265 서 론
이 연구의 목적은 순무농축물에 의한 간 섬유화 과정 억제 및 치료 효과를 확인하는 것이다. 최근 건강에 대한 관심이 고조되고 있는 가운데 암이나 동맥경화 등과 같 은 질병으로 인하여 고통을 받고 있는 사람들에게는 일
상생활에서 흔히 섭취하는 식품으로 질병을 예방하는 것이 가장 이상적인 것으로 여겨지고 있다. 이러한 사회 적 분위기와 더불어 항암 효과가 있는 것으로 알려져 있 는 순무에 대한 관심이 높아지고 있다.
순무는 겨잣과에 속하는 한해살이 또는 두해살이 근 체 식물로서 원산지는 지중해 연안에서 서아시아이며 전 세계에 걸쳐 넓게 재배되고 있다.1) 우리나라에서는
책임저자：장자준, ꂕ 110-799, 서울시 종로구 연건동 28번지 서울대학교 의과대학 병리학교실
Tel: 02-740-8271, Fax: 3673-5046 E-mail: [email protected]
접수일：2006년 8월 30일, 게재승인일：2006년 9월 11일
*The authors contributed equally to this paper.
Correspondence to：Ja-June Jang
Department of Pathology, Seoul National University College of Medicine, 28, Yeongeon-dong, Jongno-gu, Seoul 110-799, Korea
Tel: 82-2-740-8271, Fax: 82-2-3673-5046 E-mail: [email protected]
순무 농축물에 의한 Thioacetamide 유발 랫드 간섬유화 억제 효과
서울대학교 의과대학 병리학교실, 1강원대학교 수의과대학 실험동물의학교실, 2한국식품연구원
신혜원*․박수영*․이경분․신 은․이민재1․김영진2․장자준
Inhibitory Effect of Turnip Extract on Thioacetamide- induced Rat Hepatic Fibrogenesis
Hye Won Shin*, Soo Young Park*, Kyoung Bun Lee, Eun Shin, Min-Jae Lee1, Young Jin Kim2 and Ja-June Jang Department of Pathology, Seoul National University College of Medicine, Seoul 110-799, 1Department of Laboratory
Animal Medicine and Science, Kangwon National University, Chuncheon 200-701,
2Korea Food Research Institute, Seongnam 463-746, Korea
We examined the anti-fibrogenic and the therapeutic effect of turnip extracts in thioacetamide (TAA)- induced liver fibrosis experimental animal model. Anti-fibrogenic effect was demonstrated histopatho- logically and serologically after the animals fed with turnip extracts with synchronous TAA injections for 7 weeks. The animals fed with 20 mg/ml of turnip extracts showed the highest anti-fibrogenic effect.
We also examined the therapeutic effect on hepatic fibrogenesis after feeding turnip extracts for 8 weeks following TAA injections for 7 weeks. Animals were fed with 45 mg/ml and 90 mg/ml of turnip extracts, and the same doses were also fed to TAA non-injection group to examine any impacts of high dose turnip extracts affecting animal growth. High doses of turnip extracts did not show any impacts on animal growth, and liver fibrosis was attenuated in the animals fed with turnip extracts compared to the control animals. In this study, turnip extracts induced significant anti-fibrogenic effects, and also it was confirmed to have therapeutic effects on hepatic fibrogenesis. Therefore, mechanisms for anti-fibrogenic effect of turnip extracts should be explored further. (Cancer Prev Res 11, 265-272, 2006)
