Fibronectin과RGDS tetrapeptide가골모세포의Osteopontin 발현에미치는영향

145

목 적 :본 연구는 fibronectin과 RGDS 염기물이 골모세포의 증식 및 분화에 미치는 영향을 관찰하고자 하였다.

대상 및 방법 : TCPS 및 AW-GC 표면에 배양된 골모세포에 FN 및 RGDS 합성 염기물을 처리한 후, 세포 수, [³H]

thymidine 분석 및 알칼리 인산 효소측정을 이용하여 골모세포의 증식 및 분화를 관찰하였으며 배양된 세포에서 RNA를 추 출하여 OPN mRNA의 발현을 역전사 중합효소 연쇄반응을 통해 관찰하였다. 또한 이들 각각의 세포에서 단백질을 추출하 여 정량하고 western blotting으로 OPN의 발현 차이를 관찰하였다.

결 과 :모든 군에서 부착된 골모세포 수는 시간이 지남에 따라 증가하였고, 특히 FN을 처리한 TCPS 및 AW-GC에서 모두 의미있게 증가하였다(P<0.03). RGDS 염기물과 FN을 같이 처리한 군은 대조군에 비해 세포증식이 증가하였으나 FN 단독 처리군보다는 오히려 증식이 감소하였다(P<0.05). OPN mRNA의 발현 양은 TCPS와 AW-GC 모두에서 FN을 처리한 군이 대 조군에 비해 2배 증가하였고, RGDS 염기물을 처리한 군도 대조군에 비해 OPN mRNA 발현이 증가하였다(P<0.05). OPN 단 백질의 합성 양은 FN을 처리한 군이 대조군에 비해 5배 증가되었고, RGDS 염기물 또는 FN과 RGDS 염기물을 함께 처리 한 군도 대조군에 비해 OPN 단백질의 합성이 증가하였다(P<0.05).

결 론 :FN은 골모세포의 증식 및 분화를 촉진하는 강력한 부착물질이며, 골모세포의 RGD integrin 수용에 의한 신호전달 은 골모세포의 분화보다는 증식과정에 중요한 역할을 한다고 사료된다.

색인 단어 :골모세포, Fibronectin, RGDS 합성 염기물, A-W 세라믹, Osteopontin

145

Fibronectin과 RGDS tetrapeptide가 골모세포의 Osteopontin 발현에 미치는 영향

한석구∙김형민*∙최남용∙김호건**∙하재도

가톨릭대학교 의과대학 성바오로병원, 성가병원 정형외과*, 한양대학교 공과대학 화학과**

서 론

세포는 세포간 또는 세포외 기질과 상호 연관작용으로 항상성 을 유지하며, 세포와 세포외 기질간 상호작용은 세포 표면에 존 재하는 단백질 수용기 즉, integrin family에 의해 이루어진다⁸⁾. Integrin은 세포의 분화, 증식 및 이주에 관여하며, adhesion- promoting protein인 RGD tripeptide (Arg-Gly-Asp) 염기를 통해 결합한다¹⁵⁾. 세포외 기질내 RGD를 염기를 갖는 단백은 bone sialoprotein, fibronectin (FN), laminin, osteopontin (OPN), osteonectin (ON) 등이 있으며, 세포의 종류에 따라 그 분포와 작용이 다르다. 골모세포는 부착세포이며, 세포외 기 질에 존재하는 OPN, FN, ON 등이 골모세포의 기질과의 부착 에 관여하는 것으로 알려졌다¹⁾. FN은 integrin과 결합하는 대 표적인 단백질로 골모세포가 FN과 결합하면 세포에 기계적 자

극을 준 것과 같은 반응을 나타내며, RGDS 합성 염기물(Arg- Gly-Asp-Ser)은 골모세포의 OPN 발현을 촉진한다고 알려졌 다²⁾. 즉, 골모세포의 integrin (RGD ligand)과 RGD 염기서열 을 갖는 물질의 결합만으로도 세포의 분화가 증가되어 골화를 유도한다고 볼 수 있다. 이에 본 연구는 정형외과적으로 사용되 는 생체활성형 세라믹에 FN 및 RGDS 합성 염기물을 처리 후 골모세포의 증식과 분화의 변화를 관찰함으로써 재질 표면에서 부착단백질을 매개한 세포 반응을 파악하고자 하였다.

