발로대다수의위점막상피세포들이괴사되 거나탈락되어 H. pylori 세균의정착에부정적인효과 로작용하였을것으로추론되어진다

.

본연구의결과

60%

및

40%

에탄올로손상이유도된위점막은이후

감염되는 H. pylori의 병원성을증폭시키고 위점막에

colonization

이잘이루어지도록만드는것으로판단되었

다

.

병리조직검사및신속요소분해효소검사를통하여평

가하였을때

60%

^{에탄올투여후}

3

^{시간에H. pylori를}

감염시키는 것이가장효과적인동물모델로 생각되었

다

.

신속요소분해효소검사는위점막에H. pylori가존재 하는경우에검사시약의배지에서균이증식하면서요 소분해효소를분비하게되어검사시약에존재하는요소 를가수분해시키며암모니아를생성하여시약의전체

pH

^{가상승하게되고검사시약에포함되어있는}

pH

^지시

약이발색하여적색으로색깔의변화가일어나손쉽게 결과를판정할수있었다

.

신속요소분해효소검사가검사 에제출된위점막 H. pylori의존재유무를판정하는정 성적

(qualitative)

자료만제공하고정확한정량적

(quanti-

tative)

^{인정보를제공하는목적으로고안되지는않았지}

만

,

H. pylori의세균수가많으면배양시보다많은요 소분해효소가배출되기때문에검사시약의기질을보 다짧은시간에분해하여강한적색의발색반응을보 이기때문에발색시간의차이

,

발색정도의차이로간 접적인세균의수차이를비교할수있었다

.

에탄올투 여에의한위점막손상이어떤기전에의하여H. pylori 의감염에유리한환경을만드는지에대하여는알려진 바가없어이에대한연구들이필요할것으로사료된다

.

본연구결과로는에탄올투여에의한위점막손상후 H. pylori 감염에의하여유도되는병변의정도의차이는

60%

에탄올

, 40%

에탄올

, 100%

에탄올순으로가장큰

차이를보여주는에탄올모델로는

60%

^{에탄올을적용}

하는것임을알수있었다

.

투여후급성으로가장큰위

점막손상을유발하는것은농도가가장높은

100%

에

탄올인데급성손상의정도가크다고 H. pylori 감염에 유리하지는않다는것을본연구를통하여밝힐수있

었다

.

^매우심한

AGML

^{의경우에많은수의위점막상}

피세포가소실되어위내H. pylori

colonization

^이어려운

위내환경이조성되는것으로추정되며

,

보다정확한기 전에대한연구가필요하다

.

이러한결과들을바탕으로

5

^주령의

mongolian gerbil

^에

60%

^{에탄올적용후}

3

^시간

에뒤에H. pylori 균주들을감염시키는

ethanol-pretreating

animal model

^{을확립할수있었다}

.

^{본연구의결과들로}

부터확립된

ethanol-pretreating animal model

^{은동물실험}

을위해주로사용되는H. pylori 단독감염모델보다 안정적으로 H. pylori 감염이유도될수있으며

,

^위점막

층에

colonization

도보다높게유도될수있을것으로판

단된다

.

또한보다짧은시간에 H. pylori 단독감염모

델 보다 위점막에 병변이 유도되기 때문에

ethanol-

pretreating animal model

은H.pylori균주들의병원성비 교에매우유용한in vivo시스템으로사용될수있을것 으로 판단되었다

.

^향후

,

^{본 연구를 통하여 개발된}

mongolian gerbil

을이용한

ethanol-pretreating animal model

을이용하여여러H. pylori 임상분리 균주들의병원성 차이를비교하고

,

^{그결과분류된저병원성균주와고병}

원성균주와의분자생물학적차이를분석할예정이다

.

결 론

본연구의결과에탄올로손상된위점막은이후감 염되는H. pylori의병원성을증폭시키는것으로판단되 었다

.

^{에탄올투여에의한위점막손상후}H. pylori 감

염에의하여유도되는병변의정도의차이는

60%

에탄

올

, 40%

^에탄올

, 100%

^{에탄올순으로가장큰차이를}

보여주는에탄올모델로는

60%

에탄올을적용하는것

임을알수있었다

.

이러한결과들을바탕으로

5

주령의

mongolian gerbil

^에

60%

^{에탄올적용후}

3

^{시간에뒤에}

H. pylori 균주들을감염시키는

ethanol-pretreating animal

model

을확립할수있었다

.

본연구의결과들로부터확

립된

ethanol-pretreating animal model

^{은동물실험을위}

해주로사용되는 H. pylori 단독감염모델보다안정 적으로 H. pylori 감염이유도될수있으며

,

위점막층에

colonization

^{도보다높게유도될수있을것으로판단된}

다

.

또한보다짧은시간에H. pylori 단독감염모델보

다위점막에병변이유도되기때문에

ethanol-pretreating

animal model

^은H. pylori균주들의병원성 비교에매우

유용한in vivo시스템으로사용될수있을것으로판단 되었다

.