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Key Words: Fibrogenesis, TAA, Turnip extracts, Cirrhosis
강화도 지역의 특산물이며, 최초로 도입된 시기는 정확 히 알 수 없으나 고려 중엽에 이규보가 지은 가포육영 (家圃六詠)이라는 시속에 순무를 재료로 한 김치가 우리 나라 문헌 상 최초로 등장한 것으로 보아 그 이전임을 추정하고 있다.2) 우리나라에서 재배되고 있는 순무와 순 무 청, 그리고 순무 씨의 가공기술이 개발되었고, 그 생 체효능은 이미 다양하게 보고된 바 있다.1,3) 특히 동물실 험에서 사염화탄소로 유발한 급성 간 독성 해독작용에 순무 추출물이 효능을 갖고 있는 것으로 보고된 바 있 다.1)
간암은 세계적으로 발생률이 높고 2004년 통계청 보 고에 의하면 우리나라의 경우 암으로 인한 사망률 중 간 암은 폐암과 위암 다음으로 높다. 간암은 발병하면 대부 분 단시간 내에 사망하고, 진단 당시 이미 상당히 진행된 경우가 많다.4,5) 우리나라 간암 환자들은 특히 B형 간염 바이러스에 의한 장기간에 걸친 만성 간염과 간섬유화 과정을 거쳐 간암으로 진행되는 것으로 알려져 있다. 따 라서 간섬유화 과정을 효과적으로 억제하여 간암으로의 진행을 차단 할 수 있는 방법을 찾는 것이 중요하다. 평 소 우리가 쉽게 접할 수 있는 식품 중에서 간섬유화를 예방할 수 있는 기능성 식품을 개발하는 것은 국민 건강 증진에 크게 기여할 수 있을 것이다.6,7)
일본이나 중국에서 간질환 환자들에게 사용하고 있는 초본 한약제인 Inchin-ko-to (TJ-135)는 동물실험을 통해서 간경변증 억제 효과를 보고한 바 있다.8) 또한 콩 성분 중 하나인 polyenylphosphatidylcholine (PPC)와 인도의 향신료 로 유명한 커리의 색소 curcumin 도 간섬유화 과정을 효과 적으로 억제시키는 것으로 알려져 있다.9,10) 식물 추출물 이나 한약제와 같이 우리가 쉽게 접할 수 있는 식품 중에 서 간섬유화를 예방할 수 있는 기능성 식품을 개발하는 것은 국민 건강 증진에 크게 기여할 수 있을 것이다.
본 연구의 주 관심사로서 간경변 초기 단계인 간 섬유 화는 다양한 원인에 의한 간세포의 괴사성 염증, Kupffer 세포의 활성화, 사이토카인의 유리, 간성상세포의 괴사 성 염증, 세포외기질의 합성 촉진 및 기질 분해의 장애 등 일련의 과정이 총체적으로 발생하여 간내 총 세포외 기질이 증가된 상태이다.11∼14) 이 과정에서 중추적 역할 을 하는 활성화된 간성상세포는 간내 침착되는 세포외 기질의 대부분을 분비하며, 또한 성장 조절 인자를 생산 하여 자가 분비를 통하여 스스로를 활성화시키기도 한
다.6,15,16) 따라서 만성 간질환 환자에서 중요한 예후 인자
인 간섬유화의 치료를 위해서는 간 조직 자체의 염증반 응 억제, 간성상세포의 활성화 억제 및 교원질 생성과정 의 방해 등 세 가지 방향으로의 연구가 필요하다. 최근까
지 연구되어 온 간섬유화 치료를 위한 많은 약물 혹은 물질들은 대부분의 경우 혈청학적인 간 기능 개선에는 부분적으로 효과가 있었지만 조직학적으로 간섬유화에 대한 억제효과는 미미하거나, 간독성의 문제를 야기할 수 있는 것으로 알려지고 있다.17)
흔히 사용되는 간 경변 동물 모델은 랫드에 dimethylni- trosamine, 사염화탄소, TAA를 비롯한 여러 가지 화학물질 에 의한 만성적인 간 손상을 유발시키는 방법이다.18∼20) 따라서 본 연구에서는 TAA를 사용하여 사염화탄소보다 병변이 더 뚜렷하고 지속적인 간섬유화를 유도하였으 며, TAA 투여 동물에 순무농축물을 동시에 투여하여 순 무농축물에 의한 간섬유화 억제 및 치료 효과를 규명하 고자 하였다.
재료 및 방법 1. 순무농축물의 제조
순무농축물은 한국식품연구원에서 제조하였으며, 인 천 강화읍에서 생산된 생 순무가 사용되었다. 순무농축 물의 제조법을 간략히 보면, 순무를 세척한 후 잘게 절단 하거나 압착기로 압착하여 순무즙과 순무잔사로 분리한 후, 순무즙은 여과 후 농축하고, 순무잔사에는 에탄올 (95%)을 넣고 60oC에서 18시간 내외로 추출하고 여과한 후, 여액을 모아 60oC에서 감압농축하여 순무농축물을 제조하였다.
