녹용 약침이 국소 뇌허혈 모델 백서에서 방사형 미로과제 학습 및 뇌신경 보호에 미치는 영향
김성옥⋅윤대환⋅나창수
동신대학교 한의과대학 경혈학교실
Effect of Cervus Elaphus-Herbal Acupuncture on Focal Ischemia Induced by Inserted Intraluminal Filament
in MCA of Rats
Sung-Ok Kim, Dae-Hwan Youn, Chang-Su Na
Dept. of Meridian & Acupoint, College of Oriental Medicine, Dongshin University
Abstract
Objectives : Cervus Elaphus(CE) has been used to medication for ischemic stroke in the Oriental Medicine. So this study was planned to investigate the effects of CE herbal acupuncture therapy(CE-HAT) on the focal ischemia-induced by intraluminal filament insertion in the rats.
Materials and methods : The focal ischemia was induced by middle cerebral artery occlusion for 2hours. The groups divided into 6 groups, normal(intactness group), control(no therapy group after ischemia-induced), CE-HAT1(Cervus Elaphus-herbal acupuncture therapy group at LR1, HT9 after ischemia-induced), CE-HAT2(Cervus Elaphus-herbal acupuncture therapy group at LU8, KI7 after ischemia-induced), CE-HAT3(Cervus Elaphus-herbal acupuncture therapy group at LR1, HT9, LU8, KI7 after ischemia-induced), CE-HAT4(Cervus Elaphus-herbal acupuncture therapy group at LR1, HT9, HT3, KI10 after ischemia-induced). CE-HAT was carried out during 3 weeks after focal ischemia-induced.
Eight-arm radial maze was used for the behavioral task and neuropretective effect of CE-HAT was observed by Cresyl violet, AchE, ChAT-stain.
Results : The error rate in the eight-arm radial maze task was significantly decreased in CE-HAT1, CE-HAT2, CE-HAT4 on 3days, CE-HAT4 on 4days, CE-HAT2, CE-HAT4 on 5days, CE-HAT3, CE-HAT4 on 6days. The rate of correct choice was significantly increased in CE-HAT4. The density of neurons in the hippocampal CA1 was significantly increased in CE-HAT1, CE-HAT2, CE-HAT3, CE-HAT4, compared to control group. The density of AchE in the hippocampal CA1 was significantly increase in CE-HAT4. The density of ChAT in the hippocampal CA1 was significantly increased CE-HAT1.
Conclusions : These results suggest that the Cervus Elaphus-herbal acupuncture therapy could be used as a medication for controlling the stroke induced by deficiency.
Key words : Cervus Elaphus, herbal acupuncture therapy, acupoint, focal ischemia, intraluminal filament in MCA
▪교신저자 : 나창수 나주시 대호동 동신대학교 한의학과 경혈학교실, Tel. 061-330-3522
* 이 논문은 한국학술진흥재단의 선도연구자지원사업 (과제번호:2003-041-E00312)의 지원에 의하여 수행되었음
‧투고 : 2005/11/24 ‧수정 : 2005/12/13 ‧채택 : 2005/12/19 The Korean Journal of M eridian & Acupoint
Ⅰ. 緖 論
악성종양 및 심장질환과 더불어 인류의 사망 원인 중 많은 부분을 차지하고 있는 질환이 뇌 졸중3-8)의 범주에 속하는 중풍이다. 이는 신경조 직이 재생되지 않는다는 점에서 비가역적인 변 화로 인한 많은 후유증을 남긴다. 뇌허혈 상태에 서 신경세포가 생존할 수 있는 시간은 매우 제 한되어 있어, 혈관폐색으로 인해 산소와 혈당공 급량이 감소하면 신경세포가 손상되어 뇌기능에 장애가 일어나는 것으로 보고 되고 있다1-3).
中風은 風, 火, 氣, 濕痰이 主된 原因으로 氣血 과 眞陰不足, 心火와 肝氣鬱結 등의 內因에 過 飮, 過勞, 過食 등이 複合的으로 연관되어 發生 하는 疾患4)으로 卒然昏倒, 不省人事, 口眼喎斜, 半身不隨, 言語不利 等의 症狀를 나타내며, 淸熱 化痰, 滋陰熄風, 活血化瘀, 平肝潛陽 하는 治法 이 使用되고 있다5-6).
鹿茸은 補氣血, 益精髓, 强筋骨의 효능이 있으 므로 肝腎精血不足이나 下元虛한 경우 등으로 인한 中風 등에 다용되고 있다7).
藥鍼療法은 經絡學說의 원리에 의거하여 각 종 약물을 유관한 穴位나 壓痛點 혹은 觸診으로 얻어진 체표의 陽性 反應點에 주입하여 자극효 과와 약물작용을 동시에 얻음으로써 生體의 機 能을 調整하고 질병치료의 목적을 달성하는 치 료방법으로 최근 다양한 질환에 이용되고 있다
8,9).
