신육성 품종인 루비에스(Ruby S; Malus pumila Mill.) 사과껍질의 항산화, 건강 기능성 및 미용식품 활성
이은호1․김예진1․권순일2․김정희2․강인규3․정희영4․박경일5․조영제1
1경북대학교 식품공학부/식품생물산업연구소, 2국립원예특작과학원 사과연구소
3경북대학교 원예과학과, 4경북대학교 응용생명과학부, 5영남대학교 원예생명과학과
Anti-Oxidative, Health Functional, and Beauty Food Activities of Extract from Newly Bred Ruby S Apple (Malus pumila Mill.) Peel
Eun-Ho Lee1, Ye-Jin Kim1, Soon-Il Kwon2, Jeong-Hee Kim2, In-Kyu Kang3, Hee-Young Jung4, Kyeung-Il Park5, and Young-Je Cho1
1School of Food Science & Biotechnology/Food & Bio-Industry Research Institute,
3Department of Horticultural Science, and 4School of Applied Biosciences, Kyungpook National University
2Apple Research Institute, National Institute of Horticultural and Herbal Science, Rural Development Administration
5Department of Horticulture & Life Science, Yeungnam University
ABSTRACT In this study, the anti-oxidative, health functional, and beauty food activities of water and ethanol extracts from newly bred Ruby S apple (Malus pumila Mill.) peel. Peel of newly bred Ruby S apple was extracted using water and ethanol for extracting solvent. Water and ethanol extracts showed relatively high phenolic contents of 5.29 mg/g and 8.76 mg/g, respectively. Each water and ethanol extracts of Ruby S apple peel showed antioxidant protection factor values of 1.87 and 1.77 PF, respectively, and TBARS showed anti-oxidative effects of 80.17% and 38.76%
at a phenolic concentration of 100 μg/mL. Therefore, extract of Ruby S apple peel can be considered as an anti-oxidative and anti-aging agent. The anti-inflammatory effect (hyaluronidase inhibition) of extract of Ruby S apple peel was 5.61% in water extract and 31.87% in ethanol extract both at a phenolic concentration of 200 μg/mL. Activity of xanthine oxidase, which causes gout, was inhibited by 28.66% by ethanol extract at 100 μg/mL, which was higher than other species used as a control, whereas there was no effect using water extract. Both water and ethanol extracts showed low α-amylase inhibitory effects, whereas α-glucosidase inhibitory activities were 94.93% and 100.00% at a phenolic concentration of 200 μg/mL, respectively. To measure whitening effect, tyrosinase inhibitory activity was measured, and only ethanol extract showed an inhibitory effect (17.50%). For anti-wrinkle effect, water extract showed 6.70% and 69.85% elastase and collagenase inhibitory activities, respectively, while ethanol extract showed 41.95%
and 80.73% activities. These results show the high potential of Ruby S apple peel extracts as a cosmetic resource.
Ruby S apple peel was identified to have various functions, including anti-oxidative, anti-inflammatory, gout pre- ventative, whitening, anti-wrinkle, and anti-diabetic effects, which confirms that Ruby S apple peel is an outstanding species compared to other species. Therefore, Ruby S apple peel is a quality source of new functional cosmetics and can be viewed as a functional foods.
Key words: biological activities, functional beauty food, healthy functional foods, newly breed, Ruby S apple
Received 14 August 2018; Accepted 19 September 2018 Corresponding author: Young-Je Cho, School of Food Science &
Biotechnology/Food & Bio-Industry Research Institute, Kyungpook National University, Daegu 41566, Korea
E-mail: [email protected], Phone: +82-53-950-7755
서 론
한국의 대표 과일 중 하나인 사과(Malus pumila Mill.)는 경제성장으로 소득 수준이 향상되면서 양적인 면보다는 질 적인 면으로 소비 형태가 변화하고 있다. 우리가 ‘부사’라고 부르는 ‘후지’(Fuji; Malus domestica Borkh.)는 가장 대표
적인 사과 품종으로 2012년 기준 국내 과실 총 생산량의 29.5%를 점하고 있으며, 주로 대만에 수출되고 있다. 국내 사과는 당해에 약 50% 정도가 소비되고 나머지는 저장되어 이듬해에 소비되는데, 저온 저장 후 수출되는 후지 사과는 품질 저하로 이듬해 2월부터는 수출이 매우 제한적으로 이 루어지고 있다. 또한 일본 사과보다 인지도와 가격이 많이 떨어져서 아직 한국 사과는 품질이 중간 정도로 인식되고 있다. 그러나 2011년 일본의 원전 사고 이후 식품의 안전성 에 대한 소비자의 우려가 커지면서 대만, 한국, 중국, 미국의 일본산 농식품 수입이 감소하였고, 2014년 4월 현재 37개
국에서 일본산 농산물의 수입규제가 이행되고 있다. 중국의 경우 일본 내에서 안전하다고 판단하는 지역의 농식품 수입 도 전면 금지하는 엄격한 조치를 단행하고 있다. 이러한 일 본의 원전사고 이후 농수산식품의 대외교역 변화를 기회로 한국산이 가지는 식품안전성과 가격경쟁력의 우위점을 활 용하여 고품질 사과를 개발한다면 중국을 중심으로 다양한 국가로의 수출이 가능할 것으로 예상된다(1).