연구 대상 및 방법 1.

실험에 사용된 AW-GC는 SiO2-P2O5-CaO-MgO계의 유리 분말을 가열하여 apatite (Ca10 [PO4]6[OF]2)와 -wallas- tonite (CaO∙SiO2) 결정을 석출시켜 만든 삼상체로써, SiO2

36.81 wt%, CaO 49.41 wt%, P2O5 8.70 wt%, MgO 5.00 wt%, CaF2 0.56 wt%의 조성으로 이루어져 있으며 기공률은 46-58%이다. 세포배양을 위해 지름 3.0 cm, 두께 3 mm의 disc 형태인 절편을 만들었으며, 평균 수 접촉각(water contact 145

145 통신저자 : 한 석 구

서울시 동대문구 전농 2동 620-56

가톨릭대학교 의과대학 성바오로병원 정형외과 TEL: 02-958-2491∙FAX: 02-959-2159

E-mail: sghan@sph.cuk.ac.kr

*본 논문은 제 6차 대한정형외과연구학회 정기 학술대회에서 구연되었음.

*본 논문은 2000년도 가톨릭대학교 성바오로병원의 임상연구비 지원을 받아 이루어졌음.

angle)은 44±5도였고 크기는 평균 9.6 cm³이었다.

2.

생후 24시간 이내의 Spraque-Dawley 흰쥐의 두개관을 효소 분해하여 골모세포를 분리하였다⁷⁾. T-25 세포배양 용기에 1.2- 1.4×10⁶개의 세포를 분주하여 습도 95%에 온도를 37℃로 유 지하면서 95% air와 5% CO2를 공급하여 배양하였다.

3. Fibronectin

RGDS tetrapeptide

TCPS 및 AW-GC 표면에서 골모세포를 배양하였으며, 각 각을 4개의 소군으로 나누어 제 1군은 부착물질을 처리하지 않 고 배양한 군(TCP1, AW1)으로 대조군이며, 제 2군은 FN을 처리한 군(TCP2, AW2), 제 3군은 RGDS 염기물을 처리한 군(TCP3, AW3), 제 4군은 FN과 RGDS 염기물을 같이 처리 한 군(TCP4, AW4)이다. FN의 도말은 실험 직전 40 g/mL 을 표면에 도말하였으며, RGDS 염기물은 50 g/mL를 각 군 의 배양액에 첨가하였다.

4.

1) 세포 증식

4차례 계대배양된 골모세포를 TCPS 및 AW-GC 표면에 분 주 후, 6, 24 및 48시간에 부착된 세포를 떼어 Coulter count로 세포 수를 측정하였다.

2) [³H] thymidine labeling

배양된 골모세포의 DNA 합성능을 알기위해 Wu 등²²⁾의 방 법을 이용해 [³H]-thymidine 편입 정도를 측정하였다. 측정 24 시간 전, 각 well에 10 Ci/mL [³H]-thymidine 농도로 처리 하고 aqueous/non-aqueous scintillation cocktail을 넣은 후, 세포를 용해하여 -counter로 측정하였다.

3) 알칼리 인산효소 활성 측정

골모세포의 증식능력을 관찰하기 위해 Lowry 등¹⁰⁾의 방법을 이용하여 부착된 세포의 알칼리 인산효소 활성도를 측정하였다.

즉, p-Nitrophenyl Phosphate+H2O p-Nitrophenol +phosphate의 반응시 발생하는 p-Nitrophenol (nmols/min/

cell)을 405 nm의 흡광도에서 분광광도계로 측정하였다.