녹용약침에 관한 연구로는 안 등10)은 류마티 스 관절염에 대한 억제효과를, 한 등11)은 골형성 촉진 효과를, 박 등12)은 CCl4 중독성 손상간에 대한 회복효과를 각각 보고하였다. 그러나 허혈 성으로 인하여 유발된 실험적 중풍에 녹용 약침 을 시행한 연구보고는 접하지 못하였다.
이에 본 연구에서는 허혈성으로 인하여 발생 되는 중풍 등 뇌 및 심혈관성 질환 등에 적용할
수 있는 녹용약침의 효과를 관찰하기 위하여 실 험적으로 국소 뇌허혈을 유발시킨 백서 모델에 게 녹용약침을 혈위별로 시술한 후 방사형 미로 측정법과 조직화학적기법을 이용하여 행동 및 신경세포 보호작용에 미치는 효과를 관찰한 바, 다음과 같은 지견을 얻었기에 보고하는 바이다.
Ⅱ. 재료 및 방법
1. 실험동물
실험동물은 삼육동물센터로부터 구입한 웅성 Sprague Dawley계 흰 쥐(260∼300 g)로, 일주 일 정도 실험실 환경(온도는 22±3 ℃, 습도는 50±10 %)에 적응시킨 후 사용하였다. 실험동물 은 각 cage 당 3∼4 마리씩 넣어 두었으며, 물과 사료(고형사료: 실험동물 쥐용, 삼양유지[주])를 자유로이 섭취하도록 하였다.
2. 실험군의 구성 및 절차
실험군의 분리는 정상군(Normal group ; No- rmal), ischemia 유발후 무처치군(Control group
; Control), ischemia 유발후 心正格의 補穴인 大 敦, 少衝 鹿茸藥鍼群(Cervus Elaphus- herbal acupuncture therapy group in LR1 HT8 ; CE-HAT1), ischemia 유발후 腎正格의 補穴인 經渠, 復溜 鹿茸藥鍼群(Cervus Elaphus-herbal acupuncture therapy group in LU8 KI7 ; CE- HAT2), ischemia 유발후 心正格의 補穴인 大敦, 少衝과 腎正格의 補穴인 經渠, 復溜 鹿茸藥鍼群 (Cervus Elaphus-herbal acupuncture therapy group in LR1 HT8 LU8 KI7 ; CE-HAT3), ischemia 유발후 心正格인 大敦, 少衝, 少海, 陰 谷 鹿茸藥鍼群(Cervus Elaphus-herbal acupu- ncture therapy group in LR1 HT8 HT3 KI10 ; CE-HAT4)으로 나누었으며, 각 군은 주 2회로
3주간 약침을 시행한 다음 1주일간 방사형 미로 학습을 시행하였으며, 마지막 행동검사를 실시 한 후 조직검사를 하였다.
3. 약물 제법 및 약침 시술
1) 약물 준비
녹용약침액은 대한 약침학회에서 제조 판매 되고 있는 약침액과 희석용 증류수를 구입하여 시료로 사용하였다.
2) 약침 시술
혈위인 大敦(LR1), 少衝(HT9), 經渠(LU8), 復 溜(KI7), 少海(HT3), 陰谷(KI10) 부위 취혈은 인 체와 상응한 곳에 취하였다. 약침은 양측 부위에 시행되었는데, 녹용 1 mg을 희석용 증류수 1 ml 에 희석시켜 각 혈위당 0.089 mg/kg으로 혈위 부위에 개체마다 같은 양으로 환산하여 피하 근 층에 주입하였다
4. Occlusion에 의한 focal ishcemia 유발
국소 뇌허혈은 Longa EZ 등11)의 방법에 따라 중대뇌동맥을 폐색시켜 만들었다. 실험동물을 70 % N2/30 % O2와 혼합된 5 % isoflurane을 이용하여 흡입마취 유도를 한 후 2 % isoflurane 으로 계속 유지시켰다. 흰쥐의 직장에 체온측정 probe를 삽입하고 가온등과 가온 메트리스를 이 용하여 실험기간동안 체온을 38 ℃로 유지하였 다. 중대뇌동맥을 폐색하기 위하여 경부 정중선 을 따라 피부를 절개하고 흉골혀근과 흉골저작 근 사이에 총경동맥을 노출한 후 내경동맥내로 intraluminal filament(￠0.28 mm, rounded tip) 을 삽입하여 그 끝이 중대뇌동맥의 기시부를 지 나 전대뇌동맥의 근위부까지 도달하도록 하였 다. 총경동맥과 외경동맥은 결찰한 후 혈류차단 2시간이 지난 후 filament를 제거하고 우측 총경
동맥을 결찰하여 측부 순환을 통하여 재관류를 시켰다.
