Synthesis and Functionalization of Upconversion Nanoparticles for Bioimaging

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Synthesis and Functionalization of Upconversion Nanoparticles for Bioimaging

Hye In Cho, Jae-Seung Lee

^†

Department of Materials Science and Engineering, Korea University, 145 Anam-ro, Seongbuk-gu, Seoul 02841, Republic of Korea

바이오 이미징을 위한 업컨버전

나노입자(upconversion nanoparticles)의 합성 및 특성화

조혜인, 이재승^† 고려대학교 신소재공학부

(Received August 8, 2018; Accepted August 23, 2018)

바이오세라믹

특 집

CERAMIST

https://doi.org/10.31613/ceramist.2018.21.3.01 Ceramist

Vol. 21, No. 3, pp. 270~282, 2018.

Abstracts

The increasing importance of biomedical imaging technology has led to the development of a variety of luminescent materials, including molecular fluorophores, fluorescent proteins, and quantum dots. Owing to their inherent disadvantages, such as insufficient chemical stability and limited biocompatability, their utilization has been limited with imaging only under highly optimized and controlled conditions. Recently, a new class of luminescent nanoparticles, upconversion nanoparticles (UCNPs), have been emerging as a practically useful nanoprobe for various bioimaging applications. The detailed synthesis, functionalization, properties and in-vitro / in-vivo applications of the UCNPs are introduced and discussed in this Review.

Keywords: UCNP, Bioimaging, Photoluminescence

1. 서론

바이오 이미징은 분자 영상 기술이라고도 불리며, 생물 체 내의 생물학적 또는 화학적 변화를 분자 수준에서 영 상화하여 관찰하는 기법이다. 바이오 이미징은 영상을 얻 는 광신호의 생성 원리에 따라 여러 종류로 구분되며, 생

체에서 생성된 빛을 영상으로 이용하는 광학 영상(optical

imaging), 방사선 반응에 의해 발생하는 광자를 이용하

는 핵의학영상(nuclear imaging), 자기장 속에 놓여있

는 원자핵에서 발생하는 자기공명신호를 영상화하는 자

기공명영상(magnetic resonance imaging), 그리고, X

선을 투사하여 얻은 정보를 영상으로 이용하는 컴퓨터 단

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CERAMIST

바이오 이미징을 위한 업컨버전 나노입자(upconversion nanoparticles)의 합성 및 특성화 바이오세라믹

특 집

층촬영영상(computed tomography) 등으로 나눌 수 있 다. 이 중 광학 영상 기법은 크게 비싼 장비를 필요로 하 지 않으면서 영상의 민감도 및 분해능이 상대적으로 좋 고, 방사선을 사용하지 않기 때문에 임상적으로 활용 가 능성이 가장 높으며, 매우 활발하게 연구되고 있다. 과거 에는 발광 물질로서 유기 염료 분자(organic fluoro- phores), 형광 단백질(fluorescent proteins), 반도체 나 노결정(양자점, quantum dots)이 바이오 이미징에 대표 적으로 많이 사용되어왔다. 유기 염료 분자와 형광 단백 질은 크기가 작아서 생체 적합성(biocompatibility)이 우 수하고, 표면 개질(surface modification)이 용이하지 만, 화학적으로 불안정하고 짧은 시간 내에 광표백 현상 (photobleaching)이 일어난다. 따라서 굉장히 짧은 시간 동안만 형광 측정이 가능하기 때문에 검출 시간이 제한된 다는 한계가 있다.

^1,2)

게다가 이 형광물질들은 일반적으로 자외선 또는 가시광선에 의해 여기 되기 때문에 생물체 내의 조직에서 자가 형광(autofluorescence)을 일으키 고, DNA를 손상시키거나 세포를 사멸시켜서 민감도가 좋지 않을 뿐만 아니라, 신호 대 잡음비(signal-to- noise ratio)가 낮다.

³⁾

이러한 단점을 보완하면서, 높은 양자 수득률(quantum yield)과 광 안정성이 특징인 양 자점이 등장하였다. 양자점은 일반적으로 아연(Ⅱ), 카드 뮴(Ⅱ), 셀레나이드, 황화물의 조합으로 구성되어 있다.

양자점 합성에 부가적으로 사용되는 수많은 성분과 도펀 트(dopant)들이 발견되어져 있고, 표면을 개질하고, 껍 질을 씌우는 등의 다양한 방법들이 개발되어 왔다. 양자 점은 광 양자 효과(photonic quantum effect)로 인해 별 도의 형광체가 도핑 될 필요가 없고, 방출하는 빛의 색깔 과 세기가 쉽게 조절 가능하기 때문에 개발 당시부터 큰 화제였으며, 이후 매우 광범위하게 연구되어왔다. 게다 가 양자점은 팽윤(swelling) 되거나 광표백 현상이 일어 나지 않는 장점 역시 주목할 만하다. 하지만 모든 양자점 은 500 nm 이상의 광 여기를 필요로 하기 때문에 바이오 물질들은 이 빛을 흡수하여 내부 필터 효과(inner filter effect)를 유발하고, 결국 형광이 충분히 강하게 나타나 지 못하는 단점이 있다. 또한 양자점의 형광 강도가 시간 에 대해 일정하게 유지하지 않고 변하는 광깜빡임 현상 (photoblinking)도 바이오 이미징의 발광체로서 적절하 지 못한 특성이라 볼 수 있으며, 온도에 의해 양자점의 발 광이 변할 수 있고, 비활성의 껍질을 입히지 않으면 세포 독성이 있어서 생물학적인 응용에 제한이 있다는 큰 한계 가 존재한다.

⁴⁾

최근 업컨버전 나노입자(upconversion nanoparti- cles, UCNP)는 유기 염료 분자, 양자점 등의 형광체를 대신할 물질로 각광받고 있다. 대부분의 UCNP는 3 가의 란타넘 족 이온(Er(Ⅲ), Yb(Ⅲ), Tm(Ⅲ) 등)이 도핑된 육

Fig. 1. 세 가지의 발광성 나노물질 비교: 유기 염료 분자(왼쪽), 양자점(중간), 란타넘 족 원소가 도핑된 UCNP(오른쪽), 두 개의 스톡스 발광

특성을 가지고 있는 물질(유기 염료 분자, 양자점)과는 달리, UCNP는 여기 에너지보다 더 높은 광자 에너지를 가지는 안티스톡스 발

광 특성을 가진다.