5. RNA

각 군의 2×10⁶개 골모세포로부터 Ultraspec II kit (Biotecx)를 이용하여 총 RNA를 분리¹⁶⁾한 후, cDNA를 합성 하였다. Oldberg 등¹³⁾의 보고를 인용하여 OPN (199 bp)의 시

발체 염기서열은 5^′-TCCAAGGAGTATAAGCAGAGGGC- CA-3^′, 5^′-CTCTTAGGGTCTAGGACTAGCTTGT-3^′이었 고, 내부 대조 유전자인 GAPDH (309 bp)의 시발체 염기서열 은 5^′-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3^′, 5^′-AGATCCA- CAACGGATACTT-3^′이었다. 중합효소 연쇄반응 후, 2%

agarose gel로 전기영동한 후 ethium bromide로 염색하여 자외 선 방사선 투과기상에서 증폭 유무를 확인하고 영상분석기와 농 도계측기를 이용하여 분석을 하였다.

6. Western blotting

정량된 추출 단백질과 같은 양의 Laemmli's SDS-PAGE sample buffer를 섞어 가열 후, 변성화된 각 검체를 Tris- glycine gel에 전기영동하였다. XCell II Blot Module을 이용하 여 전기영동된 gel의 단백질을 nitrocellulose membrane에 전이 시켰다. membrane은 nonfat dried-milk로 처리 후, primary anti-OPN antibody를 반응시켰다. Peroxidase-conjugated gout IgG에 반응시킨 후, tetramethyl-benzidine용액으로 발색 하여 면역반응 양성물질을 확인하였으며 image analyzer를 이 용하여 정량하였다.

7.

통계적 유의성에 대한 검사는 SPSS V8.0 program을 이용 하여 paired 또는 unpaired t-test와 one-way and two-way analysis of variance (ANOVA) 방법을 적용하였으며, P 값 이 0.05 미만인 경우를 통계적 의미가 있다고 하였다.

결 과 1.

1.2-1.4×10⁶의 골모세포를 TCPS와 AW-GC에 분주하고 6, 24 및 48시간 후, 부착된 세포를 떼어 세포 수를 측정하였다.

골모세포는 TCPS 및 AW-GC 모두 FN을 처리한 군에서 각 각의 대조군에 비해 세포 수가 증가하였다(P<0.03). RGDS 염 기물 또는 FN과 RGDS 염기물을 같이 처리한 군은 대조군에 비해 세포 수가 증가하였으나 통계학적 유의성은 없었다.

RGDS 염기물과 FN을 같이 처리한 군은 FN 단독 처리군보다 골모세포의 수가 적었다(P<0.03)(Fig. 1).

2.

H

-thymidine

[³H]-thymidine assay에 의한 DNA 합성 양의 측정 결과, TCPS 및 AW-GC에서 모두 FN을 처리한 군에서 대조군에 비

ALP

해 DNA의 합성 양이 의미있게 증가되는 소견을 보였으며 (P<0.03), 시간이 지남에 따라 합성 양이 증가하였다(P<0.05).

또한 RGDS 염기물은 대조군에 비해 thymidine의 세포내 융합이 증가하였으나(P<0.05), FN과 RGDS 염기물을 같이 처리한 군에 3H-Thymidine Incorporation (dpm, ×1,000)

24 hrs 48 hrs

75

50

25

0

TCP 1 TCP 2 TCP 3 TCP 4

Fig. 2.Dpm counts in osteoblasts labeled with [³H] thymidine cultured for 24 and 48 hours.

