국내 헌혈혈액에서의 HIV-1 Subtype 분석 조연정

Received on November 29, 2012. Revised on December 11, 2012. Accepted on December 12, 2012 Correspondence to: Myung-Han Kim

Blood Transfusion Research Institute, Korean Red Cross, 764 Sanggye 6-dong, Nowon-gu, Seoul 139-831, Korea Tel: 82-2-3210-0331, Fax: 82-2-3210-0360, E-mail: [email protected]

본 연구는 대한적십자사 생명윤리심의지침에 의거하여 생명윤리를 준수하였습니다.

Vol. 23, No. 3, 210-216, December 2012

Original Article

국내 헌혈혈액에서의 HIV-1 Subtype 분석

조연정¹ㆍ김명한¹ㆍ권소영²ㆍ조남선²ㆍ윤경원¹ㆍ지용훈¹ㆍ최경영¹

대한적십자사 혈액수혈연구원¹, 혈액관리본부²

Analysis for Human Immunodeficiency Virus 1 Subtype in Korean Blood Donors

Youn Jung Cho¹, Myung-Han Kim¹, So-Yong Kwon², Nam-Sun Cho², Kyoung Won Yoon¹, Yong-Hun Jee¹, Kyoung Young Choi¹

Blood Transfusion Research Institute¹, Blood Service Heaquaters², Korean Red Cross, Seoul, Korea

Background: Genetic variants of virus appear to differ depending on the country, race, infection route, and so on. To characterize the main HIV subtype in infected blood donors and inquire about the route of HIV infection, we analyzed HIV subtype for samples that showed reactive results on the anti-HIV 1/2 and HIV-1 NAT test from September 2007 to February 2010.

Methods: To identify the HIV-1 subtype of the 90 samples that showed reactive results on the anti-HIV test and HIV-1 NAT, we performed HIV 1/2 Western blot assay, HIV RNA quantitative assay, HIV-1 nested PCR, and HIV-1 RNA sequencing.

Results: A total of 85 samples (94.4%) were confirmed to be HIV-1 subtypes. Among them, 82 samples (96.5%) were subtype B; and subtype A, C, and G was confirmed for one case each (1.2% for each case). We could not identify the subtype of the other five samples. One of them was amplified by nested PCR, but was not confirmed of the subtype, and four samples were not amplified even by nested PCR.

Conclusion: The main HIV-1 subtype among the HIV-infected blood donors was confirmed to be subtype B.

In addition, we identified one case each of HIV-1 subtype A, C, and G, which was not detected in blood donors in the past. It appeared that the route of HIV infection in Korea had become complicated. Therefore, we concluded that continuous research for HIV subtype analysis and efficient management of blood donors is needed. (Korean J Blood Transfus 2012;23:210-216)

Key words: Blood donor, HIV-1 subtype, Infection route

서 론

바이러스의 유전적 변이형은 국가별, 지역별, 인종 및 감염 경로에 따라 유전자형이 다르게 나 타나는 특징을 가지고 있다. 2011년 UNIDS/WHO 보고서에 따르면 현재 전세계적으로 HIV (Hu- man immunodeficiency Virus) 감염자는 3천 4백만 명에 이르는 것으로 보고되었고, 질병관리본부 자료에 따르면 2011년까지 국내 HIV 감염자는 7,656명에 이르며 감염자의 99%는 동성 또는 이 성간의 성적 접촉으로 인한 감염으로 보고되고 있다.^1,2) 그러므로 바이러스의 유전자형을 분석하 는 것은 헌혈자의 바이러스 감염경로를 파악하여 헌혈자 관리에 활용함으로써 안전한 혈액제제의 원료를 확보하는데 매우 중요한 자료로 활용될 수 있다.

