Study on the Adult Human Mesenchymal Stem Cell-mediated Osteogenesis on the Bone Graft Matrix

골이식재 상에 이식된 인간골수 줄기세포에 의한 골형성에 대한 실험적 연구

고려대학교 의과대학 구강악안면외과학교실, 산부인과학교실¹

박중엽․장현석․임재석․이의석․김 탁¹

Study on the Adult Human Mesenchymal Stem Cell-mediated Osteogenesis on the Bone Graft Matrix

Joong-Yeop Park, Hyon-Seok Jang, Jae-Suk Rim, Eui-Seok Lee, Tak Kim¹

Department of Oral & Maxillofacial Surgery, Department of OBGY

, College of Medicine, Korea University, Ansan, Korea

Objectives: Tissue engineering demands the interaction of engineering and life sciences to generate

Methods: Cells were loaded onto 2×2 mm cubes of synthetic HA/TCP, anorganic bovine bone (Bio-Oss

Results: Synthetic HA/TCP was the most effective bone forming scaffold compared with Bio-Oss

Conclusion: Synthetic HA/TCP can be used as the efficient scaffold, compared to Bio-Oss

Key Words: Bone tissue engineering, Human mesenchymal stem cell, Osteogenic capacity

7) 최근에 와서 인공 장기의 개발 및 조직 재생을 위 한 조직 공학적 기법에의 적용에 널리 연구되고 있 는 줄기세포는 배아 줄기세포와 성인 줄기세포로 나 뉘며 법적, 윤리적 문제로 인한 배아 줄기세포 연구 의 어려움으로 뇌조직, 간, 신장, 근육, 치수 및 골수 에 널리 분포되어 있는 성인 간엽 줄기세포에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 골 결손부의 재생 및

책임저자: 장현석, 고려대학교 안산병원 치과, 구강악안면외과 Tel: 031)412-5370/5956, Fax: 031)401-7125

E-mail: omfs1109@korea.ac.kr

치과 임프란트 식립 후 osseointegration을 증진시키 기 위한 조직공학적 기법의 개발 및 연구에는 줄기 세포의 역할이 중요하고 또한 이식재 (scaffold)와의 상호작용이 큰 역할을 할 것으로 추측된다^1,2,3. 골 결손부의 재생을 위한 성인 간엽 줄기세포를 이용한 조직공학적 기법의 적용에는 이식재가 중요 한 역할을 하게 된다. 일반적으로 골 조직공학에 쓰 이는 이식재는 생체 적합성이 좋고 주변 혈관이 침 투할 수 있으며 기계적 강도가 골의 기능이 가능할 정도를 지녀야 하고 흡수되어 숙주골과 융합이 일어

나야 하며 이식된 세포에 의한 골유도를 유지해 주 어야 한다. 현재 골 결손부의 재생을 위해 사용될 수 있는 이식재로는 이종골, 동종골 및 hydroxyapatite, calcium phosphate 등의 합성물 등이 일반적이다. 이 런 이식재에 이식된 줄기세포에 의해 골 결손부에 골 재생이 일어나기 위해서는 이식재와 이식된 세포 간의 상호작용에 의한 신생골 형성이 필수적이라 생각된다. 이에 본 연구에서는 3가지 종류의 이식 재, 즉 Hydroxyapatite/Tricalcium phosphate (HA/TCP), Anorganic bovine bone (Bio-Oss^Ⓡ)와 Coralline-derived HA (ProOsteon^Ⓡ) 등에 인간 골수 간엽 줄기세포를 이식하고 세포이식 전후의 주사전자 현미경 소견 과 SCID mouse의 피하조직에 이식하여 5주 후의 Hematoxylin-eosin 염색을 통하여 신생골 형성 등의 조직학적 소견을 관찰하여 이식재의 종류에 따른 차 이를 비교, 분석하였다.

본 연구의 결과를 기초로 하여 향후 이식재의 화학 적 조성 및 그 형태에 따른 이식세포에 의한 신생골 형성에 대한 추가적인 연구 및 유전자 발현 비교 분 석을 통하여 골 재생에 적용될 수 있는 조직공학적 기법의 개발에 도움이 될 수 있을 것으로 사료된다.

대상 및 방법

1. 이식재

연구에는 3종류의 이식재를 사용하였는데 synthetic Hydroxyapatite/Tricalcium phosphate ceramic 60：40%

(Zimmer. Warsaw, In) (HA/TCP 60：40), Anorganic bovine bone (Bio-Oss^Ⓡ) (ABB), Coralline- derived HA (ProOsteon^Ⓡ500, Interpore Cross International, Irvine, CA) (coralline HA)의 세 종류의 이식재를 2×2×2 mm 크기의 블록형태로 만들어 초음파 세척 후 250^oC에서 4시간 동안 depyrogenation을 이용하여 소 독을 시행하여 사용하였다.

2. 골수 줄기세포의 배양 및 loading

성인 한명의 제공자의 장골로부터 채취하여 처리 된 Osiris사 (Osiris Therapeutics, Inc, Baltimore, MD)로 부터 구입한 미분화 성인 골수 줄기세포를 배양하여 연구에 이용하였다. 각 그룹 당 4개의 이식재를

사용하여 1.5 mL microcentrifuge tube에 1.0 mL의 DMEM (Dulbecco's modified eagle's medium)을 넣고 1.5×10⁵개의 골수 줄기세포를 투여 한 후 몇 차례 뒤집어 가며 37^oC에서 5시간 동안 부란시킨다. 그룹 당 1개씩 골수 줄기 세포를 투여하지 않고 이식재만 을 DMEM내에 넣어 대조군으로 사용하였다.