사과는 분류학상 장미과에 속하는 다년생 목본식물로서 유럽, 아시아 및 북아메리카의 북반구에서 재배된다(2). 민 간에서 사과는 미용, 구토, 구충, 정혈, 변비 등에 약으로 쓰이고 있다. 사과의 종류 중 하나인 능금(Malus asiatica) 은 소갈, 곽란, 복통 등을 다스리고 담을 없애며 이질을 다스 린다. 덜 익은 능금은 맛은 떫으나 약으로 쓰인다. 그러나 많이 먹으면 잠이 많이 오며, 담이 생기고 종기가 난다. 사과 를 발효시켜 만든 사과주는 독특한 풍미가 있으며, 특히 식 후의 소화를 돕는 음료이다. 이런 사과주를 좀 더 산화 발효 시켜 사과초를 만들어 화상에 바르면 즉시 통증이 그친다고 향토의학에 나와 있고, 또 정맥류에 사과초를 환부에 밤낮으 로 바르면 1개월 후에는 국소가 훨씬 작아진다고 한다. 사과 는 이런 민간요법뿐 아니라 연구를 통해서도 그것의 효과를 증명하고 있다(3,4). 사과 과실은 관능특성이 좋고 영양학적 으로 유기산과 당류와 같은 기호성 성분 이외에도 비타민, 미네랄, 칼륨, 나트륨 성분 및 폴리페놀화합물과 같은 생리 활성 물질들을 함유하고 있다. 그중에서 procyanidin, chlo- rogenic acid, caffeic acid, epicatechin, catechin, p-cou- maroylquinic acid, rutin, phloridzin, quercetin과 같은 다 양한 폴리페놀 물질은 활성산소에 의한 생체 성분의 산화적 손상에 의하여 유발되는 피부노화, 비만, 염증, 동맥경화, 당뇨, 고혈압을 비롯하여 각종 암과 같은 퇴행성 질환의 예 방에 효과가 있다고 알려져 있다(5,6).
따라서 국내에서 육종한 신품종인 루비에스 품종의 사과 에 대해 항산화, 항염증, 미백, 주름 개선 등의 기능성 화장품 활성 분석을 통해 고부가가치 기능성소재로서 개발을 시도 하였다.
재료 및 방법
시험 재료
시험 재료는 경북 군위군 소재의 사과연구소에서 교배조 합으로 알프스오또메 품종(모본)과 산사 품종(부본)을 교배 하여 육성한 신 육성 품종인 루비에스 사과를 사용하였다.
시료는 루비에스 사과나무로부터 사과를 수확한 후 이물질 을 제거하고 사과를 구성하고 있는 껍질, 과육 및 whole 사 과를 대상으로 실험하였다. 껍질, 과육, whole 사과 시료는 동결건조(freeze dryer, FD8518, Ilshinbiobase, Yangju, Korea) 하여 수분을 제거한 후 40 mesh로 분쇄하여 4°C 저온고에 보관하며 시료로 사용하였다.
루비에스 사과로부터 페놀성 추출물 제조
기능성 식품 및 기능성 화장품 활성 분석을 위한 추출물의 제조는 열수 추출물의 경우 루비에스 사과 시료 분말 1 g을 증류수 200 mL에 침지하여 추출물이 100 mL가 될 때까지 가열한 후 냉각하여 24시간 동안 교반 추출하였으며, etha- nol 추출물의 경우 루비에스 사과 분말 1 g에 10~100% 농 도의 ethanol 100 mL를 첨가하여 4°C shaking incubator 에서 24시간 동안 교반 추출하였다. 각 추출물은 Whatman No. 1 filter paper(Whatman Inc., Piscataway, NJ, USA) 로 여과한 후 필요에 따라 rotary vacuum evaporator (Eyela NE, Tokyo, Japan)에서 농축하여 4°C 냉장고에서 저온 보관하였으며, 시료의 phenolic compounds 농도를 각각 25, 50, 75, 100 μg/mL 또는 50, 100, 150, 200 μg/
mL phenolics 농도로 설정하여 실험에 사용하였다.
총 페놀 화합물 함량 정량
총 페놀 정량은 Folin과 Denis의 방법(7)에 준하여 추출 물 1 mL에 95% ethanol 1 mL와 증류수 5 mL를 첨가하고 1 N Folin-Ciocalteu reagent 0.5 mL를 잘 섞어 5분간 방 치한 후 Na2CO3 1 mL를 가하여 흡광도 725 nm에서 1시간 이내에 측정하여 gallic acid를 이용한 표준곡선으로부터 양 을 환산하였다.
항산화 활성 측정
1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 저해 효과는 Blois(8)의 방법에 따라 시료 0.5 mL에 60 μM DPPH 3 mL를 넣고 vortex 한 후 15분 동안 방치한 다음 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 2,2’-Azino-bis(3-ethyl- benzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS) 라디칼 저해 효 과는 Pellegrini 등(9)의 방법에 따라 시료 7 mM ABTS와 140 mM K2S2O8을 5 mL:88 μL로 섞어 어두운 곳에 12~16 시간 방치시킨 후, 이를 ethanol과 1:88의 비율로 섞어 734 nm에서 대조구의 흡광도 값이 0.7±0.02가 되도록 조절한 ABTS solution을 사용하여 시료 용액 50 μL와 ABTS sol- ution 1 mL를 30초 동안 섞은 후 2.5분간 실온에서 free in- cubation 하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. Antiox- idant protection factor(PF) 측정은 Andarwulan과 Shetty (10)의 방법에 따라 10 mg의 β-carotene을 50 mL의 chloroform에 녹인 용액 1 mL를 evaporator용 수기에 넣 고 40°C water bath에서 chloroform을 증류시킨 후 20 μL linoleic acid, 184 μL Tween 40과 50 mL H2O2를 가하여 emulsion을 만들고, 5 mL의 emulsion에 시료 100 μL를 혼합하여 vortex로 잘 섞어준 후 50°C에서 30분간 반응시 켜 냉각시킨 다음 470 nm에서 흡광도를 측정하였다. Thio- barbituric acid reactive substances(TBARS) 저해 효과 는 Buege와 Aust(11)의 방법에 따라 1% linoleic acid와 1% Tween 40으로 emulsion을 만들고 emulsion 0.8 mL와 시료 0.2 mL를 섞은 후 50°C water bath에서 10시간 반응
시켰다. 반응액 1 mL에 TBA reagent 2 mL를 가하고 15분 간 boiling 한 다음 10분간 냉각시키고, 15분간 1,000 rpm 으로 원심분리 하여 실온에서 10분간 방치 후 상등액을 532 nm에서 흡광도를 측정하였다.
