Journal of Sasang Constitutional Medicine

사상체질의학회지

J. ^{of Sasang Consc. Med}

Vol. 13. No 1. 2001

熱多훌少漫 행

Jr

. I

"

^훌

³

^{똥이 XO/HX 에 의해}

^#

^톨優된

t

音養홉홉훌感覺神훌훌細뼈에 미

II

는 效果

흥정 0.*

.

^김경요

^* .

유도곤

^**.

박혜선

* .

_김형순

_*

I Abstract I

Effects of Yuldahansotang water extract on Cultured Spinal

Sensory Neurons Damaged by Xanthine Oxidase/Hypoxanthine

nn ” *

”

때

%

UVJ u

”

m n

“

. n

녕

m

” Q ν v4

”

대

n

n

「

au

”

m

nu 4b nu

”

u

. Vl nu

γ뼈”

y

“

m n

“

- n

(1

때

kt

뼈니”

. ^Depl.

^이

^Sasang Constrtutional Medicine, College of Oriental Medicine, Wonkwang Univ

.. Depl. of Physiology, College

이

Oriental Medi

^α

ne, Wonkwang Univ.

To evaluate the effect of Y

띠 dahansotang(YHn

water extract on cultured mouse spinal sensory neuron which was

inhibited by xanthine oxidase(XO) and hypoxanthine(HX)-induced oxigen radic

때5, MTT

assay, NR assay, Neurof1lamenr

enzymeirnmuno assay and LDH activiry assay were carried our after the cultured mouse spinal sensory neuron were

preincubared with various concenrrarions of YHT water exrraa for 3 hours prior to exposure of XO/HX

The results obtained were as follows:

1. XO/HX, a oxigen radical, decreased the survival rare of rhe culrured mouse spinal sensory neuron cells on NR

assay and MTT assay

2. MTT50 value and NR50 value of XO/HX were 20 mU/mI XO/0.2 mM HX and 40 mU/ml XO/0.2 mM HX

3. YHT warer extracr have

빠icacy

of increasing neurof1lamenr.

4. YHT warer extracr have efficacy of increasing LDH activity.

From above rhe results, Ir is concluded rhar YHT has marked efficacy as a rrearment for the damages caused in the

XO/HX-mediared oxidative process

Key word: Xanthine Oxidase(XO), Hypoxanrhine(HX), MTT, NR, Yuldahansorang(YHn, Neurofuamenr, LDH

actiVity

I.

績뚫 는 정상적인 대사과정에서 사립체의 전자전달계에

의한 산화인산화작용에 의하여 형성되며 , 이는

su

야roxide

d 잉 muras

머SOD) 나

cat

띠 ase 에 의하여 물로

Superoxide

나 hydrogen

peroxide

와 같은 嚴素

g

_由基

원광대학교 대학원 한의학과

..

원광대학교 한의학과 생리학교실 교신저자

.

홍정아 주소

)

광주광역시 서구 광천동 99-15 서광한의윈 전화)062-364-7582

E-m

때)[email protected]

-

홈징아

;

째용흉少뼈 ;&!;JOI

XC

까-IX 어1 의해 쩌홉된 훌 협

flH

^{“훌훌훌에 미치는 었훌}

-

변환되어 소실된다

.

그러나 저산소중이나 虛血 및 中風과 같은 異常的인 상태에서는 嚴素

g

_{由基가 비}

정상적으로 형성되어

1),

그 결과 세포막의 지질과산 화반웅올 촉진시킬 뿐만 아니라

2)

protein kinase

qPKC)

나 lipid

phosphatase A2

와 같은 2 차 전달자를

비롯하여 각종 효소나 단백질을 불활성시킴으로써 세포의 손상 및 조직의 괴사를 초래한다

³⁾

홉쫓素

g

_由

基는 노인성치매의 병인올 비롯하여, 중풍

,

근위축 성 측삭경화중

4)

및 뇌허혈과 같은 각종 질환의 병 인으로 밝혁지고 있다’

)

최근에 이러한 嚴素

g

由基의 嚴化的 揚陽에 대하 여 韓藥材가 효과적인 抗嚴化作用올 나타낸다는 맑

究報告

^{6) 째'fJ)}

들이 있다‘

이에 저자는 李濟馬의 熱多寒少陽에도 嚴素自由 基의 顧化的 揚陽에 대한 防寶作用이 있는지 알아 보기로 하였다

.