⁵⁾

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조혜인, 이재승

특 집

CERAMIST

각형의 NaYF

4

나노결정으로 구성되어 있으며, 기존의 하향 변환식(downconversion)의 형광 물질과는 달리 두 개 이상의 광자가 순차적으로 빛 에너지를 흡수하면서 여 기 파장보다 짧은 파장 영역인 자외선 또는 가시광선 영 역의 에너지를 방출한다.

²⁾

UCNP는 다양한 색을 띤 빛을 방출하는데 이 색들은 란타넘 족의 도펀트에 의해 변하는 피크 파장에 의존한다. UCNP의 크기는 양자 수득률에 영향을 미치며, 10 ~ 100 nm 로 폭넓게 조정할 수 있다.

최근에는 은 나노입자의 핵에 UCNP의 껍질을 씌워서 기 존의 은 나노입자 핵이 없는 UCNP에 비해 밝기가 30 배 증가한 것을 관찰하였다.

⁶⁾

HeLa 세포를 이미징하기 위 해 사용된 이 Ag@SiO

2

@Lu

2

O

3

:Gd/Yb/Er UCNP는 3 개의 층의 핵-껍질-껍질 구조를 가진다. 뿐만 아니라, 은을 코팅하여 발광 세기가 증가한 경우도 있다.

⁷⁾

이러한 많은 장점들 때문에 바이오 이미징, 질병 치료, 약물 전 달 시스템에서 활발하게 사용되고 있다. 무엇보다도 UCNP는 형광이 세포의 자가 형광에 의해 전혀 방해받지 않기 때문에 바이오 이미징에 매우 적합한 입자라 할 수 있다. 게다가 독성이 없고 쉽게 배설되기 때문에 생체에 이용하기 적합하고, 크기가 작은 UCNP는 세포 투과성도 좋다. 양자점과 마찬가지로 팽윤되거나 광표백 현상이 일 어나지 않으며, 안티스톡스(anti-Stokes) 이동이 크고, 방출 대역폭이 좁아서 종래의 방법보다 향상된 선택성 및 감도를 보여줄 잠재력이 있다(Fig. 1). 그러나 발광이 온 도에 크게 좌우된다는 문제점이 여전히 존재하며, 이는 차후 점진적으로 해결되어야 할 문제라 할 수 있다.

UCNP는 란타넘 족 이온으로 구성되어 있는데, 란타넘 족 이온은 광자의 업컨버전(photon upconversion)이라 고 알려진 과정을 통해 장파장의 근적외선 여기 방사선이 단파장의 가시광선으로 변환되는 독특한 발광 특성을 가 지고 있다. 업컨버전은 중간 파장의 장수명(long-lived) 에너지 상태를 통해 두 개 이상의 펌프 광자를 연속적으 로 흡수한 다음, 펌프 파장보다 더 짧은 파장의 방사선을 방출하는 비선형 광학 프로세스이다.

⁸⁾

업컨버전 프로세 스는 여기 상태 흡착(excited state absorption, ESA), 에너지 전달 상향 변환(energy transfer upconversion, ETU), 광자 전자 사태(photon avalanche, PA) 이렇게

크게 세 가지로 분류가 된다. 이 세 가지 과정 모두 두 개 이상의 광자가 연속적으로 에너지를 흡수하면서 일어난 다는 공통점이 있다. ESA의 경우에는 Fig. 2(a)에서 볼 수 있듯이 단일 이온에 의해 펌프 광자가 연속적으로 에 너지를 흡수한다. 여기 에너지가 기저 준위인 G에서 여 기된 준안정 준위인 E1로 전이될 때의 에너지와 같으면, 포논이 흡수되고, G에서 E1으로 이동하게 된다. 이 과정 을 기저 상태 흡수(ground state absorption, GSA)라고 한다. 그리고 두 번째 펌프 광자는 E1에서 더 높은 상태 인 E2로 이온을 이동시켜서 최종적으로 E2에서 G로 업 컨버전 방출이 일어난다. ETU는 두 개의 광자를 준안정 준위로 이동시키기 위해 연속적인 흡수를 이용한다는 점 에서 ESA와 비슷하다. 하지만 ETU는 여기가 두 인접한 이온 사이의 에너지 전달을 통해 이뤄진다. 두 개의 이웃 하는 이온은 각각 동일한 에너지를 흡수하여 준안정 준위 인 E1에 위치한다. 비방사 에너지 전달 과정은 하나의 이 온을 더 높은 방출 준위인 E2로 갈 수 있게 하지만 다른 이온은 기저 준위인 G로 내려오게 된다. 인접한 도펀트 이온들 사이의 평균 거리를 결정하는 도펀트의 농도는 ETU 공정의 업컨버전 효율에 중요한 역할을 한다(Fig.

2(b)). 마지막으로 PA를 유발하는 업컨버전은 특정 임계 값보다 높은 펌프 강도를 필요로 하는 펌프 메커니즘이 특징이다. PA 공정은 비공진(non-resonant)의 약한 GSA로 인해 E1에 위치하는 것으로 시작한다. 그리고 공 진(resonant)의 ESA에 의해 위쪽에 위치한 가시광선 방 사 준위인 E2로 올라간다. 준안정 준위에 위치하게 된 후

Fig. 2. 란타넘 족 원소가 도핑된 UCNP의 대표적인 공정들: (a) 여기

상태 흡수(ESA), (b) 에너지 전달 상향 변환(ETU), (c) 광자 전

자 사태(PA). 파선/점선, 파선, 실선의 화살표는 각각 광자의

여기, 에너지의 전달, 방출 과정을 나타낸다.