염증 억제(hyaluronidase 저해) 효과
Hyaluronidase 저해 효과는 Dorfman와 Ott(12)의 방법 에 따라 sodium-hyaluronic acid(HA)로부터 형성된 N- acetyl-glucosamine을 glucoxazoline 유도체로 변형시킨 후 p-dimethylaminobenzaldehyde로 발색시켜 흡광도 600 nm에서 측정하였다.
통풍 억제(xanthine oxidase 저해) 효과
Xanthine oxidase(XOase) 저해 효과는 Stirpe와 Della Corte(13)의 방법에 따라 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 7.5)에 녹인 기질액 2 mM xanthine 3 mL에 효 소(0.05 U/0.1 mL) 0.1 mL와 시료 0.3 mL를 넣고 대조구에 는 시료 대신 증류수를 0.3 mL 첨가하여 37°C에서 5분간 반응시키고 종료시약으로 20% TCA 1 mL를 가한 후 반응 액을 원심분리 하여 단백질을 제거하고 생성된 uric acid를 흡광도 292 nm에서 측정하였다.
항당뇨(α-amylase 저해 및 α-glucosidase 저해) 효과 αAmylase 저해 효과는 Davidson과 Parish(14)의 방법 에 따라 5 g의 agar와 5 g의 soluble starch를 증류수에 녹여 끓인 후 121°C로 15분간 멸균하고 15 mL씩 petri dish 에 붓고 굳힌 다음, 지름 10 mm disc paper를 올린 후 시료 액 0.8 mL와 효소액 0.2 mL(1,000 U/mL)를 혼합해 disc paper에 각각 분주하고 대조구에는 시료액 대신 증류수를 넣어 37°C에서 3일간 배양한 다음 I2/KI(5 mM I2 in 3%
KI) 3 mL를 가하여 15분간 발색시켜 clear zone의 넓이를 계산하여 저해율을 측정하였다. α-Glucosidase 저해 효과 는 Tibbot과 Skadsen(15)의 방법에 따라 50 mM sodium succinate buffer(pH 6.8)에 p-nitrophenol-α-D-gluco- pyranoside를 용해시켜 1 mg/mL의 농도로 기질을 만들고, 기질 1 mL와 효소액 0.1 mL를 혼합하고 대조구에는 증류수 0.1 mL, 반응구에는 200 μg/mL 농도의 시료 0.1 mL를 넣 어 37°C에서 30분간 반응시킨 후 1 N NaOH 0.1 mL를 첨가하여 발색시켜 400 nm에서 흡광도를 측정하였다.
미백(tyrosinase 저해) 효과
미백 효과는 Hearing(16)의 방법에 따라 0.1 M sodium phosphate buffer(pH 6.8) 2.3 mL와 기질액 1.5 mM L- tyrosine 용액 0.4 mL의 혼합액에 250 U/mL mushroom tyrosinase(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 0.1 mL와 50~200 μg/mL phenolic compounds 농도 각각의 시료 0.2 mL를 넣고 대조구에는 시료 대신 증류수 0.2 mL 를 첨가하여 37°C에서 20분간 반응시킨 다음 475 nm에서
흡광도를 측정하였다.
주름 개선(elastase 및 collagenase 저해) 효과 측정 Elastase 저해 효과는 Kraunsoe 등(17)의 방법에 따라 0.2 M Tris-HCl buffer(pH 8.0) 1 mL에 기질액 0.8 mM N-succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide 용액 0.1 mL를 넣고, 이 혼합액에 다시 1.0 U/mL porcine pancreatic elastase (Sigma-Aldrich Co.) 효소용액 0.1 mL와 50~200 μg/mL phenolic compounds 농도의 각 시료 0.1 mL를 넣고 대조 구에는 시료 대신 증류수 0.1 mL를 첨가하여 25°C에서 20 분간 반응시킨 후 p-nitroaniline 생성량을 흡광도 410 nm 에서 측정하였다. Collagenase 저해 효과는 Wunsch와 Heidrich(18)의 방법에 따라 0.1 M Tris-HCl buffer(pH 7.5)에 4 mM CaCl2를 첨가하여 4-phenylazobenzyloxy- carbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg(0.3 mg/mL)를 녹인 기질액 0.25 mL와 50~200 μg/mL phenolic compounds 농도의 각 시료 용액 0.1 mL의 혼합액에 0.2 mg/mL colla- genase(Sigma-Aldrich Co.) 0.15 mL를 첨가하여 실온에 서 20분간 방치한 후 6% citric acid 0.5 mL를 넣어 반응을 정지시킨 다음, ethyl acetate 2 mL를 첨가하고 320 nm에 서 흡광도를 측정하였다.
통계처리
모든 실험은 3회 이상 반복 측정하였고 자료의 통계처리 는 SPSS 23 for windows(Statistical Package for Social Science, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 평균±
표준편차(mean±standard deviation)로 표시하였고 분산 분석 Duncan’s multiple range test, one-way ANOVA를 실시하여 시료 간의 유의차를 P<0.05 수준으로 비교 분석하 였다.
결과 및 고찰
신육성 품종인 루비에스 사과의 부위별 추출물의 생리활성 비교
생리활성 효과를 지닌 물질은 동식물에 널리 분포하고 있 으며, 식물체는 자외선에 의한 산화나 자동산화, 곤충들로 인한 피해로부터 자신을 보호하기 위하여 페놀류의 항산화 물질을 세포 내 함유하며, 플라보노이드류와 산성의 페놀 화합물은 항산화, 항알레르기, 항당뇨, 항암, 항염증, 미백, 주름 개선 등 다양한 생리활성을 지닌 것으로 알려져 있다 (19). 최근에는 효능이 검증된 약용식물자원 유래의 생리활 성과 우수한 기능성 물질에 대한 기능성 식품 및 기능성 화 장품 분야에서 많은 연구와 개발이 이루어지고 있으며, 약용 식물이나 산채류, 한약재, 과실류 등 약용 부위의 물질을 탐 색하여 건강 기능성 식품이나 식품 부재료로 개발하는 것은 천연자원의 효율적인 이용 측면과 새로운 식품자원 개발, 신소재 개발에 기여할 수 있다는 측면에서도 매우 의미 있는
0 2 4 6 8 10
Peel Fruits Whole
Extracts
Contents of phenolics (mg/g) . Water extract
Ethanol extract
b a c
c
a b
A
0
20 40 60 80 100
BHT RPW RPE RFW RFE RWhW RWhE
Extracts
ABTS radical decolorization (%) .