3. 주사 전자 현미경 소견

각 그룹당 세포를 이식하지 않은 대조군과 세포를 이식한 실험군의 주사 전자 현미경 소견을 관찰하였 다. 이식재를 PBS로 세척하고 4% paraformaldehyde 에 고정하여 증류수로 세척한 후 0.1 M sodium cacodylate의 1% osmium tetroxide에 30분 처리한 뒤 hexamethydisilazane으로 하룻밤 동안 critical point drying을 시행하고 90초간 gold, palladium sputter coating 을 시행하였다. 이후 15kvp에서 JEOL SEM 6300으 로 관찰하였다.

4. 조직학적 소견

세포를 이식한 실험군의 이식재와 세포를 이식하 지 않은 대조군의 이식재를 SCID mouse (Herlan Laboratories, Indianpolis, IN)의 등의 정중부에 절개를 가하여 피하 조직층에 이식하고 3-0 black silk를 이 용하여 피부를 봉합한 후 5주후 동물을 희생하여 등 의 정중부에 절개를 가하여 이식재와 주위조직을 제 거한 후 즉시 4% paraformaldehyde에 3시간 고정하 고 탈회시킨 후 hematoxylin-eosin 염색을 시행하여 그 소견을 관찰하였다.

결 과

1. 주사 전자현미경 소견

실험에 사용된 블록형태의 3종류의 이식재, 즉 synthetic HA/TCP ceramic 60：40%, Anorganic bovine bone (Bio-Oss^Ⓡ)와 Coralline-derived HA (ProOsteon^Ⓡ 500)에 골수 줄기세포를 loading한 후의 전자 현미경 소견에서 HA/TCP가 다른 2종류의 이식재의 경우보 다 세포의 부착이 양적으로 양호한 상태를 보이고 있었다 (Fig. 1, 2, 3).

Fig. 1. A: HA/TCP의 세포 loading 전의 SEM 소견 (60×), B: HA/TCP의 세포 loading 후의 SEM 소견 (150×).

Fig. 2. A: Bio-Oss^Ⓡ

의 세포 loading 전의 SEM 소견 (60×), B: Bio-Oss

의 세포 loading 후의 SEM 소견 (150×).

Fig. 3. A: ProOsteon^Ⓡ

의 세포 loading 전의 SEM 소견 (60×), B: ProOsteon

의 세포 loading 후의 SEM 소견 (150×).

A B

A B

B A

Fig. 4. A: HA/TCP의 세포 loading 전의 조직 소견 (20×, H&E staining), B: HA/TCP의 세포 loading 후의 조직

소견 (20×, H&E staining).

Fig. 5. A: Bio-Oss^Ⓡ

의 세포 loading 전의 조직 소견 (20×, H&E staining), B: Bio-Oss

의 세포 loading 후의 조직 소견 (20×, H&E staining).

2. 조직학적 소견

Mouse의 dorsal subcutaneous pocket에 이식된 3종 류의 이식재 모두에서 H&E 조직소견에서 염증소견 은 발견되지 않고 있으며 세포를 loading하지 않은 이식재 모두에서 골형성이 관찰되지 않았다. 세포를 loading한 경우 Bio-Oss^Ⓡ와 ProOsteon^Ⓡ 500에서는 골 형성이 관찰되지 않고 이식재의 pore 내부는 염증 소견이 없고 혈관이 침투되어 있는 dense connective tissue로 채워져 있었다. 그러나 세포를 loading 한 HA/TCP의 경우에는 pore 내부에 woven bone의 형성 이 관찰되고 있었으며 신생 혈관의 침투 및 dense connective tissue가 관찰되고 연골이나 지방조직의

형성은 관찰되지 않고 있었다 (Fig. 4, 5, 6).

고 찰

조직공학은 손실된 장기의 생성, 기능의 유지, 혹 은 회복을 위한생물학적 대체물을 생성하기 위하여 공학적 기법과 생명과학의 상호작용이 필요하다. 이 와 같이 조직공학적 기법을 이용하여 골 결손부 혹 은 기타 신생골의 형성이 필요한 부위에 대한 골 형 성을 이루기 위한 임상적 접근을 실현하기 위한 수 단의 하나로 본 연구가 고안되었다. Bioengineering의 한 요소인 조직공학에서는 골조직과 같은 일정한 기 능을 수행할 수 있는 조직을 형성할 수 있는 세포를

A B

A B

Fig. 6. A: ProOsteon^Ⓡ

의 세포 loading 전의 조직 소견 (20×, H&E staining), B: ProOsteon

의 세포 loading 후의 조직 소견 (20×, H&E staining).

포함할 수 있는 이식재가 주로 사용되고 있다. 골전 도 (osteoconduction)나 골유도 (osteoinduction) 등을 유 발할 수 있는 세포 기능을 향상시키기 위한 이식재 의 design을 개선시키기 위한 분자생물학적 기법의 사용으로 이의 임상적 적용시 개선된 결과를 얻을 수 있을 것으로 사료된다. 재생능을 지닌 세포가 적 절하게 공급될 수 있다면 이식재의 design 측면에서 골전도, 골유도 등에 유리하게 제조해야한다는 측면 보다는 강도, 골 재생이나 신생혈관 생성 등의 생물 학적 측면이 중요시 되는 design에 역점을 둘 수 있 으리라 생각된다.

1998년 1년간 미국에서의 조사 결과 정형외과 영 역에서 약 425,000예의 골 이식이 시행되었고 그 비 용만도 약 5억 내지 20억 달러가 소요된 것으로 보 고되고 있다⁴. 이중 약 60%가 spinal fusion에서 사용 되었으며 그 외에도 외상에 의한 골절, 병적 골절에 서의 골 증대술 및 골 재생술에 이용되었다. 치과 영 역에서의 골 이식술은 약 100,000예가 사용된 것으 로 보고되고 있다⁵. 이와 같이 다양한 술식을 이용한 골 이식으로 수많은 환자가 많은 도움을 받아온 것 으로 사료되고 있다.