대한적십자사에서는 1987년부터 헌혈혈액에 대하여 HIV 항체검사를 적용하였고, 2005년 2월 부터 헌혈혈액에 대해 HIV-1 핵산증폭검사(nu- cleic acid amplification test, NAT)를 실시하여 2007년 Lee 등이 2005년 2월부터 2006년 7월까지 HIV-1 NAT 양성으로 검출된 80예의 혈액에 대해 HIV-1 subtype을 분석한 결과 78예가 분석되었고, 78예 모두 HIV-1 subtype B형으로 밝혀졌다.³⁾

이에 본 연구에서는 2007년의 연구 이후 헌혈 혈액에서 HIV 유전자형의 특성을 파악하여 헌혈 자에서의 HIV 감염 경로와 특징 및 변화 양상을 연구하여 헌혈자 관리에 대한 자료로 활용하고자 하였다.

재료 및 방법

1. 연구대상

2007년 9월부터 2010년 2월까지 이 기간 동안

anti-HIV 1/2 선별(EIA) 검사와 HIV-1 NAT 검사 에서 모두 양성을 보이고 연구동의서가 첨부된 90예를 대상으로 분석하였다.

효소면역검사(Enzyme Immuno Assay, EIA)인 anti-HIV 1/2 선별검사와 및 HIV-1 NAT 검사에서 모두 양성결과를 보인 90예를 대상으로 하였다.

이때 anti-HIV 1/2 선별검사는 LG anti-HIV 1/2 plus (LG Life sciences, Daejeon, Korea)와 GENSCREEN HIV-1/2 v2.0 (BIO-RAD, Coquette, France) 2종의 시약을 사용하여 검사하였다. HIV-1 NAT 검사는 Roche system (Roche Diagnostics, Branchburg, NJ) 과 Chiron system (Chiron/Gen Probe, CA, USA) 2 종의 시약을 사용하여 검사하였다. EIA 및 NAT 선별검사는 각 기관과 검사기간에 따라 각 1종의 검사시약만으로 검사하였다.

2. 연구방법

1) HIV-1 NAT 양성 검체의 anti-HIV 1/2 선별 검사의 s/co ratio 분석

연구대상 90개 혈장 검체에 대한 anti-HIV 1/2 선별검사의 s/co ratio 분포는 검사 당시 실시간으 로 BeFree System 검사장비와 interface 되어 결과 가 입력된 대한적십자사 혈액정보시스템(blood information management system, BIMS) data를 이 용하여 결과를 분석하였다.

2) HIV-1/2 Western blot 확인검사

모든 검체에 대하여 HIV 항체 확인검사로 HIV Western blot 검사를 실시하였다. HIV BLOT2.2 (MP Diagnostics, Ingbert, Germany) 시약을 사용하 여 확인검사를 실시하고 결과를 판정하였다.

3) HIV-1 RNA 정량검사

모든 검체에 대하여 Amplicor Cobas HIV mon- itor test (Roche, Molecular System Inc., Branchburg, USA) 시약을 사용하여 HIV-1 RNA 정량검사를 실시하였다.

Fig. 1. Phylogenetic analysis of the C2 to V3 regions of the HIV-1 env gene in Korean blood donors and 27 representative reference sequences [4] from nine known subtypes (A through J) and O groups. The tree was constructed using the UPGMA (unweighted pair group method with arithmetic mean) in ClustalW2.1 (European Molecular Biology Labor- atory - European Bioinformatics In- stitute, EMBL-EBI). The 85 samples of the study was presented on 82 B subtype, 1 A subtype, 1 C subtype and 1 G subtype.

4) HIV-1 nested PCR

HIV-1 nested PCR은 다음의 방법으로 시행되 었다. 혈장 200 uL를 MPLC total nucleic acid iso- lation kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)를 이용하여 MagnaPure LC (Roche Dia- gnostics GmbH, Mannheim, Germany)에 장착하여 HIV RNA를 추출하였다. HIV-1 env 유전자의 V3 domain 부위의 RNA를 역전사 반응을 거쳐 증폭 하기 위해 Lee 및 Oh 등의 방법에 따라 PTC-200 (BIO-RAD, USA) system을 사용하여 nested PCR

을 실시하였다.^3,4) HIV-1 nested PCR에는 HIV-F1 (5'-CACAGTACAATGTACACATG-3'), HIV-R1 (5'- CAGTAGAAAAATTCCCCTC-3')와 HIV-F2 (5'- GCTGTTRAATGGCAGTCTAGCAGAAG-3'), HIV- R2 (=3'C2V3) (5'-ATTTCTGGGTCCCCTCCTGA- GG-3')를 사용하였고, LabChip system (Caliper Lifesciences, USA)을 이용하여 HIV-1 RNA의 증 폭산물인 336 bp를 확인하였다.