2. 동물실험
체중이 100 g 인 6주령 수컷 Sprague-Dawley를 사용하 여 한 그룹당 15마리씩 네 그룹의 TAA 투여군과 6마리 의 TAA 비투여군을 설정하였다. TAA (thioacetamide, Sigma, St. Louis, MO, USA)는 체중 100 g당 20 mg 농도로 생리식염수에 첨가하여 복강 내 주사로 7주 동안 매주 3회 연속적으로 투여하였으며 비투여군에는 생리식염 수만 투여하였다. 동시에 TAA 투여군에는 각 그룹당 순 무농축물을 0 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml의 농도 로 음수에 제공하여 섭취하도록 한 후 간섬유화 억제효 과가 있는지 살펴보았다(Fig. 1).
순무농축물의 간섬유화 치료효과를 규명하기 위해서 는 5주령 수컷 Sprague-Dawley를 사용하여 각각 40마리씩 두 그룹, 20마리 한 그룹의 TAA 투여군과 10마리씩 세 그룹의 비투여군으로 나누고 위 실험과 같은 농도와 방 법으로 TAA 또는 생리식염수를 투여하였으며 TAA 투여 가 종료된 7주 후에 각 실험군의 세 그룹에 순무농축물 을 0 mg/ml, 45 mg/ml과 90 mg/ml 씩 8주간 공급하였다
(Fig. 1). 실험동물을 이용한 간섬유화 연구에서 섬유화 유도 물질의 투여를 멈추면 섬유화가 완화되는 가역적 인 효과를 보인다고 보고된 바가 있으므로,15) 본 연구에 서는 간섬유화가 완화되는지 여부를 판단하기 위하여 7 주간의 TAA 투여 후 순무농축물 공급 4주째의 각 실험 군에서 10마리씩 부검하여 변화 여부를 추가적으로 확 인하였다. 모든 실험동물에 대해 매주 체중 측정을 실시 하였으며 이상 징후 여부를 관찰하였다. 또한 부검 시 간 중량을 측정하여 순무농축물에 의한 실험동물의 체 중 증가 및 상대적 간 중량에 미치는 영향을 관찰하였다.
모든 동물실험 및 관리는 서울대학교 동물실험윤리위원 회의 윤리적 기준에 의거하여 시행되었다(동물실험 허 가번호: SNU-050804-3).
3. 혈청학적 분석
실험 종료 후 실험동물을 에테르(Junsei Chemical Co., Ltd., Japan) 마취 후 개복하여 사망 전 대동맥으로부터 혈액을 채취한 후 3,000 rpm에서 30분간 원심 분리하여 맑은 혈청을 얻었으며 이를 혈액 분석 기관(서울대학교 병원 임상의학연구소)에 의뢰하여 혈청 내 GOT (gluta- mate oxaloacetate transaminase), GPT (glutamate pyruvate transaminase), T-Bil (total bilirubin), Alb. (albumin) 수치의 변화 정도를 확인함으로써 간 손상 정도를 확인하였다.
4. 병리조직학적 분석
동물 부검 시 간의 좌, 우, 중앙 엽체를 5 mm 두께로 절제하여 10% neutral buffered formalin (Sigma, St. Louis, MO, USA)에 24시간 실온에서 고정하였다. 고정이 끝난 간 절편은 조직 병리학의 일반적인 방법으로 함수, 탈수 처리를 거쳐 파라핀 블록을 만들었다. 파라핀 블록으로 만들어진 조직은 마이크로톰으로 약 4μm 두께의 미세 절편을 만들어 슬라이드 글라스에 부착시키고 수분을 건조시킨 후, 60oC 오븐에서 파라핀을 녹여 조직병리학
적인 염색에 사용하였다. 조직의 전반적인 상태를 관찰 하기 위하여 Hematoxylin & Eosin 염색을 실시하였다. 간 섬유화의 발생 정도를 확인하기 위하여 콜라겐(collagen) 에 특이적으로 염색되는 sirius red 염색을 실시하였다.