⁸⁾

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CERAMIST

바이오 이미징을 위한 업컨버전 나노입자(upconversion nanoparticles)의 합성 및 특성화

에는 여기된 이온과 인접한 기저 상태의 이온 사이에서 교차 이완 에너지 전달(cross-relaxation energy transfer) 또는 이온 쌍 완화(ion pair relaxation) 가 발 생하여 두 이온 모두 중간 단계 준위인 E1을 차지하게 된 다. 두 이온은 쉽게 E2 레벨을 채워 교차 이완을 시작하 고, ESA에 의해 E2의 이온 분포가 기하급수적으로 증가 하여 마치 눈사태처럼 강력한 업컨버전 방출이 일어난다 (Fig. 2(c)).

이 세 가지 공정의 업컨버전 발광 효율은 서로 크게 차 이가 난다. ESA는 가장 비효율적인 업컨버전 공정이다.

준안정한 중간 준위가 펌프 에너지 저장소의 역할을 할 수 있는 PA는 ESA보다 훨씬 효율적이지만, PA 공정은 펌프 전력에 의존하고 ESA의 수많은 회로 반복과 교차 이완 프로세스 때문에 여기에 의한 반응이 상당히 느리다 (최대 수 초 이내)는 단점이 존재한다. 이에 반해, ETU는 즉각적이고 펌프 전력에 독립적이어서 지난 10년 간 고효 율의 업컨버전(ESA 보다 두 배 크다.) 공정으로 널리 사 용되었다.

2. 본론

2.1 UCNP의 합성

대부분의 무기 결정은 상온에서 업컨버전 발광을 일으

키지 않기 때문에 UCNP는 결정성의 호스트와 호스트 격 자(host lattice)에 낮은 농도로 도핑된 란타넘 족의 도펀 트 양이온으로 구성된다. 하나의 도펀트 이온이 비방사 (non-radiative) 이동을 통해 에너지를 얻으면, 이 에너 지를 이용하여 다른 도펀트 이온이 더 높은 에너지 상태 로 여기된 후 방사선을 방출한다. 이 때, 방사선을 방출 하는 도펀트 이온을 활성제(activator)라고 하며, 에너지 를 주는 역할을 하는 도펀트 이온을 증감제(sensitizer)라 고 한다. 대부분의 란타넘 족의 이온이 도핑된 호스트 물 질로부터 업컨버전이 일어난다고 이론적으로는 기대될 수 있지만, 효율적인 업컨버전은 잘 택해진 소수의 도펀 트-호스트 조합에서만 일어난다.

⁸⁾

란타넘 족 이온이 도핑된 UCNP를 합성하는 방법에는 공침법(coprecipitation), 열분해법(thermal decom- position), 수열/용매열 합성법(hydrothermal/solvo- thermal synthesis), 졸-겔 공정방식(sol-gel pro- cessing), 연소 합성법(combustion synthesis) 등이 있 다(Table 1).

공침법은 입자의 크기 분포가 좁고 매우 작은 크기의 UCNP를 합성하는데 가장 편리한 합성법이다. 다른 합성 법에 비해 장비의 비용이 싸고, 엄격한 반응 조건이나 복 잡한 절차가 필요 없기 때문에 합성하는데 걸리는 시간 소비가 적다. 이 기술의 초기 사례의 대표적인 경우가

Table 1. 현재까지 개발된 UCNP 합성 방법들

⁸⁾

방법 예시(호스트) 특징

공침법 LaF

3

NaYF

4

LuPO

4

YbPO

4

값 비싼 장비 또는 복잡한 절차 없이 빠르게 성장이 일어난다. 후 열처 리가 일반적으로 필요하다.

열분해법 LaF

3

NaYF

4·

GdOF

비싸고 공기에 민감한 금속 전구체를 이용한다. 특성이 매우 좋은 단 분산 입자가 합성되지만 독성 부산물이 생성되는 단점이 있다.

수열/용매열 합성법 LaF

3

NaYF

4

La

2

(MoO

4

)

3

YVO

4

저렴한 원료가 사용되고, 후 열처리가 필요 없으며 입자 크기와 모양을 효과적으로 제어할 수 있지만 특수한 반응 용기가 필요하다.

졸-겔 공정방식 ZrO

2

TiO

2

BaTiO

3

Lu

3

Ga

5

O

12

YVO

4

저렴한 원료가 사용되지만 고온에서의 소성이 필요하다.

연소 합성법 Y

2

O

3

Gd

2

O

3

La

2

O

2

S

시간과 에너지가 절약되지만 입자의 응집이 많이 일어난다.

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특 집

CERAMIST

LaF

3

나노입자를 만든 Van Veggel 그룹의 연구이다. 이 그룹이 10 nm 미만의 UCNP를 수용액에 재분산시키는 것에 성공하면서 UCNP가 생체 분자의 발광 프로브로 사 용할 수 있는 계기가 되었다. 공침법에 의해 합성된 UCNP는 발광 세기가 약해서 세기를 증가시키기 위해서 는 합성 후 열처리 과정이 필요하다. 그리고 나노입자의 크기를 조절하기 위해서 킬레이트제 역할을 하는 EDTA 를 첨가하거나, 나노입자의 용해도와 표면 기능을 향상시 키기 위해서 PVP를 첨가해서 UCNP를 합성하기도 했다 (Fig. 3(a), 3(b)).

³⁾

열분해법은 Yan 그룹에서 처음으로 단순분산(mono- disperse)되어 있는 LaF

3

를 합성하면서 발전되었다. 이 방법은 좋은 특성의 NaYF

4

UCNP를 합성하는 일반적인 방법으로 보편화되었다. 예를 들어, Capobianco 그룹은 올레산(oleic acid)과 옥타데켄(octadecene) 존재 하에 금속 트리플루오로아세테이트(trifluoroacetate) 전구체 (precursor)의 열분해를 통해서 Yb/Er 또는 Yb/Tm으로 동시 도핑된 NaYF

4

UCNP를 합성했다. 여기서 비 배위 (non-coordinating) 옥타데켄은 높은 끓는점(315 ℃)때 문에 1차 용매로 사용되었다. 올레산은 용매로서뿐만 아 니라 UCNP가 응집되는 것을 방지하는 부동화 리간드로 도 사용되었다(Fig. 3(c) ~ 3(f)).