3H-Thymidine Incorporation (dpm, ×1,000)

24 hrs 48 hrs

75

50

25

0

AW 1 AW 2 AW 3 AW 4

% attached cells

6 hrs 24 hrs 48 hrs

400

300

200

100

0

TCP 1 TCP 2 TCP 3 TCP 4

% attached cells

6 hrs 24 hrs 48 hrs

400

300

200

100

0

AW 1 AW 2 AW 3 AW 4

Fig. 1.Cell count of osteoblasts attached to TCPS and AW-GC cultured for 6, 24 and 48 hours. TCP1, non-treated; TCP2, +FN; TCP3, +RGDS; TCP4, +FN+RGDS. AW1, non-treated; AW2, +FN; AW3, +RGDS; AW4, +FN+RGDS, respectively. Error bars stand for means±standard deviation for n=3.

p-Nitrophenol (nmol/min/cell) Absorbance (405 nm)

6 hrs 24 hrs 48 hrs

200

150

100

50

0

TCP 1 TCP 2 TCP 3 TCP 4

Fig. 3.Alkaline phosphatase assay for osteoblastic proliferation. Enzyme activity is expressed as nM of p-Nitrophenol phosphate conversion and is normalized to cell (× 10^-6).

p-Nitrophenol (nmol/min/cell) Absorbance (405 nm)

6 hrs 24 hrs 48 hrs

200

150

100

50

0

AW 1 AW 2 AW 3 AW 4

서는 FN 단독 투여군보다 오히려 합성 양이 적었다(Fig. 3).

3.

TCPS 및 AW-GC에서 6시간 및 24시간 배양 후 알칼리 인 산효소의 활성도는 FN을 처리 후 대조군에 비해 효소의 활성도 가 크게 증가하였다(P<0.03). RGDS 염기물 및 RGDS 염기물 과 FN을 같이 처리한 군에서는 대조군에 비해 증가하였으나, 통계학적 유의성은 없었다. 48시간 배양 후 알칼리 인산효소의 활성도는 TCPS 및 AW-GC에서 모두 24시간 배양 후 측정된 효소의 측정치보다 낮았다(Fig. 2).

4.

osteopontin mRNA

24시간 배양 후 OPN mRNA의 발현 양은 TCPS 및 AW-GC 모두 FN을 처리군이 각각의 대조군에 비해 2배의 증가를 나타내 었다. 또한 RGDS 염기물을 처리한 군도 대조군에 비해 OPN mRNA의 발현 양이 의미있게 증가하였다(P<0.05)(Fig. 4).

5. Western blotting

TCPS에서 24시간 배양한 골모세포의 OPN 단백 양은 AW- GC에서 배양한 군보다 발현이 많았다(P<0.03). FN을 처리한 군은 대조군에 비해 OPN 단백의 발현 양이 각각 5배 증가되었 다. RGDS 염기물을 처리한 군과 FN 및 RGDS 염기물을 같이 처리한 군도 대조군에 비해 OPN 단백의 발현 양이 의미있게 증가하였다(P<0.05)(Fig. 5).

고 찰

골조직은 골모세포 및 파골세포 등의 골세포와 세포외 기질로 구성되며, 기질은 대부분 type 1 콜라젠과 OPN, FN, vit- ronectin 등의 인산 단백질로 형성된다. 골모세포는 증식단계에 서 fibronectin (FN), collagen, TGF- 등을 발현하며, 분화 단계 초기 alkaline phosphatase을 분비하고 분화단계 후기인 골형성기에 osteopontin, osteocalcin 등을 발현한다. 또한 골모 세포는 세포외 기질에 부착되어 증식, 분화 단계를 거쳐 골조직 을 생성하며, 기질내 단백질은 골모세포와 기질간의 부착에 관 여한다⁸⁾. 이러한 단백질은 RGD의 공통적인 염기서열을 갖고 있으며, 세포막에 존재하는 수용기(integrin)가 RGD 염기서열 을 인식하여 세포내 신호전달을 하게 된다^6,13). 44-kDa phos- phoprotein¹⁴⁾또는 bone sialoprotein¹⁴⁾으로 불리우는 OPN²¹⁾은 골모세포와 파골세포의 부착물질로 골조직 뿐만 아니라 신장, 심장, 폐 등의 다른 조직에도 존재하며 세포의 부착, 증식 및 분 화를 통한 조직 형성과 창상 치유, 암세포의 전이 및 배형성에 도 중요한 역할을 한다고 보고되었다^1,9). 단백질을 매개로한 세 포 상호간 및 세포와 기질간 물리적 결합은 생화학적인 신호로 전달되어 세포의 분자 생물학적인 변화를 초래하며 이를 기계적 형질도입이라 한다²⁸⁾. 또한 OPN은 골모세포의 증식, 분화 및 골형성기 전반에 걸쳐 발현되며 골형성기로 분화될수록 증가한 다고 알려져 있고²³⁾, 골모세포를 기계적으로 자극하면 발현이 증가한다¹⁸⁾. Carvalho 등²⁾은 FN으로 골모세포 배양 24시간 후, OPN mRNA 발현이 3-4배 증가한다고 하였고, 그 기전은 tyro- sine protein kinase의 활성화에 기인한다고 하였다. FN은 RGD 염기서열을 갖고 있으며 alkaline phosphatase, OPN 또는 osteo- Fig. 4.Gel electrophoresis of RT-PCR products amplified from