熱多寒少楊은 太陰

Allf

受熱훌熱病에 많이 용용 되는 훌證의 대표적인 처방으로

,

훌根

,

黃혹

,

훌本, 羅훌子,

f

좀種, 升麻, 白표 둥으로 구성되어 있으며 , 임상에서 태음인의 중용 동 성인병에 다용되고 있 는 처방이다

10)11)12)

本 활驗에서는 嚴素

g

_{由基를 훌홉흉發하기위하여}

Xanc

뼈

eh

…

une

따

Ie Ox

찌버빼빼

^d

뼈

ase

터써

/l

떠

Hypox

뻐삐

ar nc

뼈

Ie“비삐 hine

經細

8

脫힘에 처 리한 후 細뼈毒性을

MTI

정 량 , NR 정 량 측면에서 조사하였으며

, 熱多寒少陽의 防寶效果

를 관찰하기 위하여 熱多寒少陽 jffi 陽1& 올 j{f 養 홉 훌훌感쩔神經細

R

힘에 전처 리 한 후 Neurofilarnene

enzy-

meimmuno assay, LDH

활성도 측정올 하였는 바

,

_유

의한 결과를 관찰하였기에 보고하는 바이다

II ^.

톰뚫

*:f

및 方法

1.

톨뚫材

1)

를훌빠物

本 實驗에 便用한 동물은 ICR 계통의 생후 3 일된 건강상태가 양호한 생쥐를 便用하였다

.

2)

쫓材

本 홈驗에서 使用된 熱多寒少陽은 東훌훌홉世保元

¹³⁾

에 依據하였으며

,

藥材는 圓光大學校 附屬益山韓方 病院에서 購入한 후 嚴選하여 便用하였고

,

內容과

分量은 다음과 같다.

Prescription of Yuldahansotang(YHT)

'*

^{훌 名}

훌 根

黃

a

^{홉 本}

훗 훌훌 子

*

홉 훈 升 麻 白

:if

重훌)

16

8 8 4 4 4 4 48

生훌名

Radix Puerariae Radix ScuteUariae Rhizoma Li.l!ustici

Semen Raphani

R

때α Platyc αIi

Rhizoma Cimicifugae R

때Dc Angelicae

D

쇠1 띠icae

훌 計

2.

톨옳方法

1)

훌훌의

III

뭘

熱多寒少楊 4 貼 분량인 1929 에 3 차 증류수 1.8

e

를 환저플라스크에 넣고 冷뼈器를 附훌하여 3 시간 동안 電熱器로 !!R 楊한 후 3,000rpm 에서 20 분간 원 심분리하고 진공 농축기로 감압농축한 후 댔結乾操 器에서 24 시간 淚結乾爆하여 49.76g 의 분말 시료를 얻었다

.

2)

웰훌 월造

本 實훌훌에사용한 시 약으로는

Xanehine Oxid

앓

(XO,Sigma)

와

Hypo-xanthine(HX,Sigma)

로서

XO

는

l00mU/

뼈,

IOmU/

뼈,

ImU/me

의 저장액올 ,

HX

는

l00mM, IOmM, ImM

의 저장액올 만들어 냉암소에

보관한 후 實뚫 당일 적당한 양으로 희석 사용하거 나 필요한 양을 직접 培餐被에 첨가하여 사용하였 다

.

3)

빼뼈임훌훌

홉훌훌感、경

g

神經細뼈의 분리는 Michikawa 동

¹⁴⁾

의 방 법에 따라 시행하였다 즉 생후

1-3

일된 생쥐에서 적출한 척수조직은 0.25%

t πpsm 이 포합된 phosphate

buffered saline(PBS)

으로 처리한 후

36 t, 5%

C02/95%

허r 로 조절된 항온기 내에서 培養하였다

.

培

養완료 후 10%

fee

외 bovine

serum(FBS, Gibeo)

이 포항 된 Eagle ^’

s minimwn essential mediwn(EMEM, Gibeo)

으 로 3 회 세척 후

Paseeur

피멧으로 세포를 분리시켰 다

.

분리 된 세포들은

Poly-L-lysine(Sigma)

으로 전처리 된 96-m 띠 eiwell 에

3 X 106cells/well

의 밀도로 세포를 분주하였다

.

분주된 세포는 3 일 간격으로 새로운 培

-

사상째절의학회지 채

13

권 채 1 호 2X)1

-

養被으로 교환하여 주었으며 7 일 동안 培훌後 本 寶驗에 사용하였다

.

