Isolation of Antifungal Activity Substance from Rheum australe D. Don Roots against Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Saccardo) Snyder & Hansen

(1)

장변대황( Rheum australe D. Don)으로부터 분리된 토마토 시들음병원균(Fusarium oxysporum f. sp.

lycopersici (Saccardo) Snyder & Hansen)에 대한 항진균 활성물질 구명

5)

최지수^*․이동운^**․최용화^***

Isolation of Antifungal Activity Substance from

Rheum australe D. Don Roots against Fusarium oxysporum f. sp.

lycopersici (Saccardo) Snyder & Hansen

Choi, Ji-Su․Lee, Dong-Woon․Choi, Yong-Hwa

To develop an environment-friendly fungicide for controlling tomato wilt diseases, antifungal active substance was isolated Rheum australe D. Don roots against Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, a pathogen of tomato wilt, in this study.

Methanol extract obtained from Rheum australe roots was successively fractionated with hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol and water. The ethyl acetate fraction, which showed the highest antifungal activity, was separated by column chromatography, and 60 subfractions were obtained. The 60 subfractions were anlayzed for antifungal activities by bioassay. The active compound was identified as 5-[(E)-2- (3-hydroxy-4-methoxyphenyl)ethenyl]benzene-1,3-diol (rhapontigenin) by NMR and GC-MS analysis. As a result of testing antifungal activity of rhapontigenin against Fusarium oxysporum, EC

₅₀

of rhapontigenin was showed strong antifungal activity at 7.48 mg/L. Therefore, this study showed that the Rheum australe roots extract can be a potential candidate which is a environment-friendly fungicide against Fusarium oxysporum.

Key words : antifungal active substance, Fusarium oxysporum, rhapontigenin, Rheum australe, tomato wilt disease

***

경북대학교 대학원 생태환경시스템학과

***

경북대학교 생태환경대학 생태과학과

***

Corresponding author, 경북대학교 생태환경대학 생태환경시스템학부([email protected])

(2)

Ⅰ. 서 론

Fusarium 속 균은 같은 종 내에서도 기주범위에 따라 분화형으로 분류되고 한 종내에서 도 70개 이상의 분화형이 존재하며(Booth, 1971; Armstrong and Armstrong, 1981), 오이, 토마 토, 고구마, 목화, 담배 등 200여 작물에 시들음병을 일으키고 식물의 지하부 및 지상부를 감염시켜 식물에 시들음병을 유발하는 불완전균류에 속하는 균으로 주요한 식물병원균이 다(Kim, 1999). Fusarium 속에 의한 병 발병은 기주의 감염부위나 환경조건 등에 따라 위황 병, 덩굴 쪼김병, 시들음병 등으로 나타난다. 그 중 시들음병은 오래된 잎의 황화와 관다발 조직의 갈변화, 점차 식물의 전체가 황화되고 높은 온도 에서는 시들은 현상이 나타나고 결국에는 죽게 된다(Jones et al., 1991). 특히 Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici에 의한 시 들음병은 유럽, 미국, 일본 등 전 세계적으로 발생하고 있고 병원균이 토양에 존재하는 미 생물 중에서 환경적응력이 높아 방제가 매우 어렵고 기주 범위 또한 매우 넓으며 저온이거 나 기주식물이 없어도 후벽포자로 토양 중에서 수년간 생존이 가능하기 때문에 밀도가 높 아 문제가 되고 있다(Matuo and Motohashi, 1967; Huang and Lo., 1998; Lee and Suk, 2001;