5. Eight-arm radial maze task
제작된 8개의 통로가 중앙의 출발영역(central platform)을 중심으로 매 45도(방사형)로 뻗어 나온 형태의 장치를 이용하였다. 중앙 출발 영역 은 직경 50 cm인 원에 내접하는 정팔각형 상자 로 높이는 25 cm이다. 주로는 출발 상자의 각 면에 뚫린 10×25 cm 크기의 통로와 연결되어 있으며, 길이는 70 cm이고 동물이 바깥으로 나 가지 못하게 하였다. 주로의 끝에는 보상으로 제 공하는 먹이나 물을 담을 수 있는 7×5×3 cm 크 기의 용기(음식 접시)가 설치되었다. 실험동물이 주로를 출입하는 행동을 비디오카메라로 녹화하 여 백서가 각 주로를 방문한 횟수와 오류 여부 를 계산하였다. 실험에 들어가기 전 36시간 동안 사육 상자에서 먹이를 박탈하여 배고픔을 유발 시킨 백서를 행동 관찰실로 옮겨와 30분간 환경 에 적응시켰다. 백서를 미로의 출발 상자에 넣고 1분간 두어 상황에 적응 시킨 후 1분이 지나면 각 주로로 통하는 통로를 개방하여 백서가 자유 롭게 미로 속을 돌아다니게 하였다. 쥐가 주로를 방문하여 끝까지 달리면 보상 용기에서 먹이를 먹게 하였다. 그러나 동일한 주로를 반복해서 방 문하면 두 번째 방문부터는 먹이를 제공하지 않 고 반응은 오류로 기록하였다. 백서가 300초 동 안에 8개의 주로를 모두 방문하지 못하면 시행 을 중지시키고, 그 시행은 실패로 간주하였다.
백서가 5일 동안의 획득시행에서 학습 준거에 도달하는 경우 6일째에 기억을 관찰하는 검사시 행을 실시하였다. 검사시행은 4분 동안에 8개의 주로 중 2개의 주로를 택해 들어가면 출발 상자 에 다시 넣어 30초 동안 머무르게 한 후 나머지 6개의 주로 중 정선택 수를 관찰하였으며, 같은
주로를 다시 택하거나, 240초가 경과되면 시행 을 중지시켰다.
6. Immunohistochemistry
1) Cresyl violet 염색법
모든 행동 실험이 끝난 직후 실험동물을 so- dium pentobarbital(100 mg/kg, i.p.)로 마취시킨 후, 0.9 % saline 200 ㎖에 이어 phosphate buffer으로 준비한 4 % formalin 용액(fixative) 800 ㎖로 심장을 통해 관류하였다. 처음 고정액 200㎖은 2분간 빠른 유속으로, 그리고 나머지 800 ㎖은 25분간에 걸쳐 천천히 관류하였다. 고 정이 끝난 쥐는 뇌를 꺼내 같은 고정액으로 2시 간 동안 후고정시키고, 20% sucrose가 함유된 phosphate beffered saline(PBS)에 넣어 4 ℃에 서 하루 동안 보관하였다. 다음날 뇌를 급속 냉 동한 후 뇌조직을 hippocampus 부위를 30 ㎛의 두께로 자랐다. PBS로 조직을 몇 차례 씻고 xylene(5min), 100 % alcohol(2min), 95 % alcohol(1 min), 70 % alcohol(1 min), DW(2 min)순으로 담구어 탈지, 탈수를 시킨 다음 cresyl violet buffer(5 min)로 염색을 하였다. 염 색이 끝난 조직은 광학현미경을 사용하여 고배 율(×400)에서 신경세포의 밀도를 Scion image program(Scion Corp. MD, USA)을 이용하여 측 정하였다.
2) Acetylcholinesterase(AchE) 염색법
뇌 조직을 PBS에 3회 정도 세척한 후 0.1 M sodium hydrogen phosphate buffer(NaH2PO4․ H2O, pH6.0) 325 ㎖에 acetylcholine iodide 250
㎎을 녹인 용액에 0.1 M sodium citrate 25 ㎖, 30mM copper sulfate 50 ㎖, 5 mM potassium ferricyanide 50 ㎖, 증류수 50 ㎖을 넣어 혼합한 후 수초간 기다리면 엷은 녹색을 나타내는데 이
때 뇌 조직을 넣고 실온에서 1∼2시간 동안 배 양하였다. 모든 처리를 거친 뇌 조직을 광학현미 경으로 관찰하였다. 200×200 ㎛ 크기의 miros- cope 4각 격자(rectangle grid)를 사용하여 100 배로 확대하여 hippocampus에서 AchE 신경세 포의 밀도를 Scion image program(Scion Corp.
MD, USA)을 이용하여 측정하였다.