탈회 동결 건조 이종골 이식이 치주 결손부⁶, guided bone regeneration⁷ 및 상악동 골증대술⁸ 등의 골 재생 에서 양호한 결과를 보이는 것으로 알려지면서 골 재생을 위한 많은 술식들이 급속히 발달되었다. 그 러나 특히 치과 임프란트의 식립에 불리한 수직적

골 결손부의 수복에서 이식재의 이용에 문제점을 지 니고 있으며⁹ 현재까지는 자가골이 구강내 골이식에 서 가장 유리한 것으로 여겨지고 있다. 자가골에는 골수 줄기세포, collagen을 포함하는 단백질 기질내 의 골전도 mineral phase, 골유도 성장인자 및 신생혈 관 형성 유도 성장인자 등 골의 치유에 유리한 많은 인자들이 포함되어 있다. 그러나 이와 같이 유리한 자가골의 사용에는 공여부의 통증, 지각마비, 감염 및 해부학적인 제한으로 채취량의 부족 등의 많은 문제점이 따르게 된다^10,11,12. 또한 동종골 이식이나 이종골 이식은 박테리아나 바이러스 감염, 면역반응 및 그 효과에서 문제를 지니고 있어^13-19 자가골을 대 체할 수 있는 생합성 물질에 대한 개발에 많은 연구 가 이루어지고 있다²⁰.

이식재에 의한 골 형성에 대하여 많은 연구 결과 가 보고되고 있는데 발치와에 대한 DFDBA와 자가 골 이식 비교 연구를 통하여 Becker 등²¹은 DFDBA 가 골 형성을 유발하지 못하고 흡수되지 않음을 보 고하여 임상적으로 사용하는데 문제가 있을 것으로 유추하였고²², 가토 경골 결손부 모델에서 이식을 시 행하지 않은 경우에 비해 Perioglass, Bioglass, Hydro- xyapatite 등을 이식하더라도 신생골 형성이 증가되 지 않는 것으로 보고되고 있다²³. 이전의 보고에 의 하면 Bioglass가 골전도성이 있는 것으로 알려지고 있지만 골 형성능에서 볼 때 자가골 이식에 비하여 그 효용성이 떨어지는 것으로 알려지고 있으며²⁴

A B

DFDBA에 비해서도 골 형성량이 떨어지는 것으로 생각된다²⁵. Ladd와 Pliam²⁶은 distal radius fracture 모 델에서 여러 가지 이식재 이식 결과 비교에서 그 차이를 명확히 하기에 어려움이 있음을 보고하고 있다.

최근에 이르러 많이 사용되고 그 성공률이 상당히 높은 것으로 알려지고 있는 상악 구치부의 임프란트 식립을 위한 sinus lift 술식에서는 임프란트의 성공 을 증대시키기 위하여 골 이식이 필수적인데 이는 상악동 골 결손부가 골 형성을 위한 세포 등이 부족 하기 때문이다. 현재까지는 자가골 이식이 가장 양 호한 결과를 보이는 것으로 알려지고 있는데 Anor- ganic bovine bone (Bio-oss^Ⓡ)를 이식하였을 때 조직학 적으로 명확하게 골형성이 일어나고 18개월 경과 후 숙주골에 의하여 대체되는 양호가 결과가 보고되고 있으며²⁷ Hurzeler²⁸는 Bio-oss^Ⓡ, Interpore^Ⓡ 200을 단 독으로 혹은 장골과 혼합하여 상악동 거상술에 사용 하였을 때 치과 임프란트의 식립에 양호한 골을 얻 을 수 있었음을 보고하고 있다. OsteoGraf/N도 역시 자가골과 혼합하여 상악동 거상술에 사용될 수 있으 며 Interpore^Ⓡ 200의 효용성에 대해서도 보고되고 있 다²⁹. Wetzel 등³⁰은 상악동 거상술에 동결 건조 이 종골을 이식하였을 때 골 형성이 일어나지 않음을 보고하고 있다. 상악동 거상술에 rhBMP가 골 이식 에 추가하여 사용될 수 있는데 rhOP-1을 투여하였을 때 골 형성이 자가골 이식에 비하여 속도가 느릴 뿐 (7.5개월) 그 형성량이 양호한 결과를 보이는 것으로 보고되고 있다³¹. 수직적 골 증대술에서의 rhBMP의 이용도 보고되고 있는데 상악동 거상술에서의 사용 에서보다 생성된 골의 골질이 치밀하지 못하고 골과 임프란트의 접촉률이 떨어지는 것으로 보고되고 있 다³². 이와 같이 골 대체물이나 rhBMP를 이용한 많 은 성공이 보고되고 있으나 자가골 이식에 비교될 수 있을 만한 치유기간의 단축이나 이식재의 사용 시 나타날 수 있는 문제에 대한 명확한 해결이 제시 되지 못하고 있는 것으로 생각된다.

정형외과 영역에서 spinal fusion시 역시 불충분한 골 형성으로 인해 여러 가지 문제를 야기하는 것으 로 알려지고 있는데 Emery 등³³은 interpore^Ⓡ 200, HA/TCP 및 inoteb ceramic 등을 자가골 대용으로 사

용하였으나 어느 것도 양호한 결과를 얻을 수 없었 음을 보고하였고, 이를 대신하여 type I collagen demineralized bone matrix나 BMP-2를 사용하여 demineralized bone matrix의 경우에는 solid bone fusion이 발생하지 않았으나 collagen은 골전도를 증 가시켰으며 BMP-2는 골형성을 증진시켰다. Spinal fusion의 성공에서는 골유도가 가장 중요한 요소인 데 collagen/HA/TCP matrix의 복합체인 Collagraft를 자가 망상골과 혼합하여 사용하면 자가골 이식만을 이용하는 것과 유사한 결과를 보여 자가골 이식량 을 줄일 수 있어 효율적인 것으로 알려지고 있다.