감사의 글

이논문은

2005

년도정부재원

(

교육인적자원부학술연

구조성사업비

)

으로한국학술진흥재단의지원

(KRF-2005

-003-E00262)

^{으로연구되었으며이에감사드립니다}

.

참고문헌

1. Ahn YO, Park BJ, Yoo KY, Kim NK, Heo DS, Lee JK, Ahn HS, Kang DH, Kim H, Lee MS, Park TS.

Incidence estimation of stomach cancer among Koreans.

J Korean Med Sci 1991, 6 , 7-14.

2. Baik SC, Kim JB, Cho MJ, Kim YC, Park CK, Ryou HH, Choi HJ, Rhee KH. Prevalence of

Helicobacter pylori

infection among normal Korean adults. J Korean Soc Microbiol 1990, 25 , 455-462.

3. Battaglia G, Di Mario F, Pasini M.

Helicobacter pylori

infection, cigarette smoking and alcohol consu- mption. A histological and clinical study on 286 subjects. Ital J Gastroenterol 1993, 25 , 419-424.

4. Blasser MJ. Gastric Campylobacter-like organisms, gastritis and peptic ulcer disease. Gastroenterol 1987, 93 , 371-383.

5. Cheng EH, Bermanski P, Silvermith M, Valenstein

P, Kawanishi H. Prevalence of

Campylobacter pylori

in esophagitis, gastritis, and duodenal disease. Arch Intern Med 1989, 149 , 1373-1375.

6. Correa P. Human gastric carcinogenesis: A multistep and multifactorial process-First American Cancer Society Award Lecture on Cancer epidemiology and prevention.

Cancer Res 1992, 52 , 6735-6740.

7. Del Giudice G, Covacci A, Telford JL, Montecucco C, Rappuoli R. The design of vaccines against

Helicobacter pylori

and their development. Annu Rev Immunol 2001, 19 , 523-563.

8. Hahm KB, Lee KM, Kim YB, Han SU, Kim MW.

Animal models of

Helicobacter pylori

infection. Korean J Gastroenterol 2001, 37 , 399-405.

9. Hirayama F, Takagi S, Yokiyama Y, Iwao E, Ikeda Y. Establishment of gastric

Helicobacter pylori

infection in Mongolian gerbils. J Gastroenterol 1996, 31 , 24-28.

10. I nternational Agency for Research on Cancer.

Schistosomes, liver flukes and

Helicobacter pylori

. IARC Monogr Eval Carcinog Risks Hum 1994, 61 , 188.

11. Kang JY, Teng CH, Wee A, Chen FC. Effect of capsaicin and chilli on ethanol-induced gastric mucosal injury in the rat. Gut 1995, 36 , 664-669.

12. Kim JM. Current researches on the virulence factors of

Helicobacter pylori

. Korean J Gastroenterol 2003, 41 , 77-86.

13. Lee SH, Lim CY, Lee KH, Yeo SJ, Kim BJ, Kim SJ, Cho MJ, Rhee KH, Kook YH. rpoB Gene analysis of

Helicobacter pylori

. J Korean Soc Microbiol 1999, 34 , 401-408.

14. Marshall BJ, Warren JR. Unidentified curved bacilli in the stomach of patients with gastric and peptic ulceration. Lancet 1984, 1 , 1311-1315.

15. Marshall BJ. The future of

Helicobacter pylori

eradication: a personal perspective. Aliment Pharmacol Ther Suppl 1997, 1 , 109-115.

16. Morimoto Y, Shimohara K, Oshima S, Sukamoto T.

Effects of the new anti-ulcer agent KB-5492 on experimental gastric mucosal lesions and gastric mucosal defensive factors, as compared to those of tprenone and cimetidine. Jpn J Pharmacol 1991, 57 , 495-505.

17. Newell DG. Virulence factors of

Helicobacter pylori

. Scand J Gastroenterol Suppl 1991, 187 , 31-38.

18. Ohkusa T, Okayasu I, Miwa H, Ohtaka K, Endo S, Sato N.

Helicobacter pylori

infection induces duodenitis and superficial duodenal ulcer in Mongolian gerbils. Gut 2003, 52 , 797-803.

19. Ramirez RO, Roa CC Jr. The gastroprotective effect of tannins extracted from duhat (

Syzygium cumini Skeels

) bark on HCl/ethanol induced gastric mucosal injury in Sprague-Dawley rats. Clin Hemorheol Micro- circ 2003, 29 , 253-261.

20. Stolte M.

Helicobacter pylori

gastritis and MALT- lymphoma. Lancet 1992, 339 , 745-746.

21. Sugiyama A, Ikeno T, Ishida K, Maruta F,

Murakami M, Sato T, Saito H, Ishizone S, Kawasaki

S, Ota H, Katsuyama T. Paradoxial role of

Helicobacter pylori

infection: protective effect against ethanol-induced

gastric mucosal injury in Mongolian gerbils. Dig Dis

Sci 2001, 46 , 2433-2449.