3) Choline acetyltransferase(ChAT) 염색법 뇌 조직을 PBS에 3회 정도 세척한 후 ChAT 유전자 발현 연구에 가장 널리 사용되고 있는 primary sheep polyclonal ChAT antibody(Ca- mbridge Research Biochemicals, Wilmington, DE, USA)를 사용하였다. 1차 항체는 PBS에 0.3
% Triton X-100 첨가한 PBST에서 2 % 토끼 혈청과 0.1 % sodium azid(Sigma, St. Louis, MO, USA)로 2000배 희석하여 준비하였다. 뇌 조직은 1차 항혈청에 4 ℃에서 72시간 동안 지 속적으로 흔들어 주면서 배양하였다. 그 후 3번 이상 조직을 PBST로 씻은 다음 2시간 동안 실 온에서 2 % 토끼 혈청을 함유하는 PBST에서 200배 희석한 biotinylated anti-sheep serum (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) 에 반응시켰다. PBST로 3번 씻은 다음, 뇌 조직 은 실온에서 2시간 동안 Vectastain Elite ABC reagent(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)에 담구었다. PBS로 몇 번 헹군 다음 조직 을 nickel chloride로 강화시키고 착색제로서 diaminobenzidine을 사용하여 발현시켰다. 통제 군 조직에는 1차 항체를 생략하거나 nonimmu- no sheep serum으로 대체하였는데 이들 두 경 우 다 특정 표지가 나타나지 않았다.
모든 처리를 거친 뇌 조직을 gelatine-coated slide에 고정하고 공기를 제거하면서 커버글라스 를 덮은 후 광학현미경으로 100배로 확대하여 hippocampus에서 ChAT-immunoreactive 신경
세포의 밀도를 Scion image program(Scion Corp. MD, USA)을 이용하여 측정하였다.
7. 통계처리
모든 측정값은 평균값 표준오차(mean±SE)로 표시하였고, 각 실험군간의 통계학적 분석은 Window용 SPSS를 이용하였다. 각 집단간 행동 측정치의 비교는 repeated ANOVA test를 시행 하였고, 면역조직화학분석법의 측정값은 one- way ANOVA를 시행하였으며, 사후검정은 Tu- key test를 적용하였다. 전체 실험의 통계적인 유의성은 신뢰구간 P<0.05에서 의미를 부여하 였다.
Ⅲ. 結 果
1. 방사형 미로 학습의 획득시행동안 주 로 오선택 횟수
방사형 미로 학습에서 오선택 수를 측정하는 획득시행 실험에서 대조군은 정상군에 비하여 높은 수치를 보여주었다. 1일째에 대조군이 5.7±0.32회인 것에 비하여 실험군 모두 유의한 변화가 없었으며, 2일째에 대조군이 7.5±0.14 회 인 것에 비하여 실험군 모두 유의한 변화가 없 었으며, 3일째에 대조군이 4.3±0.40 회인 것에 비하여 CE-HAT1군이 2.4±0.69 회(P<0.01),
CE-HAT2군이 2.7±0.80 회(P<0.01), CE-HAT4 군이 3.0±0.53 회(P<0.05)로 유의한 감소를 보였 으며, 4일째에 대조군이 4.8±0.42 회인 것에 비 하여 CE-HAT4군이 2.6±0.38 회로 유의한 감소 (P<0.01)를 보였으며, 5일째에 대조군이 6.1±
0.42 회인 것에 비하여 CE-HAT2군이 2.9±0.46 회(P<0.05), CE-HAT4군이 3.2±0.28 회(P<0.01) 로 유의한 감소를 보였으며, 6일째에 대조군이 4.2±0.26회인 것에 비하여 CE-HAT3군이 1.9±
0.57 회(P<0.01), CE-HAT4군이 2.4±0.38 회 (P<0.01)로 유의한 감소를 보였다.
즉 대조군에 비하여 3일째에는 CE-HAT1군, CE-HAT2군, CE-HAT4군이, 4일째에는 CE- HAT4군이, 5일째에는 E-HAT2군, CE-HAT4 군이, 6일째에는 CE-HAT3군, CE-HAT4군이 각각 유의한 감소를 나타내었다(Table 1, Fig.
1).
2. 방사형 미로 학습의 검사시행동안 주로 정선택율
방사형 미로 학습에서 정선택율을 측정하는 검사시행에서 정상군이 52.4±9.22 %의 정선택율 을 보였다. 대조군이 41.7±10.35 %인 것에 비하 여 CE-HAT1군이 61.1±5.14 %, CE-HAT2군이 60.0±8.45 %, CE-HAT3군이 44.4±5.14 %, CE-HAT4군이 66.7±6.30 %를 각각 나타내었 다.