Morone과 Boden³⁴의 연구에 의하면 자가골만을 이식 하였을 때보다는 그 효과가 떨어지지만 탈회골만이 자가골과 병용하였을 때 골유도에 효과적인 것으로 보고되고 있다.

본 연구에서는 이상적인 세포-이식재 복합체의 조 합을 찾아내고 이를 적용하여 상대적으로 세포의 수 가 부족한 상황에서 골 유도를 유발할 수 있게 하고 생역학적으로 골 형성에 불리한 상황에서도 골 형성 을 도모할 수 있게 하고자 임상적으로 널리 사용되 고 있는 3종류의 이식재와 골수 줄기세포의 복합적 사용을 비교, 분석해서 이러한 세포-이식재의 복합 적 이용이 임상적으로 적용 가능한지 조직학적, 전 자현미경적으로 분석하고자 하였다.

골 이식에 의한 골 재생에서 가장 중요한 요소는 이식 망상골과 주위 조직에 존재하는 줄기세포이다.

Friedenstein³⁵은 골수 줄기세포에서 hematopoietic stem cell과 달리 골 형성 전구세포가 유래됨을 입증하였 고 이 골 형성 전구세포는 적절한 유도물질과 작용 하여 골을 형성하게 된다. 골 재생에서의 골 형성 전 구세포의 유용성은 성인 간엽 줄기세포를 HA/TCP ceramic cube에 이식하였을 때 골이 형성되는 것으로 입증되었고³⁶, 간엽 줄기세포가 골 형성 전구세포의 기원임이 알려지면서 골 재생과 조직공학에서의 세 포의 이용에 대한 연구가 시작되었다. 그러나 이와 같은 골 조직 공학에서의 세포의 이용에는 골 형성 에 불리한 조건, 즉 나이가 들거나 병적 상태에서와 같이 세포의 수가 감소되어 있는 것과 같은 제한이 따르게 된다. 골 형성을 일으키는데 작용하는 세포 들은 주위조직에서 유래되는데 골 결손부가 광범위

하거나 고령 등의 전신적인 문제를 가진 경우에 주 위 조직에서 세포의 부족을 보이게 되고 이러한 경 우 세포배양을 통하여 세포의 수를 확대하여 이를 이용한 세포 치료의 좋은 대상이 될 수 있을 것으로 사료된다.

골수에 존재하는 사람의 간엽 줄기세포는 골 조 직, 연골, 근육, 인대, 건, 지방조직 등의 재생을 일으 키는데³⁷ 이는 다양한 형질 발현을 보이는 경로를 따 라 분화되는 태아 줄기세포와는 다른 양상을 보인 다. 성인 간엽 줄기세포의 조직 재생에의 이용은 배 아세포의 사용에 따르는 윤리적인 문제를 배제할 수 있어 연구 및 임상에의 적용에 유리한 입장이며 이 소성 골 형성 모델이나 critical size defect 모델을 이 용하여 이식된 간엽 줄기세포가 골 형성을 일으키는 결과를 입증하고 있다³⁸.

성인 골수 간엽 줄기세포의 성공적인 임상에의 적 용에는 in vitro에서 세포의 증식을 유도하고 그 골 형성 형질을 유지하는 것이 필수적이다. 다형성능 (pluripotential capacity)을 유지하면서 지속적인 증식 을 보이는 성인 골수 간엽 줄기세포의 성질을 이용 하여 한번의 골수 천자로 얻어진 간엽 줄기세포를 증식 유도하여 골 형성을 유도하기 위하여 많은 수 의 세포를 이식재에 이식할 수 있을 것으로 생각된 다. 성인 골수 간엽 줄기세포는 장기간의 배양 과정 에서도 그 골 형성능을 유지하는 것으로 알려지고 있는데 동결 보관된 성인 골수 간엽 줄기세포는 in vitro 세포 배양을 통하여 약 10억 배까지 그 수를 늘 릴 수 있는 것으로 보고되고 있다³⁹. 사람의 간엽 골 수 줄기세포는 세포배양 및 분화유도를 통하여 조골 세포로 분화되고, 피하조직에 이식하였을 때 골을 형성하게 된다. 이와 같이 간엽 줄기세포의 배양을 통하여 백서 경골부의 광범위한 골 결손부에 대한 골 재생 시도가 보고되었으며⁴⁰ 이밖에도 canine⁴¹과 sheep⁴²의 long bone 및 두개골 critical size defect 모델 에서도 골 재생을 위한 연구 결과가 보고되고 있다.

이와 같이 세포의 배양 및 수의 증대를 통한 줄기 세포의 골 재생에의 이용은 특히 광범위한 골 결손 부 및 전신적인 문제 등으로 정상적인 창상치유에 어려움이 예상되는 부위에서 양호한 결과를 얻을 수 있을 것으로 생각되는데 특히 광범위한 선천적 기

형, 종양의 외과적 적출이나 골조직의 감염으로 야 기된 long bone, 상악골이나 하악골의 광범위한 골 결손부의 재생이나 치유되지 않은 골절부 등 골 재 생에 있어 문제를 가진 경우에 사용할 수 있을 것으 로 생각된다. 골 재생에 있어서 골유도나 골형성에 작용하는 인자들은 이론적으로 세포가 이식되는 부 위의 생리적 조절에 의하므로 성인 골수 간엽 줄기 세포를 이용한 세포 치료는 한 가지 인자의 과도한 투여로 인한 부작용이나 국소적인 특정 인자의 투여 로 인한 생리적 조절의 실패로 인한 문제를 방지할 수 있다는 상대적인 이점이 있다고 할 수 있다.

rhBMP의 투여로 골 재생을 유도할 수 있는데 실제 실험동물 모델을 이용하여 나이가 많아 세포의 수가 감소되어 있는 실험동물에서 rhBMP의 투여가 골 형 성을 증가시키는 것으로 알려지고 있다⁴³. 분화된 조 골세포는 골세포로 변화되고 궁극적으로 세포사멸 과정을 거쳐 이식 부위에서 제거되게 된다.