Sirius red 염색은 picric acid (Sigma, St. Louis, MO, USA)에 sirius red (Sigma, St. Louis, MO, USA)와 fast green (Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, WI, USA)을 각각 0.1%
의 농도가 되도록 하였으며, 콜라겐의 침착이 있는 부분 은 붉은색으로, 없는 부분은 녹색으로 염색이 되므로 영 상분석시스템(BMI PlusⓇ v2.19, Bartron medical imaging, Largo, MD, USA)으로 콜라겐 침착 부위를 측정하여 섬유 화 정도를 수치화 하였다. 섬유화 정도는 각 시료당 무작 위로 다섯 구역을 측정하여 평균화하였다. 조직병리학 적 현미경 소견에 따라 score 0: no fibrosis, 1: portal fibrosis, 2: periportal fibrosis, 3: septal fibrosis, 4: cirrhosis로 등급을 정해 판독하였다.
5. 통계 처리
모든 결과는 t-test를 통하여 통계적 유의성을 판단하 였다.
결과 및 고찰
1. TAA 및 순무농축물 투여에 의한 실험동물의 체중 증가 및 상대적 간 중량의 변화
사육기간 동안 매주 체중 측정을 통해 TAA 및 순무농 축물 투여가 실험동물의 성장에 미치는 영향을 확인한
Fig 1. Experimental schedule for the study of the anti-hepatic fibrogenetic effect and the therapeutic effects of turnip extracts on liver fibrosis.
Fig. 2. Growth curve of experimental animals. TAA treated groups showed lower body weight gain compared to TAA non-treated group during the experiment. The treatment of turnip extracts seemed to have no effect on body weight gain.
TE, turnip extract.
결과, TAA 투여군은 비투여군에 비해 체중 증가 속도가 감소되었고 동시에 투여한 순무농축물의 농도에는 영향 을 받지 않았다(Fig. 2). 간 손상은 간 기능의 저하 및 체 내 항상성 유지를 위한 여러 효소들의 비정상적인 분비 를 초래하며, 세포증식을 촉진함으로써 표적장기의 중 량을 증가시킨다. 본 연구에서도 TAA를 투여한 모든 실 험군에서 상대적 간 중량이 통계적으로 의미 있는 증가 를 보여주었으며(Fig. 3) 이는 성공적으로 간 손상이 유도 되었음을 의미하는 것이다.
2. 순무농축물 투여에 의한 간섬유화 발생 과정 중 간 효소 변화
혈청 내 GOT, GPT는 간 조직이 손상되었을 때 간에서 그 분비가 증가하는 효소로 알려져 있다.14) 본 연구에서 도 TAA 비투여군에 비해 TAA 투여군에서 GOT, GPT의
수치가 통계적으로 유의한 수준으로 증가함을 확인할 수 있었다(Table 1). GOT의 경우 TAA 투여군 중에서 20 mg/ml의 농도로 순무농축물을 섭취한 실험군에서는 비 투여군과 유사한 수준으로 수치가 낮아짐을 알 수 있었 다. 이러한 사실은 순무농축물이 간 손상을 완화시켰음 을 의미한다. Albumin 수치는 TAA 투여군과 비투여군을 비교했을 때 모든 군에서 통계적으로 의미 있는 감소를 보였으며 이는 TAA에 의한 간 기능 손상을 반영하는 것 이나 순무농축물에 의해서는 영향을 받지 않았다. TAA 투여군에서는 bilirubin의 수치가 비투여군에 비하여 통 계적으로 유의한 수준으로 증가함을 관찰할 수 있었는 데 이는 TAA에 의해 간담도계도 손상을 받는다는 것을 보여주는 소견이다. 그러나 순무농축물 투여가 bilirubin 변화에 영향을 미치지는 않았다. 고농도의 순무농축물 을 투여한 동물들에서 간 효소 및 상대적 간 중량 등에 정상대조군에 비해 특별한 차이를 보이지 않는 것을 볼 때 본 연구에서 사용한 고농도 범위에서는 순무농축물 자체에 의한 간 독성은 없는 것으로 판단된다.