Garibaldi et al., 2002). 생강의 경우 Fusarium 속에 의한 생강뿌리썩음병으로 해마다 발생하 여 큰 피해를 주고 있다(Lee and Lee, 1998). 수박의 경우도 농림축산식품부의 통계에 따르 면 2017년에 과채류 전체 생산량의 약 22%을 차지하는 중요한 작물이나 Fusarium 속에 의 한 수박덩굴쪼김병으로 국내외 수박 재배포장에서 많이 발생하여 경제적으로 큰 피해를 입 히고 있다(Jo et al., 2017). 또한 농촌진흥청에 의하면 패션프루트는 Fusarium oxysporum에 의한 시들음병이 이식한 해에는 거의 발생하지 않으나 2~3년 후에 발생하며 현재로서 확실 한 방제 대책이 없고 토마토는 Fusarium oxysporum에 의한 시들음병 발병율이 2009년에 16~22% 으로 피해가 확산되고 있어 생산량 감소와 경제적 피해를 주고 있다고 보고되었다 (Park et al., 2013; Silva et al., 2013).

시들음병에 대한 방제법은 일반적으로 토양 훈증을 이용한 화학적 방제를 사용하며, 특 히 토양훈증제로 methyl bromide가 사용된다(Fravel et al., 2003). 그러나, 토양 훈증을 이용 한 화학적 방제는 인축에 대한 독성, 농약의 오남용으로 인한 환경오염, 생태계 파괴 등의 문제가 있다.

장변대황(Rheum australe)은 흔히 히말라야 루바브라고 불리며 부탄, 중국(남부 티베트 또

는 Xizang), 인도, 미얀마, 네팔 및 파키스탄 지역을 포괄하는 히말라야 지역의 고유종으로,

고도가 높은 풀밭이나 바위투성이 산기슭에서 자라고 고도가 3,200~5,200 m인 산림 끝자락

에서 자란다(Press et al., 2000; Li et al., 2003). 장변대황은 파키스탄, 네팔, 인도, 중국에서

57 가지의 질병에 대하여 민속적 의학으로 사용하였고 말라리아와 신장결석과 같이 심각한

질병이나 기침, 감기 등과 같은 간단한 증상을 치료하는 데에 사용되기도 하였다(Rokaya et

al., 2012). 장변대황 추출물의 경우 항암 작용(Rajkumar et al., 2010), 항당뇨 작용(Li and

(3)

Wang, 1997; Babu et al., 2004; Radhika et al., 2010), 항균 작용(Agarwal et al., 2000; Aqil and Ahmad, 2003; Babu et al., 2003), 항염 작용(Chauhan et al., 1992) 등의 연구가 보고되었다.

장변대황의 성분에는 chrysophanol, physcion, β-sitostreol, emodin, rheumin, piceatannol, rhapontigenin 등과 다양한 이차대사산물이 보고되었다(Wang et al., 2010). 그 중 resverastrol 과 구조적으로 유사한 스틸벤 화합물인 rhapontigenin은 항암, 항염, 항산화 작용 등 약리학 적 활동을 한다고 보고된 바가 있다(Frémont, 2000; Roberti et al., 2003; Larossa et al., 2004;

Park et al., 2004).

따라서, 본 연구에서는 시들음병의 화학적 방제 약제를 대체하기 위한 친환경 농자재 개 발을 목적으로 장변대황(Rheum australe)으로부터 분리된 물질을 대상으로 시들음병 병원균 인 Fusarium oxysporum에 대한 항진균 활성을 구명하였다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 실험재료

본 연구에서 사용한 토마토 시들음병원균은 Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Saccardo) Snyder & Hansen (KACC 40032) 을 농업유전자원센터로부터 분양받아 경북대학 교 대학원 생태환경시스템학과 천연물화학연구실에서 보관하면서 배양한 후 사용하였다.

식물재료인 장변대황은 네팔의 약재시장에서 건조된 지하부를 구매하여 사용하였다.