4)

훌훌검由훌 흩훌

嚴素自由基가 생쥐의 홉훌훌感뿔神經細뼈에 미치 는 影響을 調흉하기 위하여 일정시간 혐養한 神經 細뼈를 0.6%-0

glucose

가 합유된 MEM 으로 3 회 세

척 한 다음 여 러 농도의

Xanthine Oxidase(XO)

와

Hypoxathine(HX)

이 포합된 培養被에서

1-16

시간 동

안 처리 후 分析하였다

.

5)

빼應훌性 및 防활效果 훌훌

(1) MTT

定톨

MTI < 3-( 4,5-dimethylchiazol-2-yl)-2,5

강iphenyl

tetrazol

ium bromide(Sigma»

定量은 Mosmann

¹⁵⁾

의 방법에

의하였다 . 嚴素自由基나 항산화제를 처리한 培養 神 經細뼈를 PBS 로 3 회 세척한 후 전날 제조한

50

뼈

mt

의 M π를 well 당 최종흩度로 회석하여 넣어 3

7 .c, 5% CO2

로 조절된 정온기에서 培養하였다

.

培 養 완료후 dimethylsulfoxide

(OMSO, Merk)

를 처리한 다음 spectrophotometer 로 570nm 에 서 홉광도를 측정 후 대조군과 比較 調훌하였다

.

(2) NR

定톨

Neutral red(NR, Sinma)

의 定훌은

Borenfreud9} Pue-

16)mer

의 방법에 따랐다 즉 여러 훌度의

Xanthine

Oxid

잃어

XO)

를 처리한 培養 神經細뼈를

phosphate

buffered s

외 In 어

PBS)

으로 3 회 세척 후 전날 제조한

5

m&'mt

의 NR 을 well 당 최종 짧度로 희석하여 넣은 다

음 3 시간 동안 37 "C,

5% C02

로 조절된 정옹기에서 培養하였다

.

培養 완료 후 PBS 로 3 회 세척 후

1%

formalin

으로 고정하고

1 % glacial acetic acid

로 처리

한 다음 spectrophotometer 로 540nm 에서 홉광도를 측 정하여 대조군과 比較 調훌하였다

.

(3) Neurofilament enzymeimmuno assay(EO

培養중인 神經細뼈를 PBS 로 3 회 세척하여 알콜 로 고정 시 킨 다음 0.2%

TritOn X-IOO

이 포항된

PBS

로

3

회 세척하였다 세척 환료 후

NE 14( 1: 100,

Sigma)

로 l 시 간 동안 반응시 킨 후 0.04%

O-pheny-

lenediami

뼈OPO,

Sigma)

과 0.02%

hydrogen peroxide

로

처리한 다음 Dynatech

Microelisa reader

로 490nm 에 서 홉광도를 측정하여 대조군과 比較 調훌하였다

(4) Lactate Dehydrogenase(LDH)

活性 調훌

LDH

활성의 측정은 ki 떼apan) 의 효소 기질액

1.0

밴를 tube{P 외con) 에 넣은 후 검체인 배양액올 넣어 잘 혼합한 후 37'C 로 조절된 정온기에서 반웅시켰 다. 반웅 완료 후 회석반웅 정지액올 3.0 뼈를 넣고 잘 혼합한 후 speCtrophotometer 로 570nm 에 서 홉광도 를 측정하였다

.

6)

홉밝 흩훌

實驗 結果에 대한 유의성의 검정은 ANOVA 후에

T

따ey-Kramer

multiple comparison test

에 의 하였으며

p 값이 0.05

이하인 것만 유의 한 것으로 하였다 .

III.

를앓成홉

1.

흩훌自由훌의 훌性效果

1) MTT

定

.

홉찾素엄由基가 培養 ￥￥훌훌感훌뼈經細

8

힘에 미치는

影響을 調훌하기 위하여

Xanthine Oxid

잃어XO) 가 l

mU/

뼈에서 30mU/ 뼈 까지의 각각의 훌度로 포함된

tg 훌被에서 5 시간 동안 培養한 후 Xanthine Oxid

앓

(XO)

의 毒性效果를

Mπ 정량법에의하여調흉한

結果처리한XO 의 농도에 비례하여 세포생존율이 감소하였으며 특히

20mU/

뼈, 30mU/mt

XO

처 리 에 서 세포의 생존율이 대조군

100%

에 비하여

48.9%

(p<0.05), 40.4%(p<0.01)

로 유의한 감소를 나타냈다

MCV(Midcyroroxicity v

외 ue) 값은 20mU/ 뼈 XO 처 리 에

서 나타났다 ,Fig.