이소성 골 형성에 대한 현재까지의 연구 결과 성 인 골수 간엽 줄기세포는 분화와 골 형성을 위해서 는 이식재가 필요한 것으로 알려지고 있고 이식재의 물리적, 화학적 성질이 cytokine/growth factor signa- ling의 결과에 영향을 미치게 된다. BMP는 골 유도 를 위해 필요한 일정한 이식재의 조건을 가지고 있 는데 이와 같은 이식재에 의한 BMP signaling은 이 식재의 선택에 따라 intramembranous 혹은 endo- chondral 골 형성이 달라지듯이 이식재와 cytokine 사 이의 유기적인 관계를 보이는 좋은 예라 할 수 있다.

본 연구에서도 성장인자나 cytokine에 대한 이식재에 따른 반응이 세포와 이식재 간의 특정적인 상호작용 에 의한다는 가정 아래 연구를 시행하였다. 이와 유 사한 맥락에서 세포에 의한 골 재생은 이식재에 따 라 상이한 양상을 보인다. 조직 공학적 기법을 이용 한 골 형성의 성공을 위해서는 미분화세포에 미치는 다양한 신호전달 기전에 대한 이해가 필수적인 것으 로 생각된다. 성인 골수 간엽 줄기세포는 in vitro와 in vivo 모두에서 다양한 계통의 세포로 분화될 수 있는데 어떠한 조건이 조골세포로의 분화를 일으키 는지는 명확히 밝혀져 있지 않고 단지 이 과정에서 이식재에 의해 일부 영향을 받게 된다. Krebsbach 등⁴⁴ 은 인간의 골수 stromal fibroblast를 탈회골, collagen

이나 polyvinyl 스폰지에 이식하였을 때는 골이 형 성되지 않으나 HA/TCP 분말이나 HA/TCP 분말과 collagen에 이식하는 경우 골이 형성되는 것을 관찰 하였다. 이와 같이 이식재의 종류에 따라 골 형성의 여부 및 정도에 차이를 나타내고 이밖에도 조직공학 기법을 이용한 골 재생에 biomechanical factor 등 여 러 가지 다양한 요소들이 영향을 미치게 된다.

현재까지의 연구 결과 세포나 특정 성장인자만으 로 골 형성을 유발할 수는 없는 것으로 알려지고 있 다. 임상적으로 골 형성 내지 골 결손부의 치유에는 생역학이나 형태학적 측면에서 이식재의 존재가 필 수적이다. 실제로 세포나 성장인자의 생물학적 기능 을 위해서는 적당한 화학적 조성과 물리적 성질을 지닌 불용성 이식재가 필요하다. Burwell은 “Theory of Medullary Osteogenesis”에서 골 형성을 위해서는 골 형성 세포뿐만 아니라 적절한 물리적, 생물학적 조건이 필수적이라고 언급하고 있다⁴⁵. 조직이나 장 기의 재생을 위한 조직 공학적 기법은 이식이 가능 하고 특정조직을 유도할 수 있는 세포, 성장 및 분화 조절 인자 및 세포 및 성장인자의 부착, 세포의 증 식, 이동과 분화를 가능하게 하는 이식재 등 세 가지 요소로 이루어져 있다.

다양한 종류의 생체 적합성 이식재가 골량의 증대 나 골 결손부의 골 형성의 목적으로 사용되고 있는 데 대부분의 경우에 이 이식재들은 골유도성을 지니 지 않고 물리적으로도 강도가 약한데 천연산 골 무 기질, 합성에 의해 제조된 hydroxyapatite 및 calcium phosphate, 천연 polymer, 합성 polymer 등 4종류의 이 식재가 있다.

조직공학 기법을 이용한 골조직의 재생에는 골유 도, 골형성 및 골전도를 위하여 적절한 이식재의 개 발뿐만 아니라 성장 인자의 합성 및 세포의 분리, 배 양이 동반되어야 하는데 이전의 연구들에 의하여 세 포, 성장인자에 의한 골 형성을 위한 이상적인 이식 재의 조건에 대해 많은 연구가 이루어져 왔는데^38,46. 이를 종합하여 보면 이상적인 이식재의 조건으로는 1) 생체 적합성을 지녀서 면역반응이 억제되거나 적 절해야 하고, 2) 임상적으로 다양한 용도로 사용하 기 위하여 다루기 쉬워야 하며, 3) 이식되거나 주위 정상 조직으로부터 유래된 혈관 생성 인자에 의해

신생 혈관이 용이하게 생성되어야 하며, 4) 숙주골 과 골 전도성을 지녀야 하며, 5) 부착된 성장인자나 세포에 의한 골 유도를 유지하게 하고 이러한 성장 인자가 적절하게 유리되도록 하며 세포의 투여, 부 착, 이동 및 증식이 가능해야 하며, 6) 부착세포의 분화를 통한 골 형성이 가능해야 하며, 7) 초기에 적 절한 형태 및 기계적 강도를 유지하여 형성될 골의 형태 및 강도를 제공할 수 있어야 하며, 8) 새로 형 성된 신생골의 존재를 방사선 소견 등으로 확인할 수 있도록 그 형태를 유지할 수 있을 정도의 강도를 지니고 있어야 하며, 9) 신생골의 형성 및 개조와 조 화되어 흡수가 되어야 하며, 10) 일반적인 창상 치유 과정인 반흔 조직이나 골 조직이 아닌 주변조직으로 의 치유가 일어나지 않도록 해야 한다. 이와 같은 조 건은 골 재생을 위한 이식재의 개발 및 제조에 일반 적으로 적용되는 조건이라 할 수 있다. 이는 조직공 학을 이용한 골 대체 물질의 성공적인 제조를 위한 분자생물학적 조건을 제시한다 할 수 있다.