2. 시약 및 기기

용매분획과 silica gel column chromatography에서 사용된 시약 methanol (MeOH, 99.5%), n-hexane (95.0%), chloroform (CHCl

₃

, 99.5%), n-butanol (BuOH, 99.0%) 는 ㈜삼전순약공업, ethyl acetate (EtOAc) 는 ㈜덕산약품공업의 extra pure grade를, NMR 용매로 사용한 MeOD는 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, Mo, USA) 제품을 사용하였다. 균사생장 억제실험 대조약제로 metconazole 20% ( 살림꾼, 액상수화제, ㈜동방아그로)를 사용하였다. NMR spectrometer는 Varian Bruker 사(Billerica, MA, USA)의 DMX 600 (600 ㎒)을 이용하였고 내부표준물질은 tetramethyl silane (TMS) 을 사용하였으며, chemical shift는 ppm (δ)으로 나타내었다.

Bioassay 에 사용하였던 PDA배지는 Becton, Dickinson & Co. (Sparks, MD, USA)의 배지를 사

용하였고 filter paper (300 mm Ø, No. 2)는 Advantec사(Tokyo, Japan) 제품을 사용하였으며,

petri dish 는 SPL사(Gyeonggi-do, Korea) 제품을 사용하였다. Silica gel는 Merck사(Darmstadt,

Germany) 제품을 사용하였고 gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)는 Agilent사

(4)

(Santa Clara, CA, USA) 의 7890A 기종을, column은 HP-5MS capillary (Santa Clara, CA, USA) 를, detector는 Agilent사(Santa Clara, CA, USA)의 5975C 기종을 이용하였다.

3. 실험 병원균의 배양 조건

시들음병원균인 Fusarium oxysporum의 배양 배지는 PDA를 1 L 조건으로 petri dish에 조제 하였다. cork borer (8 mm)로 채취하여 배지의 중앙에 치상한 후 25℃에 7일간 배양하였다.

4. MeOH 용매추출

건조시킨 장변대황 지하부 시료 111.9 g을 blender (HMF-3260S; ㈜한일전기, Gangwon-do, Korea) 를 이용해 잘게 분쇄하고 99.5% MeOH 3 L로 실온에서 24시간 침지 후 추출하였으 며, 침지와 추출과정을 3회 반복하였다. 상등액을 filter paper를 사용하여 고형물을 걸러내 고 40℃에서 rotary evaporator로 감압 ․ 농축하여 MeOH 추출물 34.7 g을 얻었다.

5. 용매분획 및 생물검정

MeOH 추출물 34.7 g을 증류수 500 ml에 현탁시킨 후 hexane, CHCl

3

, EtOAc, BuOH 을 순 차적으로 용매분획하였다.

항진균 활성 탐색을 위하여 고압 멸균한 PDA배지 내 최종 농도가 100 mg/L이 되도록 MeOH 추출물과 순차적으로 용매분획한 hexane, CHCl

3

, EtOAc, BuOH fraction 들을 MeOH에 희석시켜 첨가한 다음 petri dish (60 mm × 15 mm)에 분주하여 평판배지를 만들었다. 평판배 지를 완전히 굳히고 cork borer (5 mm)로 채취한 시험 균주를 배지 중앙에 치상하여 25℃

incubator 에서 균주의 생장속도를 보며 항진균 활성 여부를 조사하였다.

6. 항진균 활성물질 분리 및 정제

활성이 가장 강한 EtOAc fraction으로부터 항진균 활성물질을 분리․정제하기 위하여 glass

column (30 mm × 800 mm) 에 silica gel (7734) 100 g을 충진 후 EtOAc fraction 15.1 g을

loading 하여 CHCl

3

: MeOH (9 : 1, v/v) 의 용매계로 isocratic elute 방식으로 순차 용출하여 10

ml 씩 subfraction들을 얻었다.

(5)

7. 항진균 물질 구조 구명

순수 분리한 ES-10 subfraction의 화학구조는 MS와

¹

H-NMR,

¹³

C-NMR spectral data 분석 으로 화합물의 구조를 해석하였다. GC/MS 분석은 ES-10 subfraction을 1000 mg/L 농도가 되 도록 acetone (HPLC grade, B&J, USA)에 희석한 후 분석하여 분자량([M]⁺)이 258임을 확인 하였다. NMR 분석은 10 mg ES-10 subfraction을 MeOD에 녹여 분석하였다.