수열/용매열 합성법은 열분해법보다 입자의 크기가 잘 제어되고, 용액 내에서 우수한 분산 능력을 가지는 UCNP를 합성하기 위해 시작된 방법이다. 수열/용매열 합성법은 고체의 용해도와 고체 간의 반응 속도를 높이기 위해서 임계점 이상의 압력과 온도 하에 용매를 사용한 다. 다른 합성법에 비해 훨씬 낮은 온도에서 높은 결정질 상을 생성할 수 있는 반면, 오토클레이브(autoclave)가 반드시 필요하고, 나노입자가 성장하는 과정을 관찰하는 것이 불가능하다는 단점이 있다. 입자의 크기와 모양을 조율하기 위하여 주로 폴리올(polyol-) 또는 마이셀 (micelle-) 매개의 용매열 합성법이 사용되었다. Zhao 연구진은 올레산 매개의 수열 합성법을 이용해서 NaYF

4

UC 나노막대(nanorods), 나노튜브(nanotubes), 꽃 무 늬의 나노디스크(nanodisks) 등을 합성했다. 최근에는 하이브리드 열분해/용매열 합성법으로 다중색의 업컨버 젼 형광을 가지는 LaF

3

:Yb/Er(Tm,Ho) 나노플레이트 (nanoplates)도 합성하였다.(Fig. 3(g), 3(h))

졸-겔 공정방식은 박막 코팅과 유리재료로 응용되는 UCNP를 제조하기 위한 전형적인 습식 화학(wet- chemical) 기법이다. 졸-겔 공정은 금속 알콕사이드 (alkoxide) 또는 할라이드(halide) 계 전구체의 가수분해 (hydrolysis) 및 중축합(polycondensation)이 특징이

Fig. 3. 다양한 종류의 합성법으로 만들어진 UCNP의 TEM 이미지 : (a), (b) 공침법, (c), (d), (e), (f) 열분해법, (g), (h) 수열/용매열 합성법

⁸⁾

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CERAMIST

다. UCNP의 발광 효율은 결정성과 직접적으로 관련되기 때문에, 이 결정성을 향상시키기 위해서 고온에서 소성 (calcination)시키는 것이 종종 필요하다. Prasad 그룹 에서는 Er

³⁺

가 도핑된 ZrO

2

나노입자를 합성하는 새로운 변형된 졸-겔 공정을 개발하였다. 이 방법은 나노입자를 성장시킬 때 에멀젼에서 형성된 역 마이셀을 반응기 역할 로 이용하는 졸-에멀젼-젤(sol-emulsion-gel) 기술이 다. 졸-겔 공정은 또한 TiO

2

:Er, BaTiO

3

:Er, Lu

3

Ga

5

O

12

: Er, YVO

4

:Yb/Er와 같이 금속 산화물을 호스트 물질인 다양한 UCNP를 개발하는데 이용되었다. 그러나 많은 연 구 노력에도 불구하고, 졸-겔 공정으로 만들어진 UCNP 는 입자의 크기 제어가 어렵고, 수용액에 분산될 때 상당 히 많이 응집이 일어나서 생물학적 분석을 위한 발광체로 는 그리 적합하지 않다.

합성을 완료하기 위해 고온에서 장기간 가열해야 하는 졸-겔 공정과 수열/용매열 합성법과는 대조적으로, 연소 합성법은 몇 분 내에 반응 생성물을 얻을 수 있다. 일단 가열이 시작되면, 추가적으로 열이 필요 없이 자체 유지 방식(self-sustained manner)의 연소파(combustion wave) 형태로 반응 물질을 통해 전달되어 500 ~ 3000

℃ 범위의 온도에서 발열반응이 일어난다.

2.2 UCNP의 표면 개질

UCNP의 표면 개질(modification)은 나노입자의 광안 정성을 향상시킬 뿐 아니라 다양한 생물 의학적 응용을 위한 생물학적 고분자를 부착할 수 있는 플랫폼 역할을 할 수 있다. UCNP는 일반적으로 불완전한 배위 환경에 서 표면 도펀트 이온의 비율이 높다. 표면의 도펀트 이온 의 발광은 호스트 격자에 의한 보호가 효과적이지 못해 소광(quenching) 되기 쉽다. 따라서 도핑된 나노입자 주 위에 도핑되지 않은 물질의 불활성 결정체 껍질(shell)을 씌우면 UCNP의 업컨버전 효율이 향상된다. 껍질은 주로 나노입자의 호스트와 같은 조성을 가지고 있다(Fig. 4).

이러한 구조에서 모든 도펀트 이온은 나노입자의 내부 핵 에 갇혀서 입자 표면에 에너지가 전달되는 것을 효과적으 로 억제하게 되고, 결과적으로 업컨버전 발광의 효율이 높아진다.

바이오 이미징 응용에 사용되기 위해서 UCNP는 발광 효율이 높아야 할 뿐만 아니라, 살아있는 세포와 같은 생 체 분자와 함께 공존할 수 있는 표면 습윤(wetting) 특성 을 가지고 있어야 한다. 대부분의 고온에서 합성된 UCNP는 수용성이 아니기 때문에 친수성 리간드를 입자 표면에 기능화(functionalization)할 필요성이 있다.