3. 순무농축물에 의한 병리조직학적 간섬유화 발생 억제효과
간 조직의 형태학적 분석을 위하여 H&E 염색을 실시 한 결과 TAA 투여군과 비투여군을 비교했을 때 뚜렷한 차이를 확인할 수 있었다(데이터 생략). TAA 비투여군은 저배율 소견에서 간문맥과 실질이 정상적인 구조를 유 지하면서 일부 큰 문맥에 경도의 림프구 침윤이 관찰되 며 간섬유화의 소견은 보이지 않았다. 반면에 순무농축 물을 공급하지 않은 TAA 단독 투여군에서는 간문맥과 문맥 사이, 혹은 중심 정맥과 간문맥을 연결하는 섬유띠 가 생성되었으며 이러한 심한 간섬유화로 인해 정상 간 분엽은 위축되거나 혹은 재생성 성장으로 결절을 형성 하고 있어 간경변의 전형적인 형태를 관찰할 수 있었다.
Table 1. The effect of turnip extract on liver enzyme levels during hepatic fibrogenesis
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Experimental group GOT (u/l) GPT (u/l) Alb. (g/dl) T-Bil. (mg/dl)
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ
TAA (-) 174.83±17.65 21.67±3.72 3.63±0.18 0.35±0.2
TAA (+)+TE 0 mg/ml 250.36±84.36‡ 72.09±16.15* 3.17±0.36† 0.74±0.19†
TAA (+)+TE 5 mg/ml 214.54±62.39 61.15±13.72 3.06±0.33 0.60±0.13
TAA (+)+TE 10 mg/ml 195.75±36.92 60.42±21.78 3.25±0.36 0.73±0.2
TAA (+)+TE 20 mg/ml 175.27±56.74§ 63±20.31 3.24±0.34 0.65±0.15
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ TAA: thioacetamide, TE: turnip extract.
*Significantly different from TAA (-) (p＜0.001), †significantly different from TAA (-) (p＜0.01), ‡significantly different from TAA (-) (p＜0.05), §significantly different from TAA (+)+TE 0 mg/ml (p＜0.05).
Fig. 3. Relative liver weight of experimental animals. Relative liver weight was significantly increased in all TAA treated groups, but turnip extract treatment did not affect relative liver weight.
TE, turnip extract.
*Significantly different from TAA (-) (p＜0.001).
또한 문맥과 섬유띠를 따라 간과 만나는 부분에 중등도 이상의 림프구성 염증 세포 침윤이 관찰되었다. 순무농 축물을 섭취한 실험군에서는 농도에 따라서 간섬유화가 현저히 경감된 것을 관찰할 수 있었다. 특히 고농도인 20 mg/ml을 섭취한 실험군에서는 간문맥을 연결하는 섬 유띠의 형태는 관찰되지 않았고, 문맥과 문맥 주위로 경 도의 섬유화가 관찰되며 이를 따라 경도의 림프구성 염 증 세포 침윤이 관찰되었다. 반면 간경변에서 관찰되는 재생 결절은 관찰되지 않았다. 따라서 고농도의 순무농 축물에 의해 간섬유화가 효과적으로 억제됨을 확인할 수 있었다.
간섬유화 발생 과정에서 콜라겐 침착 변화 정도를 확 인하기 위하여 sirius red 염색을 실시하였다. TAA 투여로 인한 지속적인 간 손상이 간 조직 전반적으로 콜라겐 침 착을 증가시킨 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4A). 그러나 TAA와 함께 순무농축물을 투여할 경우 농도 증가에 따 라 콜라겐 침착이 줄어드는 것을 관찰할 수 있었다. 특히 본 연구에서 사용한 고농도인 20 mg/ml을 섭취한 실험군 에서는 콜라겐 침착이 현저하게 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 이는 섬유화 정도를 수치화한 그래프에서도 통계적으로 유의하게 감소하여(Fig. 4B) 순무농축물에 의 한 간경변 발생억제 효과를 나타내는 유효한 농도로 판 단하였다.
4. 간섬유화 치료 모델에서 실험동물의 체중 증가 및 상대적 간 중량의 변화
앞선 실험에서 TAA 투여군이 비투여군에 비해 현저 한 성장 억제를 보임을 관찰한 바 있다. 순무농축물의 간경변 치료 효과를 보기 위한 실험에서도 TAA 비투여 군에 비해 투여군에서 성장이 현저히 억제되는 유사한 결과가 나왔다. 앞선 실험에서 TAA를 투여한 군은 비투 여군에 비해 상대적 간 중량이 유의하게 증가함을 이미 확인한 바 있는데, 이 실험에서도 TAA 투여군이 비투여 군에 비해 통계적으로 유의한 수준으로 상대적 간 중량 이 증가하였다.