extracts of cellular RNA. OPN mRNA (199 bp), GAPDH mRNA (309 bp). lane M; 100 bp ladder, 1-4; on AW-GC, 5-8; on TCPS : 1, non-treated; 2, +FN; 3, +RGDS; 4, +FN and RGDS: 5, non- treated; 6, +FN; 7, +RGDS; 8, +FN and RGDS, respectively.

normal control fibrone ctin RGDS FN+RGDS

1 2 3 4 5 6 7 8 M

199 bp→

309 bp→

Amount (%)

AW-GC TCPS

100

50

0

Fig. 5.Western immunoassay of OPN (44 kD). lane M; ladder marker, 1-4; on AW-GC, 5-8; on TCPS: 1, non-treated; 2, +FN; 3, +RGDS; 4, +FN and RGDS: 5, non-treated; 6, +FN; 7, +RGDS;

8, +FN and RGDS, respectively.

normal control fibronectin RGDS FN+RGDS

M 1 2 3 4 5 6 7 8

←44 kDa

Amount (%)

AW-GC TCPS

150

100

50

0

calcin보다 초기의 골모세포 분화 및 성장시기에 발현하여 세포 외 기질과 부착 초기단계에 관여한다²¹⁾. RGD 염기서열은 FN 의 cell-binding 부위 염기서열로, FN을 매개한 세포의 adhe- sion시 integrin subunit의 phosphorylation에 중요한 기능을 하 며, RGDS 합성 염기물은 세포의 integrin과 FN의 aggregation 을 막아 골모세포의 증식 및 분화를 억제한다고 알려져 있으나

3,12,15), 골모세포와 RGDS 염기물의 결합은 OPN의 발현을 오히

려 증가시키며, 이는 integrin의 점유(occupancy)가 OPN 단백 의 발현유도에 필요한 세포내 신호전달의 필요조건일 가능성을 의미한다²⁾.

본 연구에서는 FN을 처리한 군이 골모세포 수 및 DNA 합 성 양 모두 대조군에 비해 증가하였으며 시간이 지남에 따라 이 러한 변화는 더욱 뚜렷이 관찰되었다. 그러나 알칼리 인산효소 활성도는 FN을 도말한 6시간 배양 후, 대조군에 비해 2배 증가 하였으나 48시간 배양 후 대조군과의 차이는 적었다. 이는 알칼 리 인산효소의 활성이 골모세포 분화과정 초기에 발생하기 때문 이라고 사료된다. RGDS 염기물을 처리한 군에서는 대조군에 비해 골모세포의 증식이 유의하게 증가하지 않았으며, FN과 병 행 처리시 오히려 세포증식이 FN 단독 처리군보다 감소하여 Chen 등³⁾의 결과와 유사하였다. RGDS 염기물 처리 후, 대조 군에 비해 OPN mRNA의 발현은 증가하였으며, OPN 단백질 합성도 FN을 처리한 군이 대조군에 비해 5배가 증가되었고, RGDS 염기물을 처리 후 골모세포의 OPN 단백의 생성이 증가 하였다. 이상의 결과로 RGD 염기에 의한 골모세포 integrin의 점유는 세포의 증식을 촉진하며, 분화과정도 촉진하는 경향이나 확실하지는 않은 것으로 사료된다.