이식재를 이용한 조직 공학적 골 형성에는 몇 가 지 조건이 따르게 되는데 첫째, 이식재 물질의 물리 적 성질의 조건으로 예를 들어 hydroxyapatite나 bio- glass와 같이 강도가 높은 이식재를 이용하여 신생골 을 형성한 경우 이식재 자체의 높은 elasticity와 파절 가능성으로 인하여 신생골의 골절이 쉽게 발생할 수 있는 경우에서와 같이 이식재와 신생골 복합체의 물 리적 성질이 임상적인 성공 여부를 결정하는 요인이 될 수 있다는 점이다. 또 다른 조건으로 골 조직에서 주된 세포외 기질이 type I collagen으로 이루어지듯 이 새롭게 재생되는 골 조직도 이와 같이 type I collagen의 세포외 기질로 구성되어야 한다는 점이 다. 실제로 골 형성 과정에서는 초기 골양조직 형성 과정에서 세포외 기질의 변화가 무척 다양한데 만약 세포와 세포외 기질간의 상호작용을 밝혀내고 이를 조직 공학적 골 재생에 이용할 수 있다면 각각의 골 형성 과정 시기별로 이에 적절한 조건들을 제공하여 골 재생부에로의 성인 골수 간엽 줄기세포의 이동을 촉진하고 조골세포로의 분화를 유도할 수 있을 것으 로 사료된다. 골 재생에서 일반적으로 생각해볼 수 있는 세 번째 조건은 조직의 재생 과정과 조직의 발 생과정과의 유사성에 대한 문제이다. 물론 조직의

재생 과정에서 발생 과정의 모든 신호 전달 체계 등 이 재현되지는 않지만 중요한 요소들은 발생 과정과 동일할 것으로 생각된다. 따라서 조직공학을 이용한 골 조직 재생에서 이식재의 사용으로 조성되는 환경 은 세포 반응 측면에서 발생 과정과 유사한 과정을 통하여 이루어질 수 있다.

최근에 와서 성공적인 조직 공학적 골 재생에 다 양한 종류의 골유도 물질 및 신생혈관 형성 유도물 질 들이 시도되고 있으나 Lane 등⁴⁷은 임상적으로 성 공적인 골 재생에 이용되기 위해서는 더 많은 연구 가 필요한 것으로 보고하고 있다. 골 형성에 영향을 미치는 이식재에 의한 분자 생물학적 영향이 성공적 인 조직 공학적 골 재생에 필수적이라 생각된다.

이번 연구에서는 흔히 사용되는 세 종류의 이식재 에 성인 간엽 골수 줄기세포를 loading하여 주사전자 현미경 소견과 조직학적 소견을 관찰하여 위와 같은 결과를 얻었다. 이러한 결과는 각각의 이식재의 특 성을 고려하여 해석해야 하며 향후 골 재생에 관한 분자 생물학적 연구에 도움이 될 수 있을 것으로 기 대한다.

결 론

1. Synthetic HA/TCP ceramic 60：40%, Anorganic bovine bone (Bio-Oss^Ⓡ)와 Coralline-derived HA (ProOsteon^Ⓡ 500)에 인간 골수 줄기세포를 loading 하였을 때 세 종류 이식재 모두에서 양호한 세 포의 부착이 관찰되었다.

2. HA/TCP의 경우에 다른 이식재와 달리 신생골 의 형성을 보이고 있었다.

위의 결과를 통하여 세포의 부착은 차이를 보이지 않지만 이식재의 제조 과정에 따른 차이로 신생골의 형성에 차이를 보이고 다른 다양한 이식재에 대한 추가적인 연구가 필요하겠지만 HA/TCP가 골 결손 부의 회복이나 골 재생이 요구되는 부위에의 인간 골수 줄기세포를 이용한 조직공학적 기법에의 응용 에 양호한 결과를 보일 것으로 사료된다.

요 약

목적: 최근에 인공장기의 개발 및 조직재생을 위 한 조직공학적 기법에의 적용에 골수줄기세포의 역 할에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 골 결손부 의 재생 및 치과 임플란트 식립후 osseointegration을 증진시키기 위한 조직공학적 기법의 개발 및 연구에 줄기 세포와 이식재와의 상호작용이 중요한 역할을 할 것으로 기대된다. 본 연구는 골 재생에 널리 사용 되는 3종류의 이식재에 성인 골수 줄기세포를 이식 한 후 주사전자현미경사진 및 조직학적 소견으로 각 이식재와 골수 줄기세포와의 상호작용을 비교하여 골재생의 조직 공학적 연구에 도움이 되는 연구를 얻고자 하였다.

방법: Hydroxyapatite/Tricalcium phosphate (HA/TCP), Anorganic bovine bone (Bio-Oss^Ⓡ)와 Coralline-derived HA (ProOsteon^Ⓡ)의 세 종류의 이식재를 각 그룹 당 4개씩 이용하였고, 성인한명으로부터 골수 줄기세포 를 배양하여 각 이식재에 투여한 후 부란시킨 후 주 사전자현미경 소견을 관찰하였다. 각 그룹 당 한 개 의 이식재는 성인골수 줄기 세포를 이식하지 않은 대조군으로 사용하였다. 또한 각 그룹의 줄기세포를 이식한 이식재와 줄기세포를 이식하지 않은 이식재 를 SCID mouse의 등에 5주 동안 이식시킨 후 그 조 직학적 소견을 관찰하였다.