Compound Ⅰ, yellow, EI-MS m/z; 258[M]+

1

H-NMR(600 MHz, MeOD) δ 7.01 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-2'), 6.94 (1H, dd, J = 2.4, 8.4 Hz, H-6'), 6.89 (1H, d, J = 16.2 Hz, H- α), 6.88 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5'), 6.79 (1H, d, J

= 16.2 Hz, H- β), 6.45 (2H, d, J = 1.8 Hz, H-2&6), 6.17 (1H, brs, H-4), 3.85 (3H, s, -OCH



), 13C-NMR(150 MHz, MeOD) δ 159.81 (C-3&5), 149.13 (C-4'), 147.84 (C-3'), 141.26 (C-1), 132.36 (C-1'), 129.51 (C- β), 128.00 (C-α), 120.18 (C-6'), 113.73 (C-2'), 112.87 (C-5'), 106.00 (C-2&6) 102.94 (C-4), 56.56 (-OCH

_

).

8. 균사생장 억제 실험

고압 멸균한 PDA 배지 내 최종 농도가 0, 2, 4, 6, 8, 10 mg/L이 되도록 ES-10 subfraction 와 시판되고 있는 대조약제인 metconazole 20% (살림꾼, 액상수화제, ㈜동방아그로)을 각각 첨가한 후 petri dish (60 ㎜ × 15 ㎜)에 분주하여 평판배지를 만들었다. 평판배지를 완전히 굳히고 cork borer (5 ㎜)로 채취한 시험 균주를 배지 중앙에 치상하여 25℃ incubator에서 7 일간 배양한 후 균사생장 억제능을 검정하였다.

9. 통계 분석 및 구조 분석

실험을 통하여 얻은 성적들은 SAS 프로그램 version 9.4 (SAS Institute Inc., Cary, USA)을 이용하여 EC

50

(effective concentration inhibiting by 50% of mycelial growth) 값과 유의성 검정 을 위하여 T-검정을 하였다.

Ⅲ. 결과 및 고찰

장변대황(Rheum australe) 지하부의 MeOH 추출물은 토마토 시들음병원균인 Fusarium

oxysporum 에 대하여 강한 활성을 나타내었다. 장변대황 지하부로부터 항진균 활성물질을

(6)

구명하고자 장변대황 지하부의 MeOH 추출물을 용매분획하여 hexane fraction 0.8 g, CHCl3 fraction 1.6 g, EtOAc fraction 15.1 g, BuOH fraction 5.7 g, aqueous layer 11.5 g 을 얻었다. 순 차적으로 용매분획하여 얻은 각각의 fraction들을 대상으로 100 ㎎/ℓ에서 항진균 활성을 검 정한 결과, EtOAc fraction에서 가장 강한 활성을 나타내었고 다음으로 CHCl3 fraction과 BuOH fraction 에서 강한 활성을 나타내었다(Fig. 1). EtOAc fraction과 CHCl3 fraction, BuOH fraction 을 GC-MS로 peak의 패턴을 비교분석한 결과, 세 GC chromatogram이 거의 동일한 패턴을 나타내었다. 따라서 EtOAc fraction을 대상으로 항진균 활성물질을 분리 및 정제하 였다.

Fig. 1. Antifungal activities of fractions from MeOH extract against F. oxysporum at 100 mg/L concentration A: Control; B: Hexane fraction; C: CHCl

3

fraction; D: EtOAc fraction; E: BuOH fraction; F: Aqueous layer.

15.1 g EtOAc fraction 을 silica gel (7734) 100 g이 충진된 open column chromatograph에 loading 하고 CHCl

3

: MeOH (9 : 1, v/v) 의 용매계로 isocratic elute 방식으로 순차 용출하여 10 ml 씩 60개의 subfraction을 얻었다.