본 연구에서는 TCPS와 AW-GC에서 부착단백질인 FN으로 골모세포의 증식과 OPN 단백질의 발현을 유도하였다. 이러한 부착단백질을 이용한 재질표면의 생체활성 증가는 AW-GC 뿐 만 아니라 다른 정형외과적 재질에도 적용이 가능할 수 있을 것 으로 사료된다. 그러나 AW-GC에서는 TCPS에서 배양된 세포 군에 비해 증식 및 OPN 단백의 발현이 낮았다. 이는 생체합성 물의 세포독성에 기인한 것으로 사료되며, 그 원인에 대해서는 아직 확실하지 않지만, Hyakuna 등⁵⁾은 배양액내의 Ca, P와 albumin의 감소와 glass ceramics의 화학적 조성 및 기공률의 차이에 따라 세포독성이 발생한다고 하였으며, Matsuda 등¹¹⁾ 은 ceramic에서 분비되는 알칼리 이온이 배양세포의 성장 저하 를 일으킨다고 하였다. 그러나 Wilson 등²⁰⁾이 지적한대로 인체 내 사용시 세포배양 실험과는 다르게 세포독성이 체액의 완충효 과에 의한 상쇄를 기대할 수도 있다고 본다.

현재까지 인체 골조직과 같은 골 대체재는 아직 없으며, 부착 단백질을 이용한 AW-GC의 생체적합성 향상을 위한 본 실험 의 취지는 의미가 있다고 사료된다. 다만 본 실험에서는 48시간 내의 초기 배양된 골모세포의 반응을 관찰한 바, 그 임상적 적 용은 향후 많은 연구가 진척되어야 가능할 것으로 사료된다.

결 론

FN은 골모세포의 증식 및 분화를 촉진하는 강력한 부착물질 이며, RGDS 합성 염기물은 골모세포의 OPN 발현을 증가시키 고, 골모세포의 RGD integrin 점유에 의한 신호전달은 골모세 포의 분화보다는 증식과정에 중요한 역할을 한다고 사료된다.

참고문헌

1. Akiyama SK, Nagata K and Yamada KM: Cell surface receptors for extracellular matrix components. Biochem Biophys Acta, 1031: 91-110, 1990.

2. Carvalho RS, Schaffer JL and Gerstenfeld LC:Osteoblasts induce osteopontin expression in response to attachment on fibronectin. J Cell Biochem, 70: 376-390, 1998.

3. Chen WT, Wang J, Hasegawa T, Yamada SS and Yamada KM:

Regulation of fibronectin receptor distribution by transformation, exoge- neous fibronectin and synthetic peptides. J Cell Biol, 103: 1649-1662, 1986.

4. Fisher LW, Hawkins GR, Tuross N and Termine JD:Purification and partial characterization of small proteoglycans I and II, bone sialopro- teins I and II, and osteonectin from the mineral compartment of develop- ing human bone. J Biol. Chem, 262: 9702-9708, 1987.

5. Hyakuna K, Yamamuro T, Kotoura Y, et al: The influence of calcium phosphate ceramics and glass-ceramics on cultured cells and their sur- rounding media. J Biomed Mater Res, 23: 1049-1066, 1989.

6. Hynes RO:Integrins: Versatility, modulation, and signaling in cell adhesion. Cell, 69: 11-25, 1992.

7. Ishaug SL, Yaszemski MJ, Bizios R and Mikos AJ: Osteoblast func- tion on synthetic biodegradable polymers. J Biomed Mater Res, 28: 1445- 1453, 1994.