I)

Xanthine Oxidase(XO)

와 Hypoxathine(HX) 이 시 간

에 따라 培養 휴體感훨神經細

8

힘에 미치는 影響을

調훌하기 위하여

0.2mM HX

에 M α값인 20mU/mt

XO

가 포함된 tg 養陳에서 휴훌훌感、뿔神經細뼈를각각

2-16

시간 동안 혐훌한 후 세포의 생존율을 MTI 정 량법에 의하여 대조군과 比較 調흉한 結果

XO

를 처리한 후 바로 측정한 결과 시간이 지남에 따라 세포생존율이 감소하였으며 특히 8 시간{P<0.05),

16

시샌p<O.Ol) 후에 대조군에 비하여 유의한 감소를 나타냈다,Fig.

2).

-

훌징이 뺑多흥少껑

;

짧01 x 아-IX^{에 의해 쩌홈된}

Ii!

톨 홉홈흉톰빼앨뼈뼈에 미치는 했훌

-

기

120

홍

’

0080

@ 흐

-' 20

0

control 10 20 30

XO concentration (mU/ml)

Fig. 1. Dose-dependency of Xanthine Oxidase(XO).

XO-induced neucocoxiciry was measured by MTI assay in culrured

mouse spinal se

따ory

neurons. Cult

띠es

we π exposed co I, 10, 20

and 30 mU/me XO fot 8 hours, respectively. *p<0.05, "p<O.OI

- 120

"0 100

。 9

'0 ⁸⁰

‘ξ‘⁾

.. 60

@

u.. 40

: ...J 1 ‘。

control

c

그 XO/HX

20mU/ml/mM

**

20

0

control 2 ‘ .

XO/HX Incubation time (hour)

16

Fig. 2. Time-dependancy

이

Xanthine Oxidase(XO) and

Hypoxanthine(HX) in cultured mouse spinal sensory

neurons.

Cul

따es

were exposed to 20 mU/me XO and 0.2 mM !-IX for 2,

4, 8 and 16 hours, respectively. **p<O.OI

2) NR

훌톨

t

흠養中인 홉體感、쩔神찜細뼈를 Ca

^{2+, Mg 2+} free

인

Hank

^’

s balanced salt solution(HBSS, Gibco)

으로 3 회 세

척한 후

Xanthine Oxidase(XO)

가

lOmU/

뼈에서

60mU/

뼈까지 의 생용度로각각 포항된 培餐被에서

8

시간 培養한 다음 이의 影響을 調흉한 結果 처리한 농도에 의존적으로 세포의 생존율이 감소하였다

.

특 히 40mU/m,

60mU/r

뼈 XO 의 농도로 처리한 군에서 대조군

100%

에 비하여 각각 50.9%(p<0.05),

34.0%

(p<O.OI)

로 유의한 감소를 나타냈으며

MCV (mid-

cytotoxicicy v

때 ue) 값은 40mU/

XO

처리에서 나타났

대Fig.

3).

Xanthine Oxidase(XO)

와 Hypoxathine(HX) 가 培養

時間에 따라 홉짧感활神經細뼈에 미치는 影홈올 調 훌하기 위하여 0.2mM

HX

에

Mα값인 40mU/

뼈

XO

톨度에서 2-16 시간 동안 培養한 후 각 시간별 로 세포의 생폰율을 調흉한 結果 처리한 시간에 비 례하여 세포생존율이 감소하였으며 특히 8 시간,

16

시간에서는 대조군에 비하여 유의한 감소를 나타냈 다{Fig.

4).

120

빼빼빼빼때

=pg=

。

: ^。

*--- 훌

U@ 〉그

o

contr

여

, 。 20 40 60

XO concenlre ‘ Ion (mU/ml

’

Fig. 3. Do

않-respon 않

relationship

이 Xanthine

Oxid-

ase(XO) in cuijured mouse sp

뼈I sensory

neurons.

Cyrotoxiciry was measured by NR assay. CultUres wete ex

κ)Sed

to

αcomrol),

10, 20, 40 and 60 mUlme XO for 8 hours, res

야aively.

*p<0.05, **p<O.OI

흥

_c ¹⁰⁰

g

뼈

。 효

80

‘

.

g

뼈

3 .