60 개 subfraction들을 GC-MS로 확인하여 활성물질로 추측되는 물질들을 대상으로 항진균 활성검정을 진행한 결과 다른 subfraction들은 활성이 나타나지 않았고 ES-10 subfraction에 서 강한 활성을 나타내었다.

항진균 활성이 강한 ES-10 subfraction을 GC-MS로 분석한 결과, m/z 258에서 [M]

⁺

peak 가

(7)

검출되었고 주요 fragment ion으로 m/z 197, 225, 169 등이 검출되었다(Fig. 2, 3).

ES-10 subfraction 을 MeOD용매로 용해시켜 NMR로 구조분석하였다(Fig. 4, 5).

Fig. 2. GC chromatogram data of ES-10 subfraction isolated from R. australe roots.

Fig. 3. Mass spectrum data of ES-10 subfraction isolated from R. australe roots.

(8)

Fig. 4.

¹

H-NMR spectrum of ES-10 subfraction isolated from R. australe roots.

Fig. 5.

¹³

C-NMR spectrum of ES-10 subfraction isolated from R. australe roots.

1

H-NMR spectrum 을 분석한 결과, signal δ 7.01 (d, J = 2,4 Hz), δ 6.94 (dd, J = 2.4, 8.4

Hz), δ 6.88 (d, J = 8.4 Hz)에서 1,3,4-trisubstituted aromatic ring, δ 6.45 (2H, d, J = 1.8 Hz),

δ 6.17 (br)에서 1,3,5-trisubstituted aromatic ring, δ 3.85 (s)에서 aromatic methoxy가 관찰되

었으며, δ 6.88와 δ 6.79에서 나타난 coupling constant (J = 16.2 Hz)으로 trans double bond

임을 알 수 있었다.

(9)

13

C-NMR spectrum 을 분석한 결과, 15개 carbon에 상응하는 peak가 검출되었으며, δ 56.56 에서 methoxy carbon peak, δ 129.51, 128.00에서 CH



carbon peak, δ 120.18, 113.73, 112.87, 106.00 (2), 102.94 에서 CH carbon peak, δ 159.81 (2), 149.13, 147.84, 132.36에서 quaternary carbon peak 가 검출되었다.

1

H-NMR spectrum 과

¹³

C-NMR spectrum 을 분석한 장변대황 지하부로부터 순수 분리한 ES-10 subfraction 의 항진균 활성물질은 5-[(E)-2-(3-hydroxy-4-methoxy phenyl)ethenyl]benzene- 1,3-diol 로 구조동정하였으며(Fig. 6), 이 화합물의 구조해석은 Ko 등(1998)의 구조해석을 참 고하였다.

장변대황 지하부로부터 분리 ․ 정제하여 그 화합물의 구조가 밝혀진 5-[(E)-2-(3-hydroxy-4- methoxyphenyl)ethenyl]benzene-1,3-diol 화합물은 Roupe 등(2006)에 의해 Rheum undulatum 지 하부로부터 분리된 rhapontin의 aglycone이다.

Rhapotigenin 은 항산화, 항염증, 항암 효과를 나타내는 phenolic 성분을 가지고 있고(Roupe et al., 2005; Zhang et al., 2007) 항균 작용(Kim et al., 2010), 혈전증 및 알레르기 반응 억제 (Park et al., 2002) 가 강력하다는 보고가 있다.

Fig. 6. Chemical structure of antifungal active substance isolated from R. australe roots.