결과: 주사전자현미경 소견에서 세 종류의 이식재 모두에 세포의 부착이 일어남을 확인할 수 있었으며 HA/TCP가 다른 이식재의 경우보다 세포의 부착이 양적으로 양호한 상태를 보이고 있었다. 또한 실험 군과 대조군의 SCID mouse를 희생하여 관찰한 조직 학적 소견에서 대조군은 세 종류의 이식재 모두에서 골 형성을 관찰할 수 없었고 실험군의 경우 Bio-Oss^Ⓡ 와 ProOsteon^Ⓡ는 골 형성이 관찰되지 않았으나 HA/

TCP의 경우 woven bone의 형성이 관찰되었다. 이 신 생골 주위에 혈관의 형성이 관찰되었으나 염증반응 이나 파골세포는 관찰되지 않았다.

결론: 연구에 사용된 세 종류의 이식재를 비교하 였을 때 세포의 부착에는 세 종류의 이식재 모두 차 이를 보이지 않았지만 신생골의 형성에는 차이를 보 이고 있어 HA/TCP 가 골결손부의 회복이나 골 재생

이 요구되는 부위에의 인간 골수 줄기세포를 이용한 조직 공학적 기법에의 응용에 양호한 결과를 보일 것으로 사료된다.

중심단어: 조직공학, 골수줄기세포, 이식재, HA/

TCP, 골 재생

참 고 문 헌

1. Goshima J, Goldberg VM, Caplan AI. Osteogenic potential of culture-expanded rat marrow cells as assayed in vivo with porous calcium phosphate ceramic. Biomaterials 1991;12:253-8.

2. Peter SJ, Lu L, Kim DJ, Mikos AG. Marrow stro- mal osteoblast function on a poly (propylene fuma- rate)/beta-tricalcium phosphate biodegradable ortho- paedic composite. Biomaterials 2000;21:1207-13.

3. Sautier JM, Nefussi JR, Boulekbach H, Forest N.

In vitro bone formation on coral granules. In Vitro Cell Dev Biol 1990;26:1079-85.

4. Boden SD. Bone repair and enhancement clinical trial design. Spine applications. Clin Orthop 1998;

(Suppl. 355):S336-46.

5. Machtei EE. Outcome variables for the study of periodontal regeneration. [Review] [73 refs] Annals of Periodontology 1997;2(1):229-39.

6. Bowers G, Felton F, Middleton C, Glynn D, Sharp S, Mellonig J, et al. Histologic comparison of regeneration in human intrabony defects when osteogenin is combined with demineralized freeze- dried bone allograft and with purified bovine colla- gen. J Periodontol 1991;62(11):690-702.

7. Mellonig JT, Nevins M. Guided bone regeneration of bone defects associated with implants: an evidence-based outcome assessment. Int J Periodon- tics Restorative Dent 1995;15(2):168-85.

8. Moy PK, Lundgren S, Holmes RE. Maxillary sinus augmentation: histomorphometric analysis of graft materials for maxillary sinus floor augmentation. J Oral Maxillofac Surg 1993;51(8):857-62.

9. Simion M, Jovanovic SA, Trisi P, Scarano A,

Piattelli A. Vertical ridge augmentation around dental implants using a membrane technique and autogenous bone or allografts in humans. Int J Periodontics Restorative Dent 1998;18(1):8-23.

10. Banwart JC, Asher MA, Hassanein RS. Iliac crest bone graft harvest donor site morbidity. A statis- tical evaluation. Spine 1995;20(9):1055-60.

11. Younger EM, Chapman MW. Morbidity at bone graft donor sites. J Orthop Trauma 1989;3(3):192-5.

12. Arrington ED, Smith WJ, Chambers HG, Bucknell AL, Davino NA. Complications of iliac crest bone graft harvesting. Clinical Orthopaedics & Related Research 1996;(329):300-9.

13. Aho AJ, Eskola J, Ekfors T, Manner I, Kouri T, Hollmen T. Immune responses and clinical out- come of massive human osteoarticular allografts.

Clin Orthop 1998;(346):196-206.

14. Marthy S, Richter M. Human immunodeficiency virus activity in rib allografts. J Oral Maxillofac Surg 1998;56(4):474-6.

15. Paradis K, Langford G, Long Z, Heneine W, Sandstrom P, Switzer WM, et al. Search for cross-species transmission of porcine endogenous retrovirus in patients treated with living pig tissue.

Science 1999;285(5431):1236-41.

16. Stevenson S, Li XQ, Davy DT, Klein L, Goldberg VM. Critical biological determinants of incorpo- ration of non-vascularized cortical bone grafts.

Quantification of a complex process and structure.

J Bone Joint Surg Am 1997;79(1):1-16.

17. Johnson EE, Urist MR, Schmalzried TP, Chotivi- chit A, Huang HK, Finerman GA. Autogeneic cancellous bone grafts in extensive segmental ulnar defects in dogs. Effects of xenogeneic bovine bone morphogenetic protein without and with inter- position of soft tissues and interruption of blood supply. Clin Orthop 1989;(243):254-65.

18. Kienapfel H, Sumner DR, Turner TM, Urban RM, Galante JO. Efficacy of autograft and freeze-dried allograft to enhance fixation of porous coated

implants in the presence of interface gaps. J Orthop Res 1992;10(3):423-33.

19. Schwartz Z, Somers A, Mellonig JT, Carnes DL Jr, Dean DD, Cochran DL, Boyan BD. Ability of commercial demineralized freeze-dried bone allo- graft to induce new bone formation is dependent on donor age but not gender. J Periodontol 1998;

69(4):470-8.

20. Lane JM, Tomin E, Bostrom MP. Biosynthetic bone grafting. Clin Orthop 1999;(Suppl. 367):

S107-17.

21. Becker W, Becker BE, Caffesse R. A comparison of demineralized freeze-dried bone and autologous bone to induce bone formation in human extraction sockets. J Periodontol 1994;65(12):1128-33.