20

14O -- 「빼

|

-빼

@

며

120

0

.

control 2 4 8 16

X01HX Incubation time (hour)

Fig. 4. Time-dependan

밍 이

Xanthine Oxidase(XO) and

Hypoxanthine(H)() in cuijured mouse spinal sen

∞ry

neurons.

Culrures were ex π>Sed to 40 mUl

뼈 XO 때d 0.2

mM !-IX for 2,

4, 8 and 16 h α us, res

야vely. α11 viabiliry

was measured by NR

assay. *p<0.05

’

**p<O.OI

-

사상쩨짙의학회지 재

13

권 채

1

호

2XJl -

2.

熟多훌少邊밟漫홉의 效훌

1) Neurofilament

定

.

(1) Xanthine Oxidase(XO)

와 Hypoxathine(HX) 의 影훌

XO/HX

훌度에 따른 Neurof1lamenr 의 양적 측정올

위 한 Neurofilamenr

EIA

에 있어서

0.2mM HX

에 XO 가 1-60mU/ 뼈까지의

^@

훌度로 각각 포함된 培養 에 서 휴團感훨神經細뼈를

8

시간 동안 처리한 후 세포 의 생존율을 대조군과 比較 調흉하였다

.

그 結果

XO

를 처리한 농도에 비례하여 Neurof1lament 의 양이 감소하였다 특히

30mU/mQ, 60mU!

뼈 XO 의 경우는

대조군에 비하여 각각

47.1%(p<0.05), 22.2%

(p<O.OI)

로 유의한 감소를 나타냈으며

MCV

값{mid-

cytotOxiciry value)

은 30mU/ 뼈 XO 의 처리에서 나타냈

다-(Fig.

5).

120

10

。

톨

60

므

40

퉁

훌

20 o

control 15 30 60

XO/HX concentration

‘ mU/mUm 삐 }

Fig. 5. Dose-dependency of Xanthine Oxidase/Hypoxan-

thine(XO/HX) in cultured mouse spinal sen

∞ry

neurons.

Culmres were exposed ro I, 15, 30

때d 60

mU/mJ in 0.2 mM HX

for 8 hours, respeCtively. Amoun[ of neurofuament was measured at

wavelengrh of 490run. The results indicate the mean ::tSE(n=6)

*p<0.05, "p<O.OI

(2)

熱多寒少漫 (Yuldahansotang,

YHT)

의 效果 培養 홉훌훌感찢神經細

8

힘에 대 한 XO/HX 의 嚴化的 指陽에 있어서 熱多寒少楊 (Y 띠dahansotang,

YHT)

의

效果를

neurofilament

의 양적변화측연에서 調흉하기

위하여 XO/HX 의 MCV 값(midcytotoxicicy

v

쇠ue) 인 30

mU/mQ XO/0.2mM HX

짧度에서 8 시간 동안 노출시

키기 3 시간 전에 15-120 μ

g) 뼈 YHT 가 각각 포합된

培養被에서 전처리한 후 이의 防樂效果를 neurofila-

menr EIA

법 으로 調흉하였다 그 結果

neurofuamenr

의 양적변화에 있어서 쩌

T

만을 처리한 경우 척수 감각신경세포에 독성은 나타나지 않았다

30mU/

뼈

/mM XO/HX

만을 처리한 경우 대조군에 비하여 유

의한 감소를 나타나 유의한 독성올 나타냈다 그러 나 YHT 를 3 시간 동안 전처리한 경우 농도의존적으 로 XO/HX 에 의하여 감소한

neurofUamenr

의 양이 유

의하게 증가하여

XO/HX

의 독성에 대한 방어효과

를 보였다 -(Fig.

6).

’ 20

g 1

뼈

**

c

。

응 ^뼈

oJ!