Table 1. The Number of Incorrect Choice during Testing in the Radial Eight-arm Maze Task
Group 1day 2day 3day 4day 5day 6day
Normal 3.2±0.18** 3.1±0.47** 3.5±0.23** 3.0±0.38** 2.9±0.43** 1.9±0.13**
Control 5.7±0.32 7.5±0.14 4.3±0.40 4.8±0.42 6.1±0.42 4.2±0.26
CE-HAT1 4.3±0.52 5.3±0.49 2.4±0.69** 2.4±0.76 4.2±0.61 4.5±0.73
CE-HAT2 3.5±0.33 4.1±0.45 2.7±0.80** 3.4±0.61 2.9±0.46* 3.1±0.37
CE-HAT3 3.4±0.54 3.5±0.71 3.9±0.40 4.3±0.25 4.2±0.50 1.9±0.57**
CE-HAT4 4.2±0.15 4.8±0.60 3.0±0.53* 2.6±0.38** 3.2±0.28** 2.4±0.38**
대조군에 비하여 CE-HAT4군이 유의하게 높 은(P<0.01) 정선택율을 나타내었다(Fig. 2).
3. Cresyl violet을 이용한 신경세포 손상 방어 효과
Hippocampal CA1 부위를 cresyl violet에 염 색하여 신경세포의 손상방어 효과를 관찰한 결 과, 정상군이 68.8±1.49 (density), 대조군이 54.9±0.44 (density), CE-HAT1군이 65.8±1.74 (density), CE-HAT2군이 66.5±1.18 (density), CE-HAT3군이 68.0±3.80 (density), CE-HAT4 군이 63.0±2.33 (density)를 각각 나타내었다.
대조군에 비하여 정상군, 실험군 모두 유의하 게 증가된(P<0.01) 밀도를 나타내었다(Fig. 3, 4).
4. Acetylcolinesterase(AchE)발현
Hippocampal CA1 부위의 AchE 발현정도를 관찰한 결과, 정상군이 39.1±4.27 (density), 대조 군이 28.7±4.27 (density), CE-HAT1군이 34.7±2.64 (density), CE-HAT2군이 33.0±2.13 (density), CE-HAT3군이 35.8±3.98 (density), CE-HAT4군이 34.8±1.92 (density)를 각각 나타 내었다.
대조군에 비하여 CE-HAT4군이 유의하게 증 Fig. 2. Effect of Cervus Elaphus-herbal acupunc- ture therapy on the percent of correct choice during testing in the radial eight-arm maze task.
The task was started on the 4th week after focal brain injury, and performed four trials per day for 6days. Results are shown as mean±SE. Normal, intactness group.
Control, no therapy group after ischemia- induced. CE-HAT1, Cervus Elaphus-her- bal acupuncture therapy group at LR1, HT9 after ischemia-induced. CE-HAT2, Cervus Elaphus-herbal acupuncture therapy group at LU8, KI7 after ischemia-induced. CE- HAT3, Cervus Elaphus-herbal acupunc- ture therapy group at LR1, HT9, LU8, KI7 after ischemia-induced. CE-HAT4, Cervus Elaphus-herbal acupuncture therapy group at LR1, HT9, HT3, KI10 after ische- mia-induced. *, P<0.05, **, P<0.01 as compared with the control group.
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Normal Control CE-HAT1 CE-HAT2 CE-HAT3 CE-HAT4
% of correct choice
**
Fig. 1. Effect of Cervus Elaphus-herbal acupunc- ture therapy on the incorrect choice during testing in the radial eight-arm maze task.
Acquisition curves of the eight-arm radial maze task in focal brain injury. The task was started on the 4th week after focal brain injury, and performed four trials per day for 6days. Results are shown as mean±SE.
Normal, intactness group. Control, no therapy group after ischemia-induced.
CE-HAT1, Cervus Elaphus-herbal acupu- ncture therapy group at LR1, HT9 after ischemia-induced. CE-HAT2, Cervus Ela- phus-herbal acupuncture therapy group at LU8, KI7 after ischemia-induced. CE- HAT3, Cervus Elaphus-herbal acupunc- ture therapy group at LR1, HT9, LU8, KI7 after ischemia-induced. CE-HAT4, Cervus Elaphus-herbal acupuncture therapy group at LR1, HT9, HT3, KI10 after ischemia- induced., P<0.05, **, P<0.01 as compared with the control group.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 2 3 4 5 6
Normal Control
CE-HAT1 CE-HAT2
CE-HAT3 CE-HAT4
Number of errors
(Days)
** ** ** **
**
*
****
***
** **
**
**
가(P<0.05)된 밀도를 나타내었다(Fig. 5, 6).
5. Choline acetyltransferase(ChAT)발현
Hippocampal CA1 부위의 ChAT 발현정도를 관찰한 결과, 정상군이 43.9±1.54 (density), 대조 군이 28.7±2.35 (density), CE-HAT1군이 36.8±
1.45 (density), CE-HAT2군이 34.2±2.97 (den- sity), CE-HAT3군이 32.8±2.95 (density), CE- HAT4군이 33.0±2.40 (density)를 각각 나타내었 다.
대조군에 비하여 CE-HAT1군에서 유의한 증 가(P<0.05)를 나타내었다(Fig. 7 ,8).