Fig. 5에는 바이오 이미징을 위해 UCNP가 생물학적 시 스템에서 사용될 수 있도록 용해성과 기능성을 높이기 위 한 표면 화학 반응들을 나타내었다. 리간드 교환(ligand exchange)은 원래 존재했던 리간드가 두 기능을 가진 중 합체 분자(bifunctional polymeric molecules)로 치환 되는 것을 말한다. 이때 고분자는 친수성 표면 또는 추가 적인 생체 접합 능력을 제공할 수 있다. 리간드 산화 (ligand oxidation)는 Lemieux–von Rudloff 시약에 의해 리간드의 탄소-탄소 이중결합이 산화되어 펜던트 카르복시기의 작용기를 형성하는 것을 말한다. 이 방법은 C=C 결합이 존재하는 특정 종류의 리간드에만 적용 가능 하다. 리간드 인력(ligand attraction)은 양친매성 고분 자 코팅 방법(amphiphilic polymer coating)이라고도 하며 원래의 리간드와 고분자의 탄화수소 사슬 사이의 소 수성 인력을 통해 나노입자 표면에 추가적인 양친매성 블 록 공중합체의 흡수가 일어나는 방법이다. 중합체의 친수 성 외부 블록은 수용액에서 잘 분산될 수 있도록 해주고, 생체 적합 능력을 가지게 한다. 층상 조립법(layer by

Fig. 4. (a) 껍질로 보호되지 않은 UCNP, (b) 코어-쉘(core-shell) 형

태의 UCNP에서 란타넘 족 도펀트들의 예상 분포. 보호되지

않은 UCNP는 표면에 발광이 적은 도펀트 이온이 많이 존재

한다. 반면 코어-쉘 UCNP는 모든 도펀트 이온이 내부의 핵

에 갇혀 있어 효율적인 발광이 일어난다.

⁸⁾

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특 집

CERAMIST

Fig. 5. UCNP의 가용화 및 기능화를 위한 방법

⁸⁾

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CERAMIST

layer assembly)은 나노입자 표면에 교대로 대전된 폴리 이온(polyions)의 정전기 흡수를 이용한다. 폴리이온의 층 두께는 정밀하게 제어될 수 있다. 하지만 이 방법은 친 수성 나노입자에만 적용할 수 있다는 한계가 있다. 표면 실란화(surface silanization)는 실록산(siloxane) 단량 체의 가수 분해 및 축합에 의해 나노입자의 핵에 실리카 (silica) 껍질을 성장시키는 것을 말한다. 다양한 작용기 를 갖는 실란(silane)은 나노입자가 더 단단해 지고 습윤 및 접착(adhesion)과 같은 계면의 성질을 가지게 한다.

⁸⁾

2.3 체외(in vitro) 세포 및 조직 이미징⁹⁾

Zijlmans 그룹은 최초로 UCNP를 이용해서 고성능 바 이오 이미징에 성공하였다(Fig. 6).

¹⁰⁾

1999년에 그들은 서브미크론(submicron) 크기의 Y

2

O

2

S:Yb/Tm 입자를 사용해서 표준 면역 조직학 기법(standard immunohistological techniques)으로 파라핀이 끼워져 있는 인간의 전립선 조직의 전립선 특이 항원(prostate- specific antigen, PSA)의 분포를 연구하였다. 비특이적 인 자가 형광 신호가 근적외선 여기 하에 완전히 제거되 었음을 확인하였고, 높은 여기 에너지에 연속적으로 노출 되어도 UCNP가 형광 특성을 잃지 않는다는 것을 보여주 었다. 따라서 UCNP로 표지된 조직 샘플은 영구적인 기 록을 위해 편리하게 보관될 수 있었다. 최근에는 고품질 의 UCNP가 쉽게 이용할 수 있게 되어 업컨버전 기반의 이미징 기술이 세포 표본의 고해상도 이미징에 널리 사용 되고 있다. 다양한 세포들과 함께 배양된 기능화가 되어 있지 않은 UCNP는 세포에 의해 안으로 함입된다 (endocytosed). 합입된 UCNP가 980 nm에서 여기되 면, 자가 형광없이 강한 업컨버전 형광이 세포 안에서 발

생하고 UCNP의 고유한 높은 광자 변환 효율과 깜박거리 지 않는 (non-blinking) 방출 덕분에 기존의 방법으로는 불가능했던 단일 분자 이미징이 가능하게 되었다. Yu 그 룹

¹¹⁾

은 업컨버전 기반의 시각화 기술이 시간이 지나도 페 이딩 효과(fading effect)가 거의 없음을 보여주었고, 그 에 따라서 장기간의 세포관찰에 UCNP가 매우 적합하다 는 것을 암시하였다.

최근에 Jiang 그룹에서는 UCNP가 siRNA(small interference RNA)의 전달 및 추적에 사용될 수 있음을 보여주었다.

¹²⁾

표적 전달을 성공시키기 위해 siRNA를 anti-Her2 항체를 단 실리카가 코팅된 NaYF

4

:Yb/Er 나노입자에 부착시켰다. 나노입자의 세포 내 섭취는 공초 점형(confocal) 현미경에서 가시화되었고, siRNA의 유 전자 침묵 효과(gene silencing effect)는 루시페라아제 분석(luciferase assay)에 의해 평가되었다. 루시페라아 제 분석 결과는 UCNP에 적합한 항체를 부착함으로써 특 정 세포에 표적 전달을 위한 siRNA의 효율적인 매개체 역할을 할 수 있음을 보여주었다. 뿐만 아니라, 후속 연 구에서 Jiang 과 Zhang 그룹에서는은 UCNP 운반체로 부터 siRNA의 세포 내 방출을 실시간으로 추적해냈다.

¹³⁾

이를 위해 siRNA에 BOBO-3 인터칼레이팅 염료 (intercalating dye)를 입혔다. UCNP와 BOBO-3의 측 정된 LRET(luminescence resonance energy transfer) 는 UCNP로부터 siRNA가 얼마나 방출되는지 알아볼 수 있는 지표로 이용되었다.

2.4 유기체 및 동물의 생체내(in vivo) 바이오 이미징

UCNP를 생체 내 염색물질로 이용한 연구는 최근 들어 가장 큰 관심을 끌고 있다. Lim그룹에서는 등은 UCNP 를 이용하여 살아있는 유기체를 이미징하는데 처음으로 성공했다.