Ruby S
c d
b a a f
e
B
Fig. 1. The content of phenolic in extracts from peel, fruits, and whole apple (A) and antioxidant activity of ABTS on extracts from Ruby S apple (B). Means with different letters (a-f) above the bars are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test. RPW, Ruby S peel water extracts; RPE, Ruby S peel ethanol extracts; RFW, Ruby S fruit water extracts; RFE, Ruby S fruit ethanol extracts; RWhW, Ruby S whole fruit water extracts; RWhE, Ruby S whole fruit ethanol extracts.
0 20 40 60 80 100
Water extracted solid
Ethanol extracted solid
Water extracted phenolics
Ethanol extracted phenolics
Concentration (100 μg/mL)
DPPH (%) .
Peel
a a
b b
A
0 20 40 60 80 100
Water extracted solid
Ethanol extracted solid
Water extracted phenolics
Ethanol extracted phenolics
Concentration (100 μg/mL)
ABTS radical decolorizaiton (%) .
Peel
a a
b b
B
Fig. 2. The content of DPPH (A) and ABTS activity (B) on solid and phenolic from apple (Ruby S) peel. Means with different letters (a,b) above the bars are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.
일이라 할 수 있다. 신육성 품종 루비에스 사과의 껍질, 과육, whole 사과를 water와 60% ethanol로 추출하여 페놀 함량 을 측정한 결과 Fig. 1A에서와 같이 껍질에서 가장 높은 페 놀 함량을 나타내었고, whole 사과, 과육 순으로 나타났다.
따라서 껍질 추출물의 생리활성이 가장 높은 수준을 나타낼 것으로 추측되었다. 루비에스 사과의 껍질, 과육, whole 사 과 추출물의 항산화 효과를 평가하기 위해 수용성 항산화능 을 나타내는 ABTS 라디칼 소거능을 측정한 결과 Fig. 1B에 서와 같이 루비에스 사과의 껍질에서 효능이 가장 높게 나타 났고, 과육과 whole 사과에서는 낮은 수준의 항산화 활성이 나타났다. 위의 결과에 따라 루비에스 사과의 껍질, 과육, whole 사과를 비교하였을 때 껍질 water와 ethanol 추출물 에서 5.29, 8.76 mg/g으로 페놀 함량이 가장 높게 나타났으 며, 항산화 활성에서도 과육에 비해 껍질이 높은 활성을 나 타내는 것을 확인하였다. 따라서 이후 실험에는 효능이 높았 던 껍질을 대상으로 실험을 진행하였다.
신육성 품종인 루비에스 사과 추출물의 고형분과 phenolic 의 생리활성 비교
루비에스 사과의 고형분과 phenolic 성분의 생리활성 효
능을 비교를 위해 DPPH 라디칼을 측정한 결과 Fig. 2A에서 와 같이 루비에스 사과 껍질 water, ethanol 추출물의 100 μg/mL 농도의 고형분에서는 각각 16.25, 19.19%의 전자공 여능을 나타내었으나, 100 μg/mL phenolic 농도에서 각각 88.34, 90.38%의 전자공여능을 나타내었다. 고형분과 phe- nolic 성분의 ABTS 라디칼 소거능을 측정한 결과 Fig. 2B 에서와 같이 루비에스 사과 껍질의 water, ethanol 추출물 100 μg/mL 농도의 고형분에서 각각 3.47, 3.42%의 전자공 여능을 나타내었으나, 100 μg/mL phenolic 농도에서 각각 98.46, 95.66%의 전자공여능을 나타내어 사과의 생리활성 에는 고형분 중에 함유된 phenolic compound에 의해 활성 이 지배되는 것으로 확인되었다. 따라서 루비에스 사과 껍질 의 phenolic compounds가 생리활성에 직접 관여한다고 판 단되어 루비에스 사과의 껍질 부분의 phenolic compound 를 추출하여 기능성 화장품 활성 및 건강 기능성 식품 활성 을 검토하였다.
신육성 품종인 루비에스 사과의 용매 종류별, 농도별 phe- nolic compound 추출 수율 비교
추출은 각 용매의 특성에 따라 시료에 함유된 생리활성
0 2 4 6 8 10
Water Ethanol Methanol Acetone Etyhl acetate
Butanol Solvent
Contents of phenolics (mg/g) . Peel
e
a b b c d
A
0
2 4 6 8 10
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Concentration of ethanol (%)
Contents of phenolics (mg/g) . Peel
b
B
b a c d f e g d c a
Fig. 3. The content of phenolic content in extracts from peel of Ruby S apple by various solvent (A) and ethanol concentration (B). Means with different letters (a-g) above the bars are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.
물질 및 기능성 물질을 분리하는 방법이며, 추출 시 사용되 는 용매의 설정은 생리활성 실험 전 단계에 중요한 영향을 미친다. 순수한 증류수를 이용한 열수 추출은 용매에 대한 유해성의 문제가 없고 수율이 높으며 수용성 물질 추출에 많이 이용되고 있으며, 극성 용매인 ethanol 추출의 경우 추출 후 정제가 쉽고 식물체의 tannin, saponin, organic acid 등 다양한 유용성분 추출에 주로 이용되고 있다(20).