C . E 60

.!! 40

퉁그

훌

20

0

control XOI 에 X 15 30 60

YHT concentration (

μ

gIml)

’ 20

Fig. 6. Dose-dependency of Yuldahansotang(YHT) for rts

protective effect on Xa

미

hine Oxidase/Hypoxanthine

(XO/HX) in cultured mouse spinal sensory neurons

Cult

띠cs were

preincubared with 15, 30, 60 and 120 _{μ wme YHT}

for 3 hours, r언야Ctivdy. After then, culmr

야 were

exposed ro 30

mU/ml in 2 mM HX for 8 hours. Am

。‘

mt of neurofuamenr was

measured ar wavelength of 49

삐n. The

res

띠ts

indicate the mean::t

SE(n =6). Significant differences from XO!HX-rreated group are

marked wirh asterisks. *p<0.05, "p<O.OI

2) LDH

훌톨

(1) Xanthine Oxidase(XO)

와 바 poxathine(HX) 의 影훌

XO/HX

의 농도에 따른

LDH

활성도를 측정하기

위하여 0.2

mM

의 HX 에 20 -80

mU/

뼈의 XO 가 각 각 포함된 배양액에서 培養 홉훌훌感、찢神經細뼈를

8

시간 동안 처리한 후 세포배양액내로 유출된 LDH 양올 대조군과 비교 조사하였다 . 그 결과 처리한

XO

의 농도에 비례하여 유의한 증가를 나타내 세포 독성을 나타냈으며 특히 60mU/mQ(p<0.05),

80mU/

뼈

(p<O.OI) XO

를 처리환 경우에 통계적으로 유의한

증가를 나타내 세포에 독성을 나타냈다. LDH 활성도 의 MCV 값 (midcyroro 잉

cicy v

에 ue) 은 6OmU/ 뼈 XO/0.2mM

뼈의 처리에서 나타났대 Fig.

7).

-

홈징아

:tI\

용흥少쩌 !!1;@i!01

XO!HX

이

|

의해 볍홉된 i 홉톨 홉빼

so.

훌홉§J 에 미 I 는 혔훌

-

200

**

§ “‘

8 ^IYV

s

1ft 100

용 홈

⁶⁰

0

control 20 ‘ o 60

XO/HX concentration (mUlmllmM)

, 。

Fig. 7. Dose-dependency of Xanthine Oxidase(XO) and

Hypoxanthine(HX).

XO/HX-induccd ne

ωOto:

잉디 ry was measured by LDH

양say 띠

cultUred mouse spinal sensory neurons. *p<O.05, **p<O.OI

(2)

勳多寒少漫 (Yuldahansotang,

YHT)

의 영향 培養 홉團感훌神經細뼈에 대한

Xan

뼈ine

Oxi

삐

d

뼈싫앓e바

/

Hy 뺑 pox

뼈때

ar nt

찌

i띠빼 th

끼피

i

끼

In

뼈

XO

이/떠

HX

찌

) 의 嚴化的 揚陽에 있어서 熱多

寒少揚 (Yuldahansotang,

YHT)

의 效果를

LDH

활성측 연에서 조사하기 위하여 XO!HX 의 MCV 값(midcy-

totoxiciry V

허 ue) 인 6OmU/m2

XO/0.2mM HX

농도에서

8

시간 동안 노출시키기

3

시간 전에

15-140

μfYm2

YHT

이 각각 포함된 배양액에서 전처리한 후 이의 방어효과를 조사하였다. 그 결과

XO!HX

를 처리하 지 않고 YHT 만을 농도별로 처리한 경우 대조군에 비하여 LDH 활성이 약간 감소하였으며 세포독성은 나타내지 않았다 . 6OmU/ 뼈 XO/0.2mM

HX

만올 처리 한 경우 XO!HX 를 처리하지 않은 대조군에 비하여

LDH

활성도가 증가하여 통계적으로 유의하게 독성 올 나타냈다. 그러나 YHT 을 전처리한 경우 처리한 농도에 비례하여 XO!HX 에 의하여 증가한

LDH

활 성도가 감소하였으며, 특히 35 μfYm2,

70

^μfYm2,

140

^μ

g

뼈의 농도로 처리한 군에서는 통계적으로 유의한 감소를 나타냈다{Fig.

8).

’ 20

- ¹⁰⁰

흥

6 8

。

... ‘J

。

60 i

〉

E .

^빼

룰

²⁰

0

control XOIHX 16 S6 70

YHT concentration (

μ glml

’

140

Fig. 8. Do

않-dependency

of Yuldahan

∞

lang(YHT) in LDH

achvlty.

Othet legends are the same as Table 8. Significant diffetences ftom

the XO/HX-tteatcd group are marked with asterisks

^‘

p<O.05,

**p<O.OI

N.