22. Schwartz Z, Mellonig JT, Carnes DL Jr, de la Fontaine J, Cochran DL, Dean DD, Boyan BD.

Ability of commercial demineralized freeze-dried bone allograft to induce new bone formation. J Periodontol 1996;67(9):918-26.

23. MacNeill SR, Cobb CM, Rapley JW, Glaros AG, Spencer P. In vivo comparison of synthetic osseous graft materials. A preliminary study. Clin Perio- dontol 1999;26(4):239-45.

24. Virolainen P, Heikkila J, Yli-Urpo A, Vuorio E, Aro HT. Histomorphometric and molecular biologic comparison of bioactive glass granules and auto- genous bone grafts in augmentation of bone defect healing. J Biomed Mater Res 1997;35(1):9-17.

25. Hall EE, Meffert RM, Hermann JS, Mellonig JT, Cochran DL. Comparison of bioactive glass to demineralized freeze-dried bone allograft in the treatment of intrabony defects around implants in the canine mandible. J Periodontol 1999;70(5):

526-35.

26. Ladd AL, Pliam NB. Use of bone-graft substitutes in distal radius fractures. J Am Acad Orthop Surg 1999;7(5):279-90.

27. Hurzeler MB, Quinones CR, Kirsch A, Gloker C, Schupbach P, Strub JR, Caffesse RG. Maxillary

sinus augmentation using different grafting materials and dental implants in monkeys. Part I. Evaluation of anorganic bovine-derived bone matrix. Clinical Oral Implants Research 1997;8(6):476-86.

28. Froum SJ, Tarnow DP, Wallace SS, Rohrer MD, Cho SC. Sinus floor elevation using anorganic bovine bone matrix (OsteoGraf/N) with and without autogenous bone: a clinical, histologic, radiogra- phic, and histomorphometric analysis--Part 2 of an ongoing prospective study. Int J Periodontics Resto- rative Dent 1998;18(6):528-43.

29. Quinones CR, Hurzeler MB, Schupbach P, Kirsch A, Blum P, Caffesse RG, Strub JR. Maxillary sinus augmentation using different grafting materials and osseointegrated dental implants in monkeys. Part II.

Evaluation of porous hydroxyapatite as a grafting material. Clinical Oral Implants Research 1997;

8(6):487-96.

30. Wetzel AC, Stich H, Caffesse RG. Bone apposition onto oral implants in the sinus area filled with different grafting materials. A histological study in beagle dogs. Clinical Oral Implants Research 1995;

6(3):155-63.

31. Margolin MD, Cogan AG, Taylor M, Buck D, McAllister TN, Toth C, McAllister BS. Maxillary sinus augmentation in the non-human primate: a comparative radiographic and histologic study between recombinant human osteogenic protein-1 and natural bone mineral. J Periodontol 1998;69 (8):911-9.

32. Hanisch O, Tatakis DN, Rohrer MD, Wöhrle PS, Wozney JM, Wikesjö UM. Bone formation and osseointegration stimulated by rhBMP-2 following subantral augmentation procedures in nonhuman primates. Int J Oral Maxillofac Implants 1997;

12(6):785-92.

33. Emery SE, Fuller DA, Stevenson S. Ceramic anterior spinal fusion. Biologic and biomechanical compa- rison in a canine model. Spine 1996;21(23):2713- 9.

34. Morone MA, Boden SD. Experimental postero- lateral lumbar spinal fusion with a demineralized bone matrix gel. [Review] [39 refs] Spine 1998;

23(2):159-67.

35. Friedenstein A, Kuralesova AI. Osteogenic precur- sor cells of bone marrow in radiation chimeras.

Transplantation 1971;12(2):99-108.

36. Goshima J, Goldberg VM, Caplan AI. The osteo- genic potential of culture-expanded rat marrow mesenchymal cells assayed in vivo in calcium phosphate ceramic blocks. Clin Orthop 1991;

(262):298-311.

37. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999;284(5411):143-7.

38. Bruder SP, Fox BS. Tissue engineering of bone - Cell based strategies. Clin Orthop 1999(Suppl.

367):S68-83.

39. Lazarus HM, Haynesworth SE, Gerson SL, Rosenthal NS, Caplan AI. Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells):

implications for therapeutic use. Bone Marrow Trans- plant 1995;16(4):557-64.

40. Bruder SP, Kurth AA, Shea M, Hayes WC, Jaiswal N, Kadiyala S. Bone regeneration by implantation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells. J Orthop Res 1998;16(2):155-62.

41. Bruder SP, Kraus KH, Goldberg VM, Kadiyala S.

The effect of implants loaded with autologous mesenchymal stem cells on the healing of canine segmental bone defects. J Bone Joint Surg Am 1998;80(7):985-96.

42. Kon E, Muraglia A, Corsi A, Bianco P, Marcacci M, Martin I, et al. Autologous bone marrow stromal cells loaded onto porous hydroxyapatite ceramic accelerate bone repair in critical-size defects of sheep long bones. Biomed Mater Res 2000;49(3):328-37.

43. Fleet JC, Cashman K, Cox K, Rosen V. The effects of aging on the bone inductive activity of recombinant human bone morphogenetic protein-2.

Endocrinology 1996;137(11):4605-10.

44. Krebsbach PH, Kuznetsov SA, Satomura K, Emmons RV, Rowe DW, Robey PG. Bone formation in vivo: comparison of osteogenesis by transplanted mouse and human marrow stromal fibroblasts.

Transplantation 1997;63(8):1059-69.

45. Burwell RG. The function of bone marrow in the incorporation of a bone graft. Clin Orthop 1985;

(200):125-41.

46. Brekke JH, Toth JM. Principles of tissue engi- neering applied to programmable osteogenesis. J Biomed Mater Res 1998;43(4):380-98B.

47. Lane JM, Tomin E, Bostrom MP. Biosynthetic bone grafting. Clin Orthop 1999;(Suppl. 367):

S107-17.