Ⅳ. 考 察
고혈압을 비롯 고지혈증, 비만증, 당뇨병, 심
장질환 등 뇌졸중 발생을 촉진하는 위험인자에 대하여 적극적인 치료 및 예방을 통하여 뇌졸중 의 발생빈도가 줄어들고는 있으나14-16)아직도 단 일장기 질환중 흔한 사망원인이 되고 있어14-19) 中風에 대한 관심이 계속되고 있으며, 국내에서 도 식생활 및 생활환경의 변화로 인하여 폐쇄성 뇌혈관 질환인 뇌경색이 증가하고 있는 추세1,20) 이다.
經絡은 인체내 氣血運行의 생체반응 계통으 로 내부로는 五臟六腑, 외부로는 體表와의 상관 성을 갖는 생리적, 병리적 반응통로가 되는 것으 로, 刺鍼療法은 이러한 經絡을 이용하여 인신의 氣血 순환을 조절하는 체계이다6).
鍼刺療法은 穴位의 刺戟을 통해 經絡 臟腑의 有餘 및 不足의 불균형상태를 회복시키는 것으 로6) ≪靈樞․經脈篇≫21)의 “盛則瀉之, 虛則補之”
에서 유래하여≪難經․六十九難≫22)의 “虛者補其 母, 實者瀉其子”로 발전하였다.
五輸穴은 四肢肘膝 이하에 있는 井滎輸經合 의 다섯 特定穴로서 五行學說과 結合되어 木火 土金水 특성을 가지고 있으면서 각 經絡의 性能 을 附與 받아 서로 영향을 미쳐 相生相克함으로 써 그 기능에 과부족이 없게 작용하는 혈위이 다.23,24)
中風은 風, 火, 氣, 濕痰이 주된 원인으로 氣血 과 眞陰不足 心火와 肝氣鬱結 등 內因이 기본이 되며, 여기에 過飮, 過勞, 過食 등이 복합적으로 연관되어 발생하는 질환으로4), 補氣血, 益精髓 强筋骨하는 養血助陽의 효과가 있는 녹용 등으 로 치료 한다7). 또한 중풍에 대한 주된 치료법의 하나로 침구치료에서 調氣를 위해 氣血을 소통 시킨다는 면에서 임상상 다용되는 주요한 경혈 들로는 心正格과 腎正格 혈위들이 쓰이고 있다.
이러한 작용을 볼 때 心正格의 補穴, 腎正格 의 補穴, 心正格의 補穴과 腎正格의 補穴 배합 Fig. 3. Effect of Cervus Elaphus-herbal acupunc-
ture therapy on the density of cresyl violet in the hippocampal CA1.
Results are shown as mean±SE. Normal, intactness group. Control, no therapy group after ischemia-induced. CE-HAT1, Cervus Elaphus-herbal acupuncture therapy group at LR1, HT9 after ischemia-induced. CE- HAT2, Cervus Elaphus-herbal acupunc- ture therapy group at LU8, KI7 after ische- mia-induced. CE- HAT3, Cervus Elaphus- herbal acupuncture therapy group at LR1, HT9, LU8, KI7 after ischemia-induced.
CE-HAT4, Cervus Elaphus-herbal acupu- ncture therapy group at LR1, HT9, HT3, KI10 after ischemia-induced. **, P<0.01 as compared with the control group.
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Normal Control CE-HAT1 CE-HAT2 CE-HAT3 CE-HAT4
Density
** ** ** **
**
및 心正格 穴位에 鹿茸藥鍼 주입이 뇌허혈시 신 경세포의 손상을 방어하고 뇌빈혈상태를 개선시 킬 수 있는 작용이 있을 것으로 기대되어, 국소 허혈이 유발된 뇌손상 모델을 녹용약침을 시행 한 후 행동학적 검사와 신경방어 효과를 관찰하 였다.
본 모델은 흰쥐의 뇌에 공급되는 혈관들을 차
단한 후 주위 혈관을 통해 재관류하게 되면 주 로 hippocampus부분의 신경세포가 손상을 입게 되는데, 5∼7일이 경과되면 apoptosis와 비슷한 세포 손상과 인지 및 학습장애를 일으키게 되는
것으로25,26), 광범위하지 않고 前腦에만 혈류감소
가 유발되지만 後腦에서는 혈류가 영향을 받지 않아, 호흡과 체순환에 영향을 주지 않는다는 점 Fig. 4. Representive microphotographs of coronal sections in the hippocampal CA1.
A, normal group ; B, control group ; C, CE-HAT1 group ; D, CE-HAT2 group ; E, CE-HAT3 group ; F, CE-HAT4 group. Cresyl violet-stain. ×400.
A B
C D
E F
에서 허혈로 인한 신경손상의 연구에 다용되고 있다. 본 모델에서 뇌허혈후 재관류로 인한 신경 세포의 손상은 다른 부위에 비해 hippocampus 의 CA1 pyramidal neuron들에서 선택적으로 발 생된다26,27).