8. Juliano RL and Haskill S:Signal transduction from the extracellular matrix. J Cell Biol, 120: 577-585, 1993.

9. Liaw L, Skinner MP, Raines EW, Ross R, Cheresh DA and Schwartz SM:The adhesive and migratory effects of osteopontin are mediated via distinct cell surface integrins. J Cell Invest, 95: 713-724, 1995.

10. Lowry OH, Roberts NR, Wu ML, Hixon WS and Crawford EJ:

The quantitative histochemistry of brain. J Biol Chem, 207: 19-37, 1954.

11. Matsuda T, Yamauchi K and Ito G:The influence of bioglass on the growth of fibroblasts. J Biomed Mater Res, 21: 499-507, 1987.

12. Moursi AM, Globus RK and Damsky CH:Interactions between integrin receptors and fibronectin are required for calvarial osteoblast dif- ferentiation in vitro. J Cell Sci, 110: 2187-2196, 1997.

13. Oldberg A, Franzen A and Heinegard D:Cloning and sequence

analysis of rat bone sialoprotein (osteopontin) cDNA reveals an Arg-Gly- Asp cell-binding sequence. Proc Natl Acad Sci, 83: 8819-8823, 1986.

14. Prince CW, Oosawa T, Butler WT, et al: Isolation, characterization, and biosynthesis of a phosphorylated glycoprotein from rat bone. J Biol Chem, 262: 2900-2907, 1987.

15. Puelo DA and Bizios R:RGDS tetrapeptide binds to osteoblasts and inhibits fibronectin-mediated adhesion. Bone, 12: 271-276, 1991.

16. Puissant C and Houdebine L:An improvement of the single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloro- form extraction. Biotech, 8: 148-149, 1991.

17. Smith JH and Denhardt DT: Molecular cloning of a tumor promoter- inducible mRNA found in JB6 mouse epidermal cells: induction is stable at high, but not at low, cell densities. J Cell Biochem, 34: 13-22, 1987.

18. Toma CD, Ashkar S, Gray ML, Schaffer JL and Gerstenfeld LC:

Signal transduction of mechanical stimuli is dependent on microfilament integrity. Identification of osteopontin as a mechanically induced gene in

osteoblasts. J Bone Miner Res, 12: 1626-1636, 1997.

19. Watson PA: Function follows form: generation of intracellular signals by cell deformation. FSSEB J, 5: 2013-2019, 1991.

20. Wilson J, Pigott GH, Schoen FJ and Hench LL: Toxicology and bio- compatibility of bioglasses. J Biomed Mater Res, 31: 805-817, 1981.

21. Winnard RG, Gerstenfeld LC, Toma CD and Franceschi RT:

Fibronectin gene expression, synthesis, and accumulation during in vitro differentiation of chicken osteoblast. J Bone Miner Res, 10: 1969-1977, 1995.

22. Wu Y, Tewari M, Cui S and Rubin R: Activation of insulin-like growth factor-1 receptor inhibits tumor necrosis factor-induced cell death.

J Cell Phys, 168: 499-509, 1996.

23. Zohar R, Lee W, Arora P, Cheifetz S, McCulloch C and Sodek J:

Single cell analysis of intracellular osteopontin in osteogenic cultures of fetal rat calvarial cells. J Cell Physiol, 170: 88-100, 1997.

Purpose :To investigate the effect of fibronectin (FN) and/or RGDS tetrapeptide on osteoblastic proliferation and osteopontin expression.

Materials and Methods :Osteoblasts were cultured on tissue culture polystyrene (TCPS) and apatite-wallastonite glass ceramics (AW-GC) with or without FN and RGDS synthetic tetrapeptide.

Osteoblastic proliferation and differentiation were measured after cultivation, by determining the number of attached cells, by [³H]-thymidine assay, and by measuring the activity of alkaline phos- phatase. The expression of osteopontin (OPN) was determined by RT-PCR and western blotting.