루비에스 사과의 껍질을 water와 ethanol 농도별로 추출하 여 phenolic 함량을 측정한 결과 Fig. 3A에서와 같이 wa- ter, methanol, ethanol, acetone, butanol, ethyl acetate 순으로 각각 5.53, 5.29, 4.99, 2.82, 2.75, 2.35 mg/g의 phenolic 함량을 나타내었으며, 상대적으로 높은 추출 수율 을 나타낸 water, methanol, ethanol 중에서 인체에 무해하 며 비교적 높은 phenolic 함량을 나타낸 water와 ethanol 추출물을 대상으로 실험하였다. 껍질의 ethanol 농도별 추 출물에서는 Fig. 3B에서와 같이 40% ethanol 추출물에서 8.76 mg/g으로 phenolic 함량의 가장 높은 추출 수율을 나 타내었다. Lee 등(21)의 연구에서는 ethanol 농도에 따라 추출되는 phenolic 함량의 수율이 다르게 나타났으며, 주름 조개풀의 ethanol 농도별 추출물에서는 70% ethanol에서 가장 높은 함량을 나타내었다고 보고한 바 있다. 따라서 높 은 추출 수율과 기능성 화장품에 적용시키기 위하여 사과의 껍질을 water와 40% ethanol을 용매로 추출하여 실험을 진행하였으며, 실험의 재현성을 위해 phenolic 함량을 25~
200 μg/mL로 조절하여 항산화 효과, 화장품 활성 및 건강 기능성 식품 활성을 검증하였다.
신육성 품종인 루비에스 사과의 항산화 활성
항산화 물질은 체내의 세포 내에서 해로운 반응을 일으키 는 free radical이 DNA를 공격하거나 지질을 산화시키기 전에 그들을 중화시켜 버린다. 따라서 항산화제는 인류가 현재 관심을 집중하는 기능성 혹은 생리활성 물질의 하나로 서 식품의 변질을 방지하고 인체에서의 노화 방지, 성인병 예방 등의 기능을 할 수 있는 물질로 알려져 있다(22,23).
항산화제는 반응성이 높아 체내 유해물질과 반응하여 세포
내 주요 물질들이 활성산소에 의한 연쇄반응을 막아 주어 세포를 보호하는 역할을 한다(23). 체내에는 항산화 효소계 인 superoxide dismutase(SOD), catalase, glutathione peroxidase(GSH-Px), glutathione S-transferase(GST) 등이 존재하며, 저분자로 항산화제 혹은 free radical scav- enger 역할을 하는 항산화 물질인 vitamin C, vitamin E, β-carotin, carotenoids, flavonoids 그리고 selenium을 비롯한 몇 가지 무기질 등이 인체를 보호하는 것으로 알려져 있다(23,24). 루비에스 사과 껍질 추출물의 항산화 효과를 평가하기 위해 11개의 이중 결합으로 구성되어 있어 높은 불포화 성질을 가지고 있는 β-carotene은 peroxyl radical 과 매우 쉽게 반응하는데, 불포화된 탄소 중 하나에 선택적 연쇄 절단되어 항산화제로서 작용하는 성질을 이용하여 지 용성 항산화능을 나타내는 PF를 측정한 결과 Fig. 4A에서 와 같이 루비에스 껍질의 water, ethanol 추출물의 25~100 μg/mL phenolic 농도에서 각각 1.56~1.87, 1.39~1.77 PF 를 나타내었다. 대조구로 사용한 후지 품종 껍질의 water, ethanol 추출물은 Fig. 4A에서와 같이 25~100 μg/mL phenolic 농도에서 각각 1.22~1.29 PF와 1.26~1.37 PF를 나타내어 25 μg/mL의 낮은 phenolic 농도에서부터 100 μg/
mL의 고농도까지 루비에스 추출물이 후지 사과에 비해 더 우수한 결과를 나타내었으며, 지용성 항산화능에 더 효과가 있다고 판단되었다. 루비에스 껍질 추출물을 이용하여 또 다른 지용성 항산화능을 나타내는 TBARS를 측정한 결과 Fig. 4B에서와 같이 루비에스 껍질의 water, ethanol 추출 물에서 각각 37.69~80.17%와 18.03~38.76%의 활성을 나 타내었다. 대조구로 사용한 후지 사과 껍질 water, ethanol 추출물은 Fig. 4B에서와 같이 각각 32.60~55.40%와 20.57
~72.48%의 활성을 나타내어 루비에스 껍질 추출물이 후지 사과 껍질 추출물에 비해 ethanol 추출물보다는 water 추출 물이 효능이 더 우수하다고 판단되었다. 따라서 루비에스 품종의 사과 껍질 추출물은 대조구인 후지 사과에 비해서도 더 높은 항산화 활성을 가짐으로 인해 항노화를 위한 기능성 소재로 활용이 가능할 것으로 판단되었다.
0 1 2 3 4 5
25 50 75 100
Phenolic content (μg/mL)
Antioxidant protection factor (PF) .
RPW RPE FPW FPE
b b b b
c c b b
c c a b c
a a a
A
0
20 40 60 80 100
25 50 75 100
Phenolic content (μg/mL)
TBARs (%) .
RPW RPE FPW FPE
b
ab b
b c
bc bc
bc d
c c
c
a
a a
a
B
Fig. 4. Antioxidant activity of water and ethanol extracts from peel and whole of Ruby S. (A) antioxidant protection factor, (B) TBARs. Means with different letters (a-d) above the bars are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.
RPW, Ruby S peel water extract; RPE, Ruby S peel ethanol extract; FPW, Fuji peel water extract; FPE, Fuji peel ethanol extract.
0 10 20 30 40 50
50 100 150 200
Phenolic content (μg/mL)
Hyaluronidase inhibition (%) . RPW RPE FPW FPE
bab b
b b
b c
c c
a d
a aab a
A
0
20 40 60 80 100
50 100
Phenolic content (μg/mL)
Xanthine inhibition rate (%) . RPW RPE FPW FPE
a a
B
0 2 4 6 8 10
50 100 150 200
Phenolic content (μg/mL)
α-Amylase inhibition (%) . RPW RPE FPW FPE
b a
ab a c
a
a a c
a b a a
a a
C
0
20 40 60 80 100
50 100 150 200
Phenolic content (μg/mL)
α-Glucosidase inhibition (%) .