5. 순무농축물 투여에 의한 간섬유화 치료 모델에서 간효소 변화
TAA 투여 및 순무농축물의 섭취에 따른 실험동물군 의 혈청학적 변화를 관찰하기 위하여 부검 시 채취한 혈 청에서 GOT, GPT, Alb., T-Bil.의 수치를 확인하였다. 간 손상 수치인 GOT, GPT, bilirubin 등의 경우 뚜렷한 변화 는 관찰할 수 없었다. TAA 7주 투여 후 순무농축물을 8주간 투여한 군에서 알부민의 수치가 증가추세를 보이
는 것으로 보아 순무농축물이 간섬유화 회복 과정에서 간 재생에 도움을 주고 있는 것으로 판단된다.
6. 순무농축물 투여에 의한 병리조직학적 간섬유화 치료 효과
순무농축물의 간섬유화 치료 효과를 확인하기 위해 TAA 7주 투여에 의한 간경변 유도 후 8주 동안의 순무농 축물을 투여 하고 부검 후 간 조직의 병리학적 변화를 H&E 염색을 통해 관찰하였다(Fig. 5). TAA 비투여군에서 순무 농축물을 45 mg/ml과 90 mg/ml의 고농도로 투여 하 여도 특이한 병리조직학적 변화는 관찰되지 않았다 (Fig.
5a, b, c). 이러한 결과는 고농도 순무농축물이 간에는 별 다른 독성이 없음을 시사하고 있다. TAA 투여군에서 순 무농축물을 0 mg/ml, 45 mg/ml과, 90 mg/ml의 농도로 섭 취한 실험군에서는 TAA 투여 후 순무농축물을 8주간 급 여했기 때문에 일부 자연적으로 간섬유화가 완화되는 현상을 확인할 수 있었다. 즉 저배율 소견에서 문맥과 문맥을 연결하는 섬유화의 흔적이 관찰되나, 대부분의 섬유성 간질은 사라진 상태이며, 일부 림프구와 재생하 는 간세포가 고배율에서 관찰되었다(Fig. 5d). 그러나 순 무농축물을 45 mg/ml과 90 mg/ml의 농도로 투여한 실험 군에서는 순무농축물을 섭취하지 않은 실험군에 비해 간섬유화가 더욱 완화됨을 확인할 수 있었다. 저배율 소 견에서도 문맥과 문맥을 연결하는 섬유화의 흔적이 관 찰되나, 섬유성 간질은 관찰되지 않았다(Fig. 5e). 특히 90 mg/ml의 순무농축물을 투여한 군에서 간섬유화가 가장 완화된 소견을 보였다(Fig. 5f). TAA 투여 및 순무농축물 의 섭취에 따른 간섬유화 정도를 병리조직학적 소견을 기반으로 수치화하여 치료 효과 정도를 확인한 결과, 순 무농축물을 45 mg/ml 및 90 mg/ml의 고농도로 섭취시킨 경우 간섬유화 지수가 통계적으로 유의한 감소를 보였 다(Fig. 5B).
7주간의 TAA 투여 후 순무농축물을 공급하거나 공급 하지 않은 4주째의 각 실험군에서 10마리씩 부검하여 변 화 여부를 추가적으로 확인한 결과, TAA 투여군 중 순무 농축물을 공급하지 않고 4주 동안 사육한 실험군의 대부 분의 간엽에서는 섬유화가 관찰되지 않았으나, 일부에 서 간문맥과 문맥을 연결하는 섬유띠가 관찰되고 소량 의 림프구 침윤이 문맥에서 관찰되거나 간문맥에서 문 맥 주변으로 침습하는 성상의 섬유화가 관찰되었다(데 이터 생략). 이는 TAA를 7주간 투여한 후 확연히 보이는 간경변 현상이 다소 경감된 형태를 보이는 것이며 TAA 투여를 멈추면 일부 자연적으로 간섬유화가 완화되는 현상이 관찰됨을 의미한다.15) 그러나, TAA 투여군에서
관찰되는 자연적인 완화 현상을 감안하더라도 순무농축 물을 공급한 군에서는 눈에 띄는 간섬유화 치료효과를 확인할 수 있었다.