그 기전은 아직 명확히 밝혀진 바는 없으나, 허혈 후 주어진 자극에 대한 예민성 증가에 의 한 신경세포의 과활동, 칼슘을 매개로 하는 글루 탐산 흥분독성, 미토콘드리아 손상과 단백질 합 성의 장애, 유리산소기에 의한 손상, 에너지 대 사와 뇌의 혈액순환 이상 등이 관여할 것으로 여겨지고 있으며28), 최근 치료약물로 glutamate receptor antagonists26), calcium channel anta- goist29), GABA neurotransmission 촉진제30), NOS inhibitiois31), antidoxidants32)등이 연구되 고 있으나 효과와 안정성문제가 제기되고 있다.
hippocampus는 medial septal nucleus에 위치한 세포체로 부터 투사되는 콜린성 신경전달경로로 써33), 학습수행 및 기억력에 관여하여 뇌허혈 등 으로 인한 hippocampus의 손상은 방사형 미로 와 같은 공간 기억과제를 학습하는 능력에 장애 를 보이게 된다.34,35) 본 실험에서도 대조군에서 학습장애와 신경방어 작용이 현저히 낮아진 것 으로 관찰되었다.
방사형 미로는 주로 정보가 처리되고 있는 동 안에 그것을 유지하는 작업기억을 바탕으로 하 는 학습능력과 기억력을 알아보기 위한 장치로 뇌조직 및 약물이 방사형 미로 학습과 기억에 미치는 영향36-39) 등을 관찰하기 위하여 주로 사 용된다.
본 실험에서는 녹용약침을 시행하여 단기기 억의 정상적인 기능에 가장 중추적 역할을 하고, 미로수행에 관여되는 공간 위치에 대한 단기기 억을 중계하는 hippocampus의 손상방어 효과를 관찰하였다.
그 결과 오행로 선택 수를 측정하는 획득시행 에서 3일째에는 CE-HAT1군, CE-HAT2군, CE-HAT4군이, 4일째에는 CE-HAT4군이, 5일 째에는 E-HAT2군, CE-HAT4군이, 6일째에는 CE-HAT3군, CE-HAT4군이 각각 유의한 감소 를 나타내었다. 정행로 선택율을 측정하는 검사 시행에서는 CE-HAT4군에서 통계적으로 유의 성 있게 증가함을 볼 수 있었다. 이는 뇌허혈로 인한 중풍에 대한 학습장애 및 기억력의 회복효 과에서 녹용약침이 유의한 영향을 보임을 알 수 있었으며, 특히 CE-HAT4군에서는 오행로, 정 행로 선택율에서 모두 유의성있는 변화가 있었 는데 다른 군에 비교해도 탁월함을 알 수 있었 다.
방사형 미로에서 나타난 효과를 조직학적으 로 평가하기 위해 Cresyl violet염색과 AchE, Fig. 5. Effect of Cervus Elaphus-herbal acupunc-
ture therapy on the density of AchE in the hippocampal CA1.
Results are shown as mean±SE. Normal, intactness group. Control, no therapy group after ischemia-induced. CE-HAT1, Cervus Elaphus-herbal acupuncture therapy group at LR1, HT9 after ischemia-induced. CE- HAT2, Cervus Elaphus-herbal acupunc- ture therapy group at LU8, KI7 after is- chemia-induced. CE- HAT3, Cervus Elap- hus-herbal acupuncture therapy group at LR1, HT9, LU8, KI7 after ischemia- induced. CE-HAT4, Cervus Elaphus-her- bal acupuncture therapy group at LR1, HT9, HT3, KI10 after ischemia- induced. *, P<0.05, as compared with the control group.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Normal Control CE-HAT1 CE-HAT2 CE-HAT3 CE-HAT4
Density
*
*
ChAT의 발현정도를 관찰하였다. 신경세포의 손 상정도를 관찰하는 Cresyl violiet염색에서는 Control군에 비해서 CE-HAT1군, CE-HAT2군, CE-HAT3군, CE-HAT4군에서 통계적으로 유 의성 있는 증가를 보였다.
Cholinergic system은 신경전달물질인 Ace-
tylcholine(Ach), Ach의 합성효소인 ChAT, Ach 을 분해하는 분해효소인 AchE 및 Ach 전달물 질의 수용체가 포함된다. 그 중 AchE는 choli- nergic synapse에 존재하여, 신경전달 물질인 Ach를 choline과 acetic acid로 가수분해시키는 효소이다40). 이 효소는 post-sysnaptic mem- Fig. 6. Representive microphotographs of coronal sections in the hippocampal CA1.
A, normal group ; B, control group ; C, CE-HAT1 group ; D, CE-HAT2 group ; E, CE-HAT3 group ; F, CE-HAT4 group. AchE-stain. ×100.