5) HIV-1 subtype 분석

Individual nested PCR 결과 증폭이 확인된 PCR

산물 5 uL에 ExoSAP-IT enzyme (USB Products, Affymetrix, Inc., Cleveland, USA) 1 unit을 처리하 여 37^oC에서 15분간 반응시켜 잔여 dNTP와 pri- mers를 제거한 후, 80^oC에서 15분간 반응하여 ExoSAP-IT를 불활성화시켜 sequencing PCR의 template로 사용하였다. Sequencing PCR 반응액은 정제된 PCR 증폭산물을 template로 하여 BigDye Ready Reaction Mix (ABI) 8 uL와 3.2 pmole primer 0.2 uL와 nuclease free water를 첨가하여 총 부피 가 20 uL가 되도록 하였다. Sequencing PCR의 반 응조건은 96^oC 10초, 50^oC 5초, 60^oC 4분으로 하여 25 cycles을 반복하였다. Sequencing PCR이 완료 된 반응산물은 BigDye XTerminator Purification Kit (ABI, CA, USA)를 사용하여 정제하였으며, 최종 정제산물 10 uL에 대한 염기서열 분석은 Genetic Analyzer 3130 (ABI, CA, USA)에서 실시 하였다. Direct sequencing 결과 산출된 nucleotide sequence를 NCBI에서 BLAST search하여 HIV 유 전자의 증폭을 확인하였다. HIV-1 유전자형 분석 은 DDBJ/GenBank (http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-e.

html)의 CLUSTALW v1.83을 이용하였다. HIV 유 전자 증폭이 확인된 검체는 이미 알려진 subtypes 의 염기서열[A: 97CDKS10, Q23-17, 94CY017.41, SE7253, 97CDKTB48 (AF286238.1), B: WEAU1.60, K03455.1 (HXB2), 92US657.1 (U04908.1), JRFL (U63632.1), HAT-3 (M17451.1), C: 96BW05.04 (AF- 110968.1), 92BR025 (U52953.1), ETH2220 (U46016.1), D: 84ZR085, ELI (K03454.1), F: VI850 (AF- 077336.1), G: HH8793 (AF061641.1), AF084936.1, 92RU131.16 (U27445.1), 92NG083 (U88826.1), H:

VI991 (AF190127.1), VI997 (AF190128.1), 90CR- 056.1 (AF005496.1), J: SE9280 (AF082394.1), SE- 9173 (AF082395.1), O: MVP5180 (E16837.1)]과 계 통발생학적으로 비교하여 본 연구대상의 sub- types을 결정하였다. 분석은 European Bioinforma-

tics Institute (http://www.ebi. ac.uk/)의 공개프로그 램인 ClustalW2.1을 이용하였고 clustering 방법은 UPGMA (unweighted pair group method with arith- metic mean)를 사용하였다(Fig. 1).

결 과

2007년 9월부터 2010년 2월까지 총 헌혈자는 5,750,691명이었으며 이 중 HIV-1 NAT 양성은 총 110예(0.002%)이었고, HIV-1 NAT 양성 사례 중 HIV-1 잠복기(window period)를 보인 혈액은 2예 (1：2,875,345)로 나타났다.

이들의 anti-HIV 1/2 선별검사 결과의 평균 s/co ratio 값은 17.6±8.0 (mean±2SD)로 나타났다.

HIV 1/2 Western blot 검사 결과 총 90예 중 86 예(95.6%)에서 양성결과를 보였고, 4예(4.4%)에 서 보류(indeterminate, ID)결과를 보였다. HIV-1 RNA의 평균 정량 값은 1.95×10⁴±5.82×10⁴ (mean

±2SD) copies/mL이었다.

HIV-1 nested PCR 결과 총 90예 중 86예(95.6%) 에서 핵산이 증폭되었으며, 4예(4.4%)는 핵산증 폭이 일어나지 않았다. 4예에 대한 HIV-1 RNA 정량 값은 7.97×10²∼9.68×10⁴ copies/mL로 낮았 다.