RPW RPE FPW FPE
b b
a b
b b
b
c b b
c c
a a
a
D
Fig. 5. Inhibition activity of water and ethanol extracts from peel of Ruby S on hyaluronidase (A), xanthine oxidase (B), α-amylase (C), and α-glucosidase (D). Means with different letters (a-c) above the bars are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test. RPW, Ruby S peel water extract; RPE, Ruby S peel ethanol extract; FPW, Fuji peel water extract; FPE, Fuji peel ethanol extract.
사과 신육성 품종 루비에스 껍질의 항염증 효과
고분자의 HA는 염증 형성의 중요 요인인 macrophage의 phagocytic ability를 저해하는 반면, HA의 분해산물 혹은 저분자의 HA는 상처 치유 과정에서 inflammation, fibro- sis, collagen deposition을 증가시킨다. 또한 hyaluroni- dase는 일반적으로 항상성 유지를 위해 불활성 형태로 리소 좀 등에 존재하고 있지만, 신체적 상해나 류머티즘과 같은 염증성 질환이 발병하였을 때 활성화되어 혈관계 투과성 및
염증반응에 관여하므로 염증 유발 물질로 알려져 있으며, 알레르기 반응과 암세포 전이 등에도 관여한다고 보고되었 다(25). 염증 유발과 관련이 있는 효소인 hyaluronidase 저 해 효과를 측정한 결과 Fig. 5A에서와 같이 루비에스와 후지 사과 껍질의 water 추출물에서는 매우 낮은 수준의 1.16~
5.61% 저해 효과를 나타내었고, 루비에스 껍질의 ethanol 추출물 50~200 μg/mL의 phenolic 농도에서 2.36~31.87%
의 저해 효과를 나타내었으며, 대조구로 이용한 후지 사과
껍질 ethanol 추출물 50~200 μg/mL의 phenolic 농도에서 1.29~12.72%의 저해 효과를 나타내어 루비에스 추출물이 후지 추출물에 비해 동일한 농도에서 더 우수하다고 판단되 었으며, 루비에스 추출물의 hyaluronidase 저해 효과가 후 지 품종에 비해 더 우수한 것을 확인할 수 있었다. 따라서 루비에스 껍질 추출물의 항염증, 아토피 억제효과를 활용한 기능성 제품의 산업화에 적용이 가능하다고 판단되었다.
신육성 품종인 루비에스 사과 껍질 추출물의 통풍 억제 활성 측정
통풍은 여러 가지 원인에 의해 체내 요산(uric acid) 농도 가 증가하고, 그로 인해서 과잉 축적된 요산이 결정화되면서 뾰족한 모양으로 형성되어 관절과 관절 주위 조직에 축적되 면서 재발성 발작성 염증을 일으키는 질환이다(26). 요산과 직접적인 관련성이 잘 알려진 질환은 통풍인데, 통풍은 고요 산혈증과 관련이 되어 있으며 혈중 요산염(urate)이 6.8 mg/dL(404 μmol/L) 이상일 때를 말한다. 요산은 체내의 퓨 린(purine) 대사의 최종산물이며, 체내 대사과정 중 hypo- xanthine과 xanthine이 XOase의 작용에 의해서 통풍을 유 발시킬 수 있는 요산을 생성하게 되며, xanthine oxidase는 통풍 발생에 결정적 역할을 수행하는 효소로 알려져 있다 (27). 다른 포유류에서는 urate oxidase라는 효소가 존재하 여 좀 더 수용성인 알란토인(allantoin)으로 변화되어 배설 되지만, 사람에서는 요산으로 주로 간에서 형성되어 신장에 서 걸러져 주로 소변으로 배설된다(28). 요산은 최근 연구에 서 고혈압을 포함한 심혈관계 질환, 신질환, 복부비만, 당뇨 병과 같은 대사 질환 등과의 관련성이 부각되고 있다. 통풍 유발 물질인 요산을 생성하는 xanthine oxidase 저해 효과 를 측정한 결과 Fig. 5B에서와 같이 루비에스 껍질 water 추출물에서는 xanthine oxidase 저해 효과가 나타나지 않 았으며, 루비에스 껍질 ethanol 추출물에서만 50~100 μg/
mL의 phenolic 농도에서 27.91~28.66%의 xanthine oxi- dase에 대한 저해 효과를 나타내었다. 대조구로 사용한 후 지 품종의 껍질 water, ethanol 추출물은 Fig. 5B에서와 같 이 xanthine oxidase에 대한 저해 효과가 관찰되지 않은 것으로 보아 후지 사과에 비해 루비에스 추출물에 더 우수한 성분이 함유되어 있다고 예상되었다. 따라서 기존 후지 품종 의 사과에서는 발견되지 않는 통풍 억제 효과가 신품종인 루비에스 사과에서는 존재하는 것으로 판단되었다.
신육성 품종 루비에스 사과 껍질 추출물의 항당뇨 효과 탄수화물의 주종인 전분은 장관에서 α-amylase에 의해 그리고 소장의 maltase에 의해 glucose로 가수분해되고 결 국 혈류로 흡수되어 혈당량 및 insulin level의 상승을 가져 온다(29). 따라서 α-amylase와 같은 효소의 작용을 조절할 수 있을 경우 전분의 소화속도를 지연시킴으로써 그 흡수 kinetics 및 혈당량의 분포에 영향을 미치게 되어 탄수화물 의 조절 이상으로 기인한 당뇨증상이나 비만증상의 환자에
게 있어서 식이요법의 치료효과를 증가시킬 수 있다(30).