훌 察

熱多寒少楊은 훌根올 君으로 黃혹, 훌本

,

羅홈子, 뽑便, 升廳

,

白표 둥으로 이루어져 있으며 太陰

A

뺨受熱짧熱病의

Iff

像熱證에 쓰는 처방이다

17)

府大師小한 太陰

A

의 病證은 크게 몹院受寒表寒 病과

R

구受熱‘훌熱病으로 나누어지는데

,

府受熱훌熱 病은 太陰A, 0] 府大한 특정으로 吸取之氣가 太過하 여 안으로 모으는 기운이 많아 제대로 나가지는 못 하고 내부에 훌 뺨됨으로 인해 생기는 病證이다 .

그 중 府操熱證은 太陰

A, 0]

樂無厭하고 愈火外 짧하며

Iff

熱太盛하고 師操太

#i

하기 때운에 발생되 는 것인데 , 軟-홉二한 消獨病 , 手指薰黑홉휩病

,

虛

勞쫓

i1!!:

證 둥의 병중이 모두 이 범주에 속하는 병증

으로, 이 操熱올 해소하는 데 熱多寒少楊은 주요 處 方으로 제시된 것이다

¹⁸⁾

이러한 熱多寒少陽은 임상에서 중용을 비롯한 각 종 성인병질환 중 태음인 府操熱證에 해당되는 병 증에 많이 응용되고 있는 바, 이 처방에도 嚴素

g

_由

基의 嚴化的 揚陽에 대한 防寶作用이 있는지 알아 보기로 하였다

.

본 실험에서 신경세포에 독성을 유발한 嚴素自由 基는 생체막의 불포화지방산을 과산화시키거나 단 백질, DNA 를 변성시키는데’

^).19),

특히 代謝過程中 生 成되는 毒性

4

쩨質의 일종인 嚴素自由基는 흥분성아

-

사상혜짙의학회지 때

13

권 찌 1 호

:ID1 -

미 노샌 excitarory

amino acids, EAAs)

의 分泌를

l

足進시 키고 , 세포내 Ca++ 의 흩度를 增加시켜 결국 세포의

死홉을 招來

²⁰⁾²¹⁾

하는 것으로 알려졌다

.

이러한 嚴素自由基의 세포독성에 대하여 韓藥材 가 防實效果가 있다는 보고

6 아를

接하였다

.

本 實驗에서는 廳素自由基를 훌흉發하는Xanthine

Oxidase/Hypoxanthine (XO/HX)

올 培훌 홉훌훌感뿔神經

細뼈에 처리하여 XO/HX 에 諸發된 嚴素

g

_由基가

細뼈훌性올 유발하는지 M π 정량

:, NR

정량을 통하 여 관찰하였으며 熱多寒少陽의 防賣效果를 관찰하 기 위하여 熱多寒少陽

i!P

、陽被올 함養 홉톨

g

_{感、뿔神經}

細

8

힘에 3 시간 동안 전처리한 다음 XO 떠X 에 노출시 킨 후 NeurofLIament

enzymeimmuno assay, LDH

활성 도 측정을 통하여 熱多寒少陽의 방어효과를 관찰하 였다

細脫毒性의 유발여부를 관찰하기 위하여 0.2mM

HX

에 1-60mU/ 뼈의 XO 가 각각 여러 농도로 포함된 培養被에서 ￥￥훌§感쩔神經細뼈를

2-16

시간 동안 餐한 후 NR 이나 MTI 정량에 의하여 세포생존율을 측정하였다 - 그 결과 XO/HX 의 처리농도에 비 례하 여 유의하게 세포의 생존율이 감소하였다 {Fig.

1-4).

이러한 결과는 XO/HX 가 유발한 산소자유기가 세 포에 독성올 일으켜 독성올 나타낸 것으로 사료된 다

또한 XO/HX 의 嚴化的

#

員傷에 대환 熱多寒少楊 핏

]

、楊被의 效果를 조사하기 위하여 생쥐에서 순수분 리하여 培養한 홉훌훌感찢神經細

8

힘에 XO 떠X 를 처리 한 후 熱多寒少陽

!ffi

楊被의 효과를

neurofLIamenr

enzymeimmunoassay(E1A)

를 통하여 neurofilamenr 의 양

을 측정하였다 그 결과 XO/HX 는 培養 홉體感뿔神 經細뻔에 처 리한 농도에 비 례하여 neurofilamenr 의

양적 감소를 보였으며

30mU/

뼈 XO/0.2mM

HX

처 리

에 서

MCV

값(midcyrotoxiciry

v

외ue) 을 나타냈다{Table

5, Fig. 5).