¹⁴⁾

그들은 50 ~ 150 nm의 크기의 Y

2

O

3

:Yb/Er UCNP를 살아있는 선충류 Caenorhabditis elegans (C.

elegans) 벌레에 주입하고, 이어서 이 벌레의 소화계를 영상화하는데 성공했다. 980 nm의 근저외선으로 여기 시키면 장 속의 나노입자의 통계적 분포를 명확하게 시각 화 할 수 있었다. 중요한 점은 벌레가 UCNP를 주입하고 나서 비정상적인 행동을 나타내지 않을 정도로 UCNP가

Fig. 6. UCNP를 이용한 조직과 세포의 바이오 이미징. 청색과 근적

외선 여기 광에 노출 된 후 조직의 모습(왼쪽), PSA-특정 청

색 형광체 발광과 일치하는 녹색 자가 형광이 근적외선 여기

만을 이용하여 효과적으로 제거된 모습(오른쪽).

⁹⁾

(9)

특 집

CERAMIST

우수한 생체 적합성을 보였다는 것이다. 최근에는 10 nm 보다 작은 크기의 초소형 Y

2

O

3

:Yb/Er 입자를 합성하여 매우 미세한 세포 내 구조체들을 염색할 수 있을 것으로 기대하고 있다. 하지만 표면 소광(surface quenching) 으로 인한 초소형 나노입자의 엄청난 방출 손실이 존재한 다는 문제점이 존재한다.

한편 UCNP는 생체 내의 인식 부분과 결합하여 종양 검출 및 약물 전달(drug delivery)을 위한 표적 이미징에 도 사용되고 있다. Xiong 그룹에서는 UCNP에 엽산과 폴리펩티드인 RGD를 연결시킴으로써 흉선이 없는 누드 마우스(athymic nude mice)에서 HeLa와 U87MG 종양 을 검출할 수 있었다. 중요한 것은 생체 내에서 업컨버전 발광 신호의 관심 영역(region of interest, ROI) 분석을 통하여 업컨버전 바이오 이미징은 종양과 배경 사이에 높 은 신호 대 잡음비를 달성한다는 것을 보여준 점이다 (Fig. 7). 이는 일반적으로 단일 광자 또는 두 개의 광자 를 이용한 형광 바이오 이미징에서는 얻을 수 없는 결과 이며, UCNP의 높은 활용도를 보여준다. 이러한 특성을 기반으로 하여 최근 UCNP를 생체 내에서 이식된 세포의 추적에도 사용하는 연구가 활발히 진행되고 있다.

2.5 광학 단층 촬영¹⁵⁾

형광 확산 광학 단층 촬영(fluorescence diffuse optical tomography, FDOT)은 대상을 통해 산란된 빛 으로 만든 이미지를 재구성하여 형광체가 지속되는 대상 의 디지털 체적(volumetric) 모델을 생성하는 컴퓨터 단 층 촬영의 한 형태이다. 전형적으로 고도로 산란하는 조 직 배지는 좁은 콜리메이트 빔(collimated beam)에 의해 빛을 받아 배지를 통해 전파되는 지속된 표적으로부터의 발광은 조직 표면에 부착된 일련의 검출기에 의해 수집된 다. 타겟의 형상은 주변 환경으로부터 타겟을 식별하는 기록된 광학 데이터에 기초하여 재구성될 수 있다. FDOT 는 형광 표적의 3차원 심부 조직 바이오 이미징을 위한 작고, 빠르고 매우 민감한 기술이다. 비외과적인 FDOT 는 작은 동물의 종축(longitudinal) 연구에 활발하게 이 용되고 있으며, 암 종양, 프로테아제(proteases), 알츠하 이머 병 및 다른 약물 효과의 발달을 가져오는데 큰 역할 을 하였다.

일반적으로 FDOT에는 헤모글로빈, 콜라겐, 엘라스틴

Fig. 7. RGD-접합 NaYF4:Yb/Er/Tm 입자를 흉선이 없는 누드 마우 스의 정맥 내에 주사한 뒤 (a) 1 시간, (b) 4 시간, (c) 24 시 간이 지난 뒤의 U87MG 종양(왼쪽 뒷다리, 짧은 화살표로 표 시)과 MCF-7 종양(오른쪽 뒷다리, 긴 화살표로 표시)을 바이 오 이미징한 결과

⁹⁾

Fig. 8. FDOT에서 NaYF

4

:Yb

³⁺

/Tm

³⁺

UCNP(왼쪽 열)와 유기 염료 분 자(오른쪽 열)의 비교. (a, b) 재구성된 형광체의 3차원 모습.

박스는 횡단면으로 자른 것을 나타낸다. (a) UCNP를 사용했

더니 부드럽고 일관된 모습을 보인다. (b) Rhodamine 6G를

이용한 이미지는 형광 표적의 두 끝 단에서 심하게 일그러

진 모습이 보인다. (c, d) 2 차원으로 표현한 (c) 정사각형 모

양으로 전력에 의존하는 조영제로서의 UCNP, (d) 선형 전

력 의존의 DY-781 형광체 FDOT 재구성 플롯, 및 해당 강도

의 선형 곡선

¹⁵⁾

(10)

CERAMIST

과 같은 내인성(endogenous) 형광체가 조영제로 이용된 다. 유기 염료 분자 또는 양자점과 같은 외인성(exoge- nous) 스톡스 이동이 일어난 조영제의 이용은 검출 강도 를 향상시킬 수 있다. 그러나 조영제의 종류와 관계없이, 자가 형광 및 신호 노이즈는 여전히 FDOT의 신호 대비 (contrast)를 떨어뜨리는 문젯거리이다. 잡음의 대부분 은 저잡음 장비를 사용하여 억제할 수 있지만 조직 자체 의 자가 형광은 전통적인 스톡스 이동 형광체를 이용해 측정하는 것에 방해가 된다.

UCNP의 안티스톡스 광학 특성을 이용하면 조직의 자 가 형광의 영향을 완전히 제거할 수 있다. 따라서 UCNP 는 FDOT에서 기존에 이용되어온 형광 물질들의 대안으 로 제시되었다. Xu 그룹은 최근에 젤라틴 기반의 가짜 조 직을 사용하여 통제된 환경에서 DOT 스캐닝을 위한 NaYF

4

:Yb

³⁺

/Tm

³⁺

UCNP의 사용을 시연하는데 성공했 다.