A B
C D
E F
brane의 수용체에 결합하는 Ach를 가수분해시 켜 수용체의 정상적인 기능을 유지시키며, Ach 의 생합성에 필요한 choline을 공급함으로써, 신 경계가 원활하게 작용하는데 매우 중요한 역할 을 하게 된다. 특히 hippocampus는 기억장애에 관계되는 구심성 및 원심성 신경섬유가 가장 많 이 연결되는 부위이다. hippocampus와 신피질 로 투사하는 기저전 뇌콜린계 신경단위의 상실 즉, medial septum, diagonal band, nuclues basalis of Meynert에 있는 choline계 신경단위 의 상실로 인해 투사 부위인 대뇌피질 및 hippocampus 부위에서 pre-synaptic choline계 지표가 극도로 감소하게 되며41), basal forebrain cholinergic system내의 ChAT활성도 감소는 acetylcholine감소를 초래하여 기억력 및 여러 학습능력 저하와 집중력의 이상을 유발하게 된
다.42,43)
본 실험에서는 hippocampal CA1 부위의 AchE 발현정도가 CE-HAT4군이 유의하게 증 가된 밀도를 나타내었으며, hippocampal CA1 부위의 ChAT 발현정도를 살펴본 결과는 CE-HAT1군에서 유의한 증가를 나타내었다.
이상의 실험 결과로 보아 녹용약침이 백서의 중대뇌동맥을 폐색시켜 유발된 허혈성 국소 뇌 손상 모델에 대한 관찰한 결과 방사형 미로를 이용한 행동학적 변화에 있어 공간 학습능력 및 기억측정에서 유효한 회복이 관찰되었고, 신경 화학적 변화에 있어서도 hippocampal CA1에서 choline성 뉴런의 보호 작용에 일정한 효과를 관 찰하였으며, 특히 CE-HAT4군의 경우 거의 모 든 항목에서 통계적 유의성이 있는 변화를 보임 으로써 약침액의 농도에도 일정한 영향이 있음 을 증명하고 있다.
향후 心正格의 補穴, 腎正格의 補穴, 心正格의 補穴과 腎正格의 補穴 배합, 그리고 心正格의 혈 위들과 녹용약침의 상호작용과 그 기전에 대해 서는 보다 상세한 연구가 필요할 것으로 사료된 다.
Ⅴ. 結 論
虛血로 인한 중풍 등 뇌 및 심혈관성 질환 등 에 적용할 수 있는 鹿茸藥鍼의 효과를 관찰하기 위하여 실험적으로 국소 뇌허혈을 일으킨 백서 모델에게 혈위별 시술 후 방사형 미로 측정법과 조직화학적기법을 이용하여 행동 및 신경세포 보호 작용에 미치는 효과를 관찰한바 다음과 같 Fig. 7. Effect of Cervus Elaphus-herbal acupunc-
ture therapy on the density of ChAT in the hippocampal CA1.
Results are shown as mean±SE. Normal, intactness group. Control, no therapy group after ischemia-induced. CE-HAT1, Cervus Elaphus-herbal acupuncture therapy group at LR1, HT9 after ischemia-induced. CE- HAT2, Cervus Elaphus-herbal acupunc- ture therapy group at LU8, KI7 after ische- mia-induced. CE-HAT3, Cervus Elaphus- herbal acupuncture therapy group at LR1, HT9, LU8, KI7 after ischemia-induced.
CE-HAT4, Cervus Elaphus-herbal acu- puncture therapy group at LR1, HT9, HT3, KI10 after ischemia-induced. *, P<0.05, as compared with the control group.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Normal Control CE-HAT1 CE-HAT2 CE-HAT3 CE-HAT4
Density
*
*
은 결과를 얻었다.
1. 방사형 미로 학습의 오선택 수를 측정에서 대조군에 비하여 3일째에는 CE-HAT1군, CE-HAT2군, CE-HAT4군이, 4일째에는 CE-HAT4군이, 5일째에는 E-HAT2군, CE-HAT4군이, 6일째에는 CE-HAT3군, CE-HAT4군이 각각 유의한 감소를 나타
내었다.
2. 방사형 미로 학습의 정선택율 측정에서 대 조군에 비하여 CE-HAT4군이 유의하게 높은 정선택율을 나타내었다.
3. Hippocampal CA1 부위 cresyl violet 염색 에 의한 신경세포의 손상방어 효과 측정에 서 대조군에 비하여 CE-HAT1군, CE- Fig. 8. Representive microphotographs of coronal sections in the hippocampal CA1.
A, normal group ; B, control group ; C, CE-HAT1 group ; D, CE-HAT2 group ; E, CE-HAT3 group ; F, CE-HAT4 group. ChAT-stain. ×100.
A B
C D
E F
HAT2군, CE-HAT3군, CE-HAT4군 모두 유의하게 증가된 밀도를 나타내었다.
4. Hippocampal CA1 부위의 AchE 발현에서 대조군에 비하여 CE-HAT4군이 유의하게 증가된 밀도를 나타내었다.
5. Hippocampal CA1 부위의 ChAT 발현에서 대조군에 비하여 CE-HAT1군에서 유의한 증가를 나타내었다.
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