루비에스 껍질 추출물의 α-amylase 저해 효과를 측정한 결 과 Fig. 5C에서와 같이 루비에스 껍질 water 추출물과 ethanol 추출물의 50~200 μg/mL의 phenolic 농도에서 각 각 1.92~3.64%와 2.33~2.71%의 낮은 저해 효과를 나타내 었으며, 대조구로 사용한 후지 품종의 껍질 water 추출물과 ethanol 추출물에서 1.19~2.02%와 0.84~0.91%의 낮은 저해 효과를 나타내어 루비에스 추출물이 우수한 저해 효과 를 나타내었다. α-Glucosidase는 소장 융모막에 존재하며 이당류나 다당류들을 보다 작은 단당류로 분해하여 당의 흡 수를 촉진시켜 혈당 상승작용을 일으킨다(31). 특히 식후 30분 경과 시 당의 흡수가 촉진되어 혈당이 증가하는데, 당 뇨병 환자의 경우 급격히 상승하는 과도한 혈당 및 고혈당증 이 지속됨에 따라 발생하는 활성산소들로 인해 당뇨병의 복 합증세인 신경장애, 신장장해 그리고 망막증 등과 같은 질병 이 발생하게 된다(32). 효모 기원 α-glucosidase 활성저해 효과를 측정한 결과 Fig. 5D에서와 같이 50~200 μg/mL의 phenolic 농도에서 루비에스 껍질의 water 추출물에서는 65.56~94.93%, ethanol 추출물에서는 96.62~100.00%의 매우 높은 저해 효과를 나타내었다. 대조구로 사용한 후지 품종의 껍질 water와 ethanol 추출물에서는 Fig. 5D에서와 같이 50~200 μg/mL의 phenolic 농도에서 각각 0.00~71.25
%와 62.41~95.56%의 저해 효과를 나타내어 루비에스 껍 질 추출물이 50 μg/mL의 저농도에서도 후지 품종보다 더 우수한 저해 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서 루비에스 껍질 추출물이 탄수화물 분해 효소의 활성을 매우 강하게 저해하는 것으로 판단되어, 루비에스 껍질 추출물의 당분해 억제 효과가 확인됨에 따라 기능성 식품 분야에서 기 능성 신소재로 적용 가능하다고 판단되었다.
신육성 품종 루비에스 사과껍질의 미백 효과
멜라닌(melanin)은 여러 동물의 피부나 눈 등의 조직에 존재하는 흑색 또는 갈색 색소를 총칭한다. 특히 멜라닌은 사람의 피부색을 결정하는 중요한 요소로써 인종에 따라 멜 라닌 발현 유전자가 다르고, 이에 따라 멜라닌 세포의 양이 조절되어 피부색이 결정된다(33). 피부에서 멜라닌은 자외 선 차단 기능으로 피부의 체온을 유지해주고 자외선으로부 터 피부를 보호해주지만, 과도한 멜라닌 생성은 기미, 주근 깨, 피부 반점 형성에 원인이 되며 더 나아가 피부암 유발에 기여한다(34). 현재 화장품 분야에는 이러한 멜라닌 형성과 정의 불균형으로 인한 색소 침착을 막기 위하여 tyrosi- nase 억제를 target으로 하는 물질들을 개발 중이며 대표적 으로 kojic acid를 들 수 있다. 멜라닌 형성과정의 불균형으 로 인한 색소침착을 일으키는 tyrosinase 저해 효과를 측정 한 결과 Fig. 6A에서와 같이 루비에스 껍질의 water 추출물 에서는 50~200 μg/mL의 phenolic 농도에서 저해 효과가 나타나지 않았으며, 대조구로 사용한 후지 품종의 껍질 wa- ter 추출물에서도 저해 효과가 나타나지 않았다. 루비에스
0 5 10 15 20 25 30
50 100 150 200
Phenolic content (μg/mL)
Tyrosinase inhibition (%) . RPW RPE FPW FPE
b
a c
a d
a a a
A
0
10 20 30 40 50 60
50 100 150 200
Phenolic content (μg/mL)
Elastase inhibition (%) .
RPW RPE FPW FPE
ab a
b b
bc c
a c
c c
a d
a a
a
a
B
0
20 40 60 80 100
50 100 150 200
Phenolic content (μg/mL)
Collagenase inhibition (%) . RPW RPE FPW FPE
b b
b
b c
c
c
c d
d
d d
a a
a a
C
Fig. 6. Inhibition activity of water and ethanol extracts from peel of Ruby S on tyrosinase (A), elastase (B), and collagenase (C). Means with different letters (a-d) above the bars are sig- nificantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.
RPW, Ruby S peel water extract; RPE, Ruby S peel ethanol extract; FPW, Fuji peel water extract; FPE: Fuji peel ethanol extract.
껍질 ethanol 추출물에서는 50~200 μg/mL의 phenolic 농 도에서 5.82~17.50%의 저해 효과를 나타내었으며, 후지 껍질 ethanol 추출물에서는 50~200 μg/mL의 phenolic 농 도에서 2.69~5.23%의 매우 낮은 저해 효과를 나타내어 후 지 품종에 비해 루비에스 추출물의 tyrosinase 저해 효과가 50~200 μg/mL의 phenolic 농도에서 모두 더 높게 나타났 다. 따라서 루비에스 껍질 추출물의 첨가 농도를 높인다면 tyrosinase 저해제 또는 미백화장품을 위한 천연 화장료로 사용 가능성을 확인하였다.
신육성 품종 루비에스 사과껍질의 주름 개선 효과 구조 단백질인 elastin은 피부 노화가 진행됨에 따라 생성 량이 감소하고, 피부 노화 정도에 따라 type-1 collagenase 의 생합성이 증가하여 진피 내 교원섬유 및 탄력섬유와 같은 기질 단백질의 분해를 유도하여 피부탄력을 떨어뜨리고 피 부 주름의 생성을 야기한다(35). 인체의 중성구 과립구 내에 존재하는 elastase는 피부탄력성 섬유(elastin)를 분해하는 효소로 elastase의 저해는 피부 주름의 개선을 의미한다 (36). 인체의 피부탄력을 유지해주는 elastin을 분해하여 피 부 주름을 생성시키는 효소인 elastase의 저해 효과를 측정 한 결과 Fig. 6B에서와 같이 50~200 μg/mL의 phenolic 농도에서 루비에스 껍질의 water 추출물은 4.07~6.70%의 저해 효과를 나타내었고, 대조구로 사용한 후지 품종의 껍질 water 추출물은 0.00~5.35%의 낮은 저해 효과를 나타내었 다. 루비에스 껍질의 ethanol 추출물에서는 50~200 μg/mL 의 phenolic 농도에서 15.83~41.95%의 저해 효과를 나타
내었으며, 후지 껍질 ethanol 추출물에서는 8.02~32.10%
의 저해 효과를 나타내어 후지 품종에 비해 루비에스 추출물 의 elastase 저해 효과가 더 우수함이 확인되어 주름 개선을 위한 기능성 화장료로 사용이 가능할 것으로 판단하였다.