¹⁶⁾

UCNP에서 얻은 광학 데이터는 재구성 후 균일하 고 한정된 인광 분포를 보였다(Fig. 8a). 이와는 대조적 으로, 유기 염료 분자(Rhodamine 6G)의 사용으로 얻어 진 광학 데이터는 형광 표적의 두 말단에서 심하게 일그 러진 형상이 나타났다(Fig. 8b). 안티스톡스 이동에 의한 방출 외에도 업컨버전 방출의 비선형 전력 의존도가 결과 이미지의 품질과 대비를 향상시키는 데 추가로 활용될 수 있음이 입증되었다. FDOT 재구성 영상은 합성된 NaYF

4

:Yb

³⁺

/Tm

³⁺

@NaYF

4

UCNP를 조영제로 사용함 으로써 품질이 훨씬 향상되었으며 기존 선형 형광체를 사 용하여 얻은 FDT 이미지의 현재 공간 해상도 한계를 극 복하였다(Fig. 8c, d). FDOT 바이오 이미징을 위한 UCNP은 조영제로서 여러가지 장점을 보이고 있으며, 이 후 생체 내 모델 또는 인간 조직 모델을 위한 UCNP의 적 용이 적극적으로 검토되고 있는 중이다.

2.6 다중 모드 바이오 이미징 (multimodal bioimaging)¹⁷⁾

MRI(magnetic resonance imaging), CT(X-ray computed tomography), PET(positron emission tomography), 광학 이미징(optical imaging) 등의 다양 한 분자 이미징 기술은 공간 분해능(spatial resolutions),

침투 깊이(penetration depths) 및 적용 분야와 관련하 여 고유한 장단점을 가지고 있다. MRI는 우수한 공간 분 해능과 높은 침투 깊이를 제공하지만, 불충분한 감도와 낮은 평면 해상도가 문제이고, CT 영상은 연조직(soft- tissue) 대비가 좋지 않고, 낮은 평면 해상도 및 제한된 민감도를 갖지만 탁월한 해부학적 정보를 제공한다. PET 이미징은 높은 감도로 시각화 방법을 제공하지만 낮은 공 간/평면 해상도의 단점이 있다. 가장 높은 감도와 탁월한 평면 해상도를 제공하는 광학 이미징은 세포/분자 수준 의 정보를 제공할 수 있는 유일한 기술이지만 침투 깊이 가 낮다. 따라서 임상 진단 및 예후를 위한 해부학적 구조 및 생리 기능에 대한 보다 보완적이고 정확한 정보를 얻 기 위해 하나의 나노입자에 2 개 이상의 영상 기술의 장 점을 통합하여 다중 모드 바이오 이미징을 수행하는 것이 가장 바람직한 방법이다. 다중 모드 바이오 이미징에는 UCL (upconversion luminescence)/MRI, UCL/MRI/

CT, UCL/MRI/PET, UCL/CT, MRI/CT 등이 있다.

2.6.1 UCL/MRI 이미징

MRI는 자기장에 있는 양성자 스핀의 완화(relaxation) 와 함께 핵 자기 공명에 기반한 무해한 의료 진단 기술이 다. 따라서 MRI 조영제는 자성재료여야 한다. MRI 조 영제는 조영제의 단위 농도 당 스핀-격자 및 스핀-스핀 완화속도(1/T

1

및 1/T

2

)의 상자성 성분을 각각 나타낼 수 있는 종 방향 및 횡 방향의 완화도 (r

1

및 r

2

)를 통해 평가 될 수 있다. T

2

조영제(산화철)과 비교했을 때 T

1

조영제 는 조영제의 농도에 의해 신호를 증폭시킬 수 있는 장점 이 있어 높은 공간 해상도로 해부학 영상을 극대화할 수 있다.

MRI와 UCL 이미징이 하나로 통합되면 높은 공간 분

해능과 감도의 장점을 동시에 가지게 되어 결과적으로 바

이오 이미징의 품질을 향상시킨다. 상자성(paramag-

netic) Gd

³⁺

이온은 7개의 4f 비공유 전자쌍의 존재로 인

해 널리 사용되는 T1 MRI 조영제이다. 하나의 UCNP에

Gd

³⁺

와 Ln

³⁺

(Ln

³⁺

= Er

³⁺

, Ho

³⁺

, Tm

³⁺

) 이온을 첨가함

으로써 UCL과 MRI의 통합이 가능하게 되었다. 또한

UCNP를 사용함으로써 Gd

³⁺

-킬레이트 조영제에서

(11)

특 집

CERAMIST

Gd

³⁺

이온의 침출(leaching)을 극복할 수 있다.

NaGdF

4

, Gd

2

O

3

, GdF

3

, BaGdF

5

UCNP와 같은 Gd 기 반 호스트는 T

1

MRI 조영제로 사용되었다. 이러한 Gd 기 반 호스트가 Er

³⁺

, Ho

³⁺

, Tm

³⁺

등으로 도핑 되었을 때 이 중 모드 UCL/MRI 조영제가 형성되었다. Li 연구진은 NaGdF

4

:Yb,Er,Tm-PAA 입자가 5.6 s

^-1

mM

^-1

의 높은 이완성(relaxivity)을 보이고, 동시에 NIR-to-vis 과 NIR-to-NIR UCL을 쥐를 대상으로 하여 이미징하는 것에 성공했다.

¹⁸⁾

Fig. 9의 전신에 칠해져 있는 색은 각기 다른 기관(특히 간과 비장)에서 선명한 대비 차이를 보였 고, 이를 통해 UCNP의 축적이 확인되었다.