H&E 염색을 통한 병리조직학적 소견을 재확인하기 위하여 sirius red 염색을 실시하였다(Fig. 6). TAA 비투여 군은 순무농축물 섭취 농도에 상관없이 문맥 내에 정상 적으로 존재하는 간질의 일부가 sirirus red에 염색되었으 나, 문맥을 확장시키거나 문맥을 서로 연결하는 섬유화 는 관찰되지 않았다(Fig. 6A, B, C). 반면 TAA 투여군 중 순무농축물을 섭취하지 않은 경우 문맥과 문맥을 연결 하는 섬유화가 관찰되었다(Fig. 6D). 순무농축물 45 mg/
ml을 섭취한 군에서는 간문맥이 섬유화에 의해 확장되 어 있으며 일부에서 간실질을 따라 섬유화가 진행되어 문맥이 별모양으로 확장되어 있으나 문맥을 연결하는 심한 섬유화는 관찰되지 않았다(Fig. 6E). 순무농축물 90 mg/ml의 농도를 섭취한 경우 일부 문맥에서 콜라겐의 침 착이 관찰되지만 문맥을 연결하는 섬유화나, 문맥 주위 로 확장되는 섬유화는 관찰되지 않으며 TAA 비투여군
과 유사한 콜라겐 침착을 확인할 수 있었다(Fig. 6F).
결 론
본 연구에서는 순무농축물의 간섬유화 억제 효과와 치 료 효과를 연구하기 위한 적합한 실험동물 모델을 확립 하였으며, 이를 바탕으로 7주간의 TAA 투여와 순무농축 물의 섭취로 순무농축물에 의한 간섬유화 억제 효과를 병리조직학적, 혈청학적 분석으로 증명하였다. 또한 TAA 투여 이후 8주간의 순무농축물 투여 실험을 통해 순무농축물이 간섬유화 치료에도 다소간의 효과를 보임 을 증명하였다. 이러한 결과를 바탕으로 앞으로 순무의 간섬유화 억제 유효 성분과 기전에 대한 더욱 깊이 있는 연구가 이어져야 할 것이다.
감사의 글
본 연구는 농림부 농림기술개발사업의 지원에 의해 Fig. 4. Sirius Red Staining (A) and fibrotic area measurement (B) of TAA treated rat liver with different doses of turnip extract.
Fibrotic area decreased signifi- cantly by turnip extracts in a dose of 20 mg/ml.
*Significantly different from TAA (-) (p＜0.001), †significantly dif- ferent from TAA (+)+TE 0 mg/ml (p＜0.05).
A
b: TAA (+) + TE 0 mg/ml d: TAA (+) + TE 10 mg/ml a: TAA ( )-
c: TAA (+) + TE 5 mg/ml e: TAA (+) + TE 20 mg/ml
50
Fibrotic area (%)
0
*
30 20 10
TAA ( )- 0 mg/ml 5 mg/ml 10 mg/ml 20 mg/ml TAA (+)
40
B
TE
a b
d e
c
이루어진 것입니다.
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Fig. 5. Histopathological findings (A) and fibrosis scores (B) of TAA treated and non-treated groups with different doses of turnip ex- tracts for 8 weeks. Turnip extracts show therapeutic effect on hepa- tic fibrosis in a dose dependent manner.
*Significantly different from TAA (+)+TE 0 mg/ml (p＜0.001),†sig- nificantly different from TAA (+) +TE 45 mg/ml (p＜0.001).
TAA ()-TAA (+)
TE 0 mg/ml TE 45 mg/ml TE 90 mg/ml
A
TE 0 mg/ml
TAA (-) TAA (+)
3.0
Fibrosis scores
0.0
TE 45 mg/m
* 2.5
1.5 2.0
1.0 0.5
TE 90 mg/ml
B
a
d e
b c
f
Fig. 6. Sirius red staining of TAA treated and non-treated groups with different doses of turnip extracts for 8 weeks. Turnip ex- tracts show therapeutic effect on hepatic fibrogenesis by decrea- sing collagen synthesis.
A B C
D E F
TAA ()-TAA (+)
TE 0 mg/ml TE 45 mg/ml TE 90 mg/ml
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