Collagen은 피부의 기계적 견고성과 결합조직의 저항력, 조 직력, 세포분할과 분화를 유도하는 기능을 가지고 있으며, 자연노화에 따른 세포 활성 감소와 같은 내적요인과 여러 유해 환경에 의한 스트레스 증가, 자외선 조사에 의한 광노 화와 같은 외적 요인에 의해 분해된다(37). 이러한 collagen 의 감소는 피부의 탄력을 저하시켜 주름과 피부 쳐짐의 원인 이 된다고 보고되어 있다. Collagen을 분해하는 enzyme인 collagenase를 이용하여 저해 효과를 측정한 결과 Fig. 6C 에서와 같이 50~200 μg/mL의 phenolic 농도에서 루비에 스 껍질의 water 추출물은 12.60~69.85%, 대조구로 사용 한 후지 품종의 껍질 water 추출물에서는 25.89~59.73%
의 저해 효과를 나타내었다. 루비에스 껍질의 ethanol 추출 물에서는 50~200 μg/mL의 phenolic 농도에서 35.01~80.73
%의 매우 높은 저해 효과를 나타내었으며, 후지 껍질 etha- nol 추출물에서는 47.79~79.05%의 저해 효과를 나타내어 루비에스 추출물이 50~200 μg/mL의 phenolic 농도 구간 별로 유사하거나 더 우수한 저해 효과를 나타내었다. 따라서 루비에스 껍질 추출물은 피부 탄력을 유지하는 데 중요한 단백질인 elastin과 collagen을 분해하여 주름 유발에 영향 을 미치는 효소인 elastase 및 collagenase를 억제하여 피 부 주름 개선 효과에 매우 긍정적인 영향을 미치는 것으로 확인되었다. 상기의 결과에서와 같이 루비에스 품종의 사과
는 항산화, 미백 및 주름 개선 등 기능성 화장품 활성과 항염 증, 항당뇨 및 통풍 억제활성 검정에서 대조구로 사용된 후 지 품종의 사과에 비해 매우 우수한 생리활성을 가지며, 이 러한 생리활성은 껍질 추출물에서 매우 우수한 활성을 나타 내었다. 따라서 산업화를 위해서는 과육은 식용으로 소비하 고 버려지는 껍질을 활용하는 것이 바람직할 것으로 판단되 었다.
요 약
식육성 품종 루비에스 껍질의 water와 ethanol 추출물들의 항산화, 건강 기능성 및 미용식품 활성을 살펴보았다. 신육 성 품종 루비에스 껍질로부터 water와 ethanol로 추출하였 을 때 각각 5.29, 8.76 mg/g의 비교적 높은 phenolic 함량을 나타내었다. 루비에스 껍질 추출물의 antioxidant protec- tion factor는 water와 ethanol 추출물 100 μg/mL phe- nolics 농도에서 각각 1.87, 1.77 PF를 나타내었으며, TBARS 는 100 μg/mL phenolics 농도에서 water 추출물은 80.17
%, ethanol 추출물은 38.72%의 항산화능을 나타내어, 루비 에스 사과 껍질 추출물의 경우 노화방지를 위한 천연 항산화 제로 활용 가능성이 매우 높은 것으로 판단하였다. 루비에스 껍질 추출물의 항염증(hyaluronidase 저해) 효과는 water 및 ethanol 추출물 200 μg/mL phenolics 농도에서 각각 5.61, 31.87%의 저해 효과를 나타내었다. 통풍을 유발하는 xanthine oxidase 저해 효과는 ethanol 추출물에서만 100 μg/mL의 phenolic 농도에서 28.66%의 xanthine oxidase 저해 효과를 나타내어 대조구로 사용된 후지 품종에 비교해 상대적으로 높은 저해 효과를 나타내었다. 루비에스 껍질 추출물의 α-amylase 저해 효과는 water 추출물과 ethanol 추출물 모두 비교적 낮은 저해 효과를 나타내었으나, α- glucosidase 활성저해의 경우 200 μg/mL의 phenolic 농도 에서 water와 ethanol 추출물에서 각각 94.93%와 100.00
%의 매우 높은 저해 효과를 나타내었다. 미백 효과를 측정하 는 tyrosinase 저해 효과는 200 μg/mL의 phenolic 농도에 서 ethanol 추출물에서만 17.50%의 저해 효과를 나타내었 다. 주름 개선 효과를 나타내는 elastase 및 collagenase 저해 효과는 200 μg/mL phenolics 농도의 water 추출물에 서 각각 6.70, 69.85%의 저해 효과를 나타내었고, ethanol 추출물에서 각각 41.95, 80.73%의 저해 효과를 나타내어 기능성 화장품 개발을 위한 소재로 활용 가능성이 매우 높은 것으로 판단하였다. 따라서 루비에스 껍질 추출물의 항산화, 항염증, 통풍 억제, 항당뇨, 미백 및 주름 개선 효과 및 항당 뇨, 통풍 억제 효과를 확인하였고, 기존의 후지 품종과 비교 해서 기능성이 더 우수함이 밝혀져 새로운 기능성 화장품 및 건강 기능성 식품 조성물로 이용이 가능할 것으로 판단되 었다.
감사의 글
본 연구는 2017년도 농촌진흥청 어젠다사업(과제번호: PJ 01245503, 사과 신육성 품종 이용성 증대 연구)의 연구비 지원에 의해 연구되었으며, 이에 감사드립니다.
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