Results : Cellular proliferation was more increased by FN than the other variables examined (P<0.03). OPN mRNA expression by RT-PCR was induced two-fold, 24-hour after FN treatment (P<0.05). The expression of OPN by western blotting showed a five-fold increase in cells treated with FN compared with the controls. The synthetic RGDS peptides partially blocked the growth of cells induced by FN (P<0.05). RGDS tetrapeptide alone increased the OPN expression induced by cultured osteoblasts (P<0.05).

Conclusion :FN enhanced osteoblastic proliferation on glass ceramics and induced OPN expression. Integrin occupancy by RGD-containing molecules may play a role in the process of osteoblastic proliferation rather than in osteoblastic differentiation.

Key Words : Osteoblast, Fibronectin, RGDS synthetic tetrapeptide, AW-GC, Osteopontin

The Influence of Fibronectin and/or RGDS Tetrapeptide on Osteopontin Expression in Cultures of Rat Calvarial Osteoblasts

Suk Ku Han, M.D., Hyoung Min Kim, M.D.*, Nam Yong Choi, M.D., Ho Gun Kim**, and Jae Do Ha, M.D.

Department of Orthopedic Surgery, St. Paul’s Hospital and Holy Family Hospital*, The Catholic University of Korea, Seoul;

Department of Chemistry, Han Yang University**, Ansan, Korea

Abstract

Address reprint requests to Suk Ku Han, M.D.

Department of Orthopedic Surgery, St. Paul’s Hospital, The Cathdic University of Korea 620-56, Jeonnong-dong, Dongdaemoon-gu, Seoul 130-202, Korea

Tel : +82.2-958-2491, Fax : +82.2-959-2159 E-mail: sghan@sph.cuk.ac.kr

1. 2002년 대한골관절종양학회 춘계학술대회

�일 시: 2002년 3월 29일(금) 오후 1시-오후 6시

�장 소: 서울대병원 임상의학연구소 대강당

�연 락 처: (우)110-744 서울시 종로구 연건동 28 서울대병원 정형외과 이상훈, 김한수

Tel: (02) 760-2364, 2362, Fax: (02) 764-2718, E-mail: sanghoon@plaza.snu.ac.kr

2. 제 1차 국제 연골 및 관절염 심포지엄 안내

The 1^stInternational Cartilage and Arthritis Symposium May 2-3, 2002, Seoul, Korea

대한관절경학회와 대한류마티스학회는 2002년 5월 2일부터 3일까지 서울 메리어트호텔에서 제 1차국제 연골 및 관 절염 심포지엄을 개최합니다. 이번 심포지엄은 연골 및 관절염 분야의 세계적인 석학들의 초청주제강연으로 구성되 며“New Concepts and Therapeutics of Arthritis”이라는 주제로 연골의 재생을 위한 세포와 조직 공학 및 유전 자 치료에 대하여 집중적으로 토론하게 될 것이며 새로이 밝혀지고 있는 관절염의 병리 기전과 연골염의 조기 진단 을 위한 marker에 대한 최신 연구동향을 다루게 될 것입니다. 아무쪼록 관심있는 임상의, 기초의, 연구원, 학생 여러 분들의 적극적인 참여를 부탁드립니다.

3. 제 13차 한∙일합동정형외과 심포지엄

�일 시: 2002년 7월 4일-6일

�장 소: 강원도, 피닉스파크 리조트

�초록마감: 2002년 4월 30일

�초록제출: 사무국

�조직위원장: 서울시 동대문구 회기동 1 경희대학병원 정형외과 유명철 교수(우: 130-702) Tel: 02-958-8364/967-1638, Fax: 02-966-0015

Email: mcyookuh@chollian.net

�사 무 국: 서울시 중구 소공동 51

Marine Center New 빌딩 5층 한진관광(우: 100-770) Tel: 02-726-5556, Fax: 02-778-2514

Email: jychoi@kaltour.com

자세한 내용은 조직위원회 homepage (www.kaltour.com/kojcos2002)를 참조하시기 바랍니다.

많은 관심과 협조를 바랍니다.

관련학회소식