2.7 치료 응용(therapeutic application)¹⁷⁾

현대 의학의 발전에도 불구하고, 여전히 매년 수백만 명의 사망자가 발생하는 암 질환은 여전히 심각한 질병이 며, 따라서 암 치료법에 대한 연구는 전 세계적으로 중요 한 문제로서 간주되고 있다. 바이러스의 높은 돌연변이

속도와 유전적 이질성으로 인해 암 치료법에 대한 연구는 여전히 계속되고 있으며, 사실 과거에 비해 오히려 더 복 잡해 지고 있는 게 현실이다. 이와 같은 암 치료를 위해 많은 새로운 물질과 메커니즘이 개발되고 있으며, 본 글 에서 소개하고 있는 UCNP는 종양의 위치와 크기를 확인 하는 훌륭한 바이오 이미징 도구로서 활용되고 있다. 대 개 UCNP가 치료제와 결합된 다기능의 프로브는 영상 유 도 및 종양 표적 치료를 위해 정교하게 디자인되어 합성 된다. 이러한 다기능 프로브는 탁월한 이미징 기능, 종양 타겟팅 능력 및 치료 효율을 제공하여 다기능 진단 시스 템 및 치료 시스템 개발에 이용된다. 현재까지 광역동 치 료(photodynamic therapy, PDT), 광열 치료 (photothermal therapy, PTT) 등에 UCNP가 적용되었 으며, 그 간단한 치료 메커니즘이 Fig. 10에서 설명되어 있다.

광역동 치료는 광감성 분자이며 빛에 민감한 약물인 광 증감제를 반드시 포함한다. 적절한 파장의 빛에 노출되 면 감광제가 여기되어 주변 산소 분자에 에너지를 전달 하는데, 이 때 세포 독성이 있고 반응성 산소인 일중항 산 소(

¹

O

2

)가 생성되어 암세포를 산화시키고 죽일 수 있다.

실제로 대부분의 감광제는 가시광선에 의해 활성화된다.

따라서 살아있는 조직에서 PDT의 효능은 가시광선의 세 포 내 침투 깊이가 낮아서 제한적이었다. 이를 고려하여 UCNP에서 감광제로의 공명 에너지 전달을 이용하여 광 역동 치료로 깊숙한 곳에 있는 암을 치료할 수 있도록 광 증감제(photosensitizer)와 UCNP의 조합이 개발됐다.

이 결합된 시스템에서 감광제의 최대 흡수 파장 범위는 UCNP의 방출 가시광선의 스펙트럼과 겹쳐야 한다. 따 라서 결합된 시스템이 980 nm 근적외선 레이저에 의해 여기될 때, UCNP는 근적외선을 가시광선으로 변환할 것이다.

광열치료에서 광흡수기(photoabsorber)는 광 조사 (optical irradiation)를 흡수하고 열로 변형시키는데 사 용된다. 열에 의해 상승된 온도는 세포 내 단백질의 변성 또는 조직의 막의 파괴를 유도하여 암세포의 열적 사멸을 유도한다. 화학 요법 또는 수술과 비교하여 광열치료는 덜 침습적이어서 환자의 삶의 질이 크게 향상될 수 있기

Fig. 9. NaGdF

4

:Yb,Er,Tm-AA 입자를 1.5 mg/kg 만큼 정맥 내에 주 사하기 전과 후 40 분이 지난 뒤의 (L) 간, (S) 비장의 이미지.

(A) 전신 (B, C) 횡단면 이미지

¹⁷⁾

(12)

CERAMIST

때문에 이를 이용한 암 치료에 대한 관심이 높아졌다. 이 전에는 금과 은 나노막대(nanorods), 나노케이지 (nanocages) 및 나노껍질(nanoshells)과 같은 귀금속 물질이 근적외선 영역에서 강한 광흡수로 인해 광열치료 제로 사용되었다.

최근 Liu 연구진은 UCL/MRI 이미징 가이드 및 자기 표적 광열 암치료를 위한 다기능의 NaYF

4

:Yb,Er@

Fe

3

O

4

@Au-PEG 나노입자를 고안했다. 자기적으로 표 적화된 광열 치료 효과를 확인하기 위해서 종양이 있는 쥐에게 정맥에 NaYF

4

:Yb, Er@Fe

3

O

4

@Au-PEG 나노 입자를 주사하였다. UCL 이미징은 자석에 붙어있던 종 양에 대해 몇 배 증가된 신호를 보냈고, 808 nm NIR 레 이저를 받으면 종양의 표면 온도는 약 50 ℃로 증가했다.

자기적으로 표적화된 광열 치료가 끝나면 모든 종양이 사 라져 100 % 치료 효능을 나타냈다.

3. 결론

UCNP는 분자의 광손상없이 매우 민감한 분자 검출 및 상당한 깊이의 침투로 세포의 특징의 시각화를 가능하게 하는 새로운 물질로 크게 주목받고 있다. 광깜빡임 현상 과 광표백 현상, 자가 형광이 없을 뿐만 아니라, 독성이 적고 살아있는 세포에서 광 손상이 적어서

¹⁵⁾

유용한 생물 표지 발광 바이오 라벨(luminescent biolabels)로의 역 할뿐만 아니라 의료 진단 및 바이오 이미징, 바이오 센싱,

광 활성화 요법에 폭넓게 사용되고 있다. 이와 같이 많은 장점들이 있음에도 불구하고, 임상 및 현장 진료 설정에 서 실제 응용가능성을 발휘하기 위해서는 아직 많은 해결 해야할 사항들이 남아있다. 예를 들면, 높은 콜로이드 안 정성과 맞춤식 광학 특성을 나타내는 UCNP의 합성 및 표면 개질을 위한 일반화된 기법이 아직 확립되지 않은 상태이다. 다양한 기판상에서 UCNP를 패터닝(pat- terning)하는 전략의 개발에 중점을 두어 다중화된 고감 도 검출 및 저비용, 고생산량(high-throughput) 플랫폼 에서 소형 전자 장치와의 통합을 가능하게 하기 위해 앞 으로도 상당한 노력이 필요할 것으로 예상한다.

⁸⁾

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2

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2

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Fig. 10. 치료 응용의 대표적인 예시인 광역동 치료(PDT)와 광열 치

료(PTT)의 메커니즘

¹⁷⁾

(13)

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 조 혜 인

 2018년 고려대학교 신소재공학부 학부졸업

 2018년 고려대학교 신소재공학부 석박사통합과정

 이 재 승

 2004년 KAIST 학사

 2008년 (미국) Northwestern 대학교 박사

 2009년 (미국) MIT 박사후연구원

 2009년 고려대학교 신소재공학부 조교수, 부교수