순수 분리한 rhapontigenin 화합물과 metconazole 20% (살림꾼, 액상수화제, ㈜동방아그로)

을 MeOH 용매에 녹여 최종농도가 0, 2, 4, 6, 8, 10 mg/L이 되도록 배지를 조성하여 배지

중앙에 고체배지에서 배양된 F. oxysporum 병원균을 치상하고 25℃ incubator에서 7일간 배

양 후 항진균 활성을 검정하였다(Fig. 7). 또한 항진균 활성에 대하여 EC₅₀ 값을 산출하고

(Table 1) 유의성 검정을 하였다(Table 2).

(10)

A B C D E F

Ⅰ

Ⅱ

Fig. 7. Antifungal activities of rhapontigenin (Ⅰ) isolated from R. australe roots and metconazole 20% (Ⅱ) against F. oxysporum at various concentrations A: Control;

B: 2 mg/L; C: 4 mg/L; D: 6 mg/L; E: 8 mg/L; F: 10 mg/L.

Table 1. EC

50

value of rhapontigenin and metconazole 20% against F. oxysporum

Samples

EC

₅₀

value (mg/L)

¹⁾

Average Minimum Maximum

Rhapontigenin 7.48 6.39 9.24

Metconazole 20% 0.89 0.58 1.17

1)Figures were EC₅₀ value (mg a.i. L^-1).

Table 2. Myceilal Inhibition rate of growth by rhapontigenin and metconazole 20% against F. oxysporum at various concentration

Rhapotigenin (%) Metconazole 20% (%) P-value

¹⁾_{(*, **)}

0 mg/L 0.00 0.00 0.00

2 mg/L 21.68 82.08 0.00

^**

4 mg/L 43.85 94.83 0.00

^**

6 mg/L 46.76 98.84 0.00

^**

8 mg/L 50.20 99.42 0.00

^**

10 mg/L 53.21 99.60 0.00

^**

*, **P < 0.05, 0.01 (t-test): significant to the control.

시들음병원균인 Fusarium oxysporum에 대한 장변대황 지하부로부터 분리한 rhapontigenin

의 균사생장 억제 실험을 검정한 결과, 4 mg/L 이상 농도에서 강한 항진균 활성을 나타내

(11)

었다. 시중에 판매하는 농약인 metconazole 20% (살림꾼, 액상수화제, ㈜동방아그로)에 비하 여 낮은 활성이 나타났으며, rhapontigenin의 EC

50

값은 7.48 mg/L이었다. Rhapontigenin을 농 도별로 비교하였을 때, rhapotigenin의 농도가 높아질수록 F. oxysporum의 균사생장억제율이 높은 것으로 나타났다.

장변대황으로부터 분리 및 정제하고 F. oxysporum에 대한 항진균활성을 확인하여 물질을 GC-MS 로 탐색하였고 이 활성물질을 NMR로 분석하여 rhapontigenin으로 구조동정하였다.

Rhapontigenin 에 대한 선행연구를 찾아본 결과, 장변대황뿐만 아니라 Rheum undulatum, Rheum tanguticum 등으로부터 분리하여 구조적으로 동정되었으며, 약학적인 활성도 있다고 보고된 바가 있어 본 연구에서는 친환경 농자재 개발을 목적으로 장변대황으로부터 rhapontigenin 을 분리하여 토마토 시들음병원균인 F. oxysporum에 대한 방제가를 추가적으 로 확인하였다. 그리고 온실이나 하우스 등과 같은 현장에서도 연구결과처럼 같은 결과가 도출될 수 있는지와 세균성 구멍병, 뿌리혹병, 토마토 궤양병 등에 효과가 있다는 선행 연 구에 따라 복합방제제 개발에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 보인다.

따라서, 장변대황(Rheum australe)지하부로부터 분리한 rhapontigenin이 시들음병원균인 Fusarium oxysporum 에 대한 항진균 활성물질로 구명되었으며, 이 물질은 시들음병 방제를 위한 친환경 농자재로 개발을 고려할 만한 활성을 가지는 것으로 판단되었다.

[Submitted, September. 16, 2019 ; Revised, January. 9, 2020 ; Accepted, February. 19, 2020]

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