그리고 30mU/ 뼈 XO/0.2mM

HX

를 8 시간 동안 感쩔神經細뼈에 처리하기 전 15-120 μ

rJrnt

의 몇!

多寒少陽 젠

i

‘楊被이 각각 포함된 培養被에서

3

시간 동안 전처리 환 경우 처리한 농도에 비례하여

XO/HX

만을 처리한 군에 비하여 neurofJament 의 양

이 통계적으로 유의하게 증가하는 것으로 나타났다

(Fig. 6).

또한

LDH

活性度 측면에서 조사한 결과

XO/HX

는 培養 휴훌훌感、훨神經細뼈에처리한 농도에

비례하여 LDH 活性度가 중가하여 세포에 독성올 나타냈으며 60mU/ 뼈 XO/0.2mM

HX

처리에서 M α 값(midcyrotoxiciry

v

때ue) 을 나타냈다{Table

7, Fig. 7).

그리고 60mU/ 뼈 XO/0.2mM

HX

를 8 시간 동안 感、훌 神經細뼈에 처리하기 전 15-140 ^μ

g/

뼈의 熱多寒少陽 뺀、陽條이 각각 포함된 培養被에서

3

시간 동안 전 처리 한 경우 처리한 농도에 비혜하여 XO/HX 만올 처리한 군에 비하여 LDH 활성도가 감소하였다

.

특 히 35 μrJmR"

70

μ

rJ mR" 140

_μrJmR, 熱多寒少楊 Jffi 陽被의 처리에서는 XO 떠X 만올 처리한 군에 비하여 통계 적으로 유의한 감소를 나타냈다{F 핑 . 8).

이같은 實驗 結果을 종합해보연 , XO/HX 는 배양 척수감각신경세포에 산소자유기를 유발하여 독성을 나타냈으며 熱多寒少陽

Jffi

陽

R

찾은 XO 떠X 에 의하여 유발된 嚴素

g

由基에 대하여 방어효과가 있다는 것 올 알 수 있었다

v. ⁱ

^{훌 훌홈}

했

!

多寒少陽이 홉꼈素自由基에 의한 神經毒性올 防 賣하는 效果를 究明하기 위하여 신생 흰쥐에서 분 리 餐한 홉體感훌神經細

R

힐를 여 러 농도의

xanthine oxidase(XO)

와 hypoxanthine(HX) 이 포함된

養被에 熱多寒少陽

Jffi

陽

%

찾올 3 시간 동안 처리한 다 음 熱多寒少楊이 혐養 홉團感훌神經細뼈에 미치는 影響올 觀察한 結果 다음과 같은 結꿇을 얻었다

.

1. XO!HX

는 배양 홉훌훌感훌빼經細뼈의 細脫生存率

올 농도와 시간에 의존적으로 감소시켰다

.

2. XO/HX

의 MTT50 과 NR50 값은

^{2OmU/mR, XO/O.2mM}

과 40mU/ 뼈 XO/0.2mM 로 나타났다

.

3.

熱多寒少陽

i!P

‘陽條은

XO/HX

에 의하여 혔發된 빼經細絲의 減少를 有意하게 防質하였다

.

4.

熱多寒少陽은 XO!HX 에 의하여 증가한

LDH

活 性度를 有意하게 柳制하였다 .

각추

I) ]esberger ]A,Richardson ]S. Oxygen free radicals and

brain dysfunction. Int. J. Ne

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홈징이 뺑多흉少훌

i&OI XOiHX 어 |

의해 빼훌된 엽톨 홉빼훌훌

..

훌 에 미치는 었훌

-

2)

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6)

金賢쫓 좀흉jffi 楊被이 培養心解細뼈에 미치는 짧 響

.

益山 : 圖光大學校 大學院 1998

7)

金鍾寬

.

太陰調몹楊이 Glucose

Oxidase

에 의해 揚 傷된 大腦皮質 神經細뼈에 미치는 影響

.

益山:

圓光大學校 大學院 1998.

8)

太陰

A

淸心運子楊이 Hydrogen

Peroxide

에 慣陽된 白鼠의 大腦神經細뼈에 미치는 影響 , 益山 , 圓光 大學校 大學院

1998.

9)

이영보, 송용선 . Dr! 味十全大補楊 前、陽被이Xan-

thine Oxid

잃

e/ Xanthine

에 의해 揚陽된

t

흠養 홉훌훌

運動神經細

8

힘에 미치는 影響

.

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