HIV-1 nested PCR에서 증폭이 확인된 86예 검 체에 대하여 염기서열분석을 실시하고 DDBJ/

GenBank에서 CLUSTALW v1.83으로 alignment 하여 CLUSTALX tree로 확인한 결과 85예(98.8%) 에서 HIV subtype을 확인하였다. 나머지 1예(1.2%) 의 검체는 HIV-1 nested PCR에서 증폭 되었으나 subtype이 확인되지 않았다. 확인된 HIV-1 sub- type은 B형 82예(95.2%), A형 1예(1.2%), C형 1예 (1.2%) 그리고 G형 1예(1.2%)로 확인되었다. 국내 헌혈에서 HIV-1 A, C 그리고 G형이 확인된 것은 처음이다(Table 1, Fig. 1).

Table 1. Results of HIV-1 subtype for HIV-1 NAT positive donors HIV-1

subtype

Number of cases

Anti-HIV 1/2 EIA s/co ratio

Western blot results

HIV RNA quantitation (copies/mL)

HIV-1 nested PCR

A 1 2.31 Indeterminate* 2.82×10⁴ ＋

B 1 4.41 Indeterminate^† 7.50×10⁵ ＋

2 5.0∼10.0 Positive 2.69×10²∼≥7.50×10⁵ ＋

1 ＋

1 10.1∼15.0 Positive 4.33×10³ ＋

1 Indeterminate^‡ 2.94×10⁴

70 15.1∼20.0 Positive 4.16×10¹∼2.00×10⁵ ＋

1 16.06 Indeterminate^§ 8.01×10⁴ ＋

5 ↑20.0 Positive 8.35×10³∼2.06×10⁴ ＋

C 1 18.01 Positive 2.06×10⁴ ＋

G 1 30.08 Positive 3.99×10⁴ ＋

Unknown 1 12.4 Positive 8.33×10³ ＋

4 15∼20.0 Positive 7.97×10²∼9.68×10⁴ Not amplified

Total 90

*HIV Western blot band pattern p24 & gp160. ^†p24 & gp160, ^‡p24 & gp160, ^§p17, 24, 31 & p160.

고 찰

바이러스 유전자형은 나라별, 지역별, 인종 그 리고 감염 경로에 따라 유행하는 subtype이 다르 다. HIV는 유전학적으로 매우 다양하며 M (main), N (non-M/non-O), O (Outlier) 3 가지의 group으로 구분된다. M그룹에 속하는 HIV-1은 다시 9개의 subtype으로 구분되고, 일부 subtype은 다시 sub- subtype으로 구분된다.^5,6) 따라서 특정 지역에서 유행하는 subtype을 분석하면 HIV 감염이 유행하 게 된 경로를 추정할 수 있다. 국내 HIV 감염자의 HIV subtype은 B형으로 76.5∼95%를 차지한다.

2007년 Lee 등이 연구한 헌혈자에서의 HIV-1 subtype은 모두 B형으로 분석되었다.³⁾ 1999년 국 립보건원에서 국내 HIV-1 감염자 78예를 대상으 로 HIV-1 subtype 특성을 분석한 결과, HIV sub- type A, B, C, D, E, G가 발견되었고 이 중 subtype B형 50예(64.1%), A형 12예(15.4%), C형 3예(3.8%),

D형 2예(2.6%), E형 8예(10.3%), G형 3예(3.8%)로 주로 subtype B형이 유행하고 있었다. 이때 HIV-1 subtype A형으로 확인된 12예 중 9예는 외항 선원 으로 유럽이나 아프리카에서 성경험이 있었으며, 1예는 아프리카에서 수혈로 인해 감염되었고, 2 예는 외국에서 감염된 남편에 의해 감염된 여성 으로 모두 외국에서 유입된 감염자였다. 나머지 66예는 대부분 국내에서 동성 또는 이성 간의 성 적 접촉으로 감염된 것으로 밝혀졌다.^7-9)

본 연구를 통해 국내 헌혈자에서의 HIV-1 sub- type을 분석한 결과 연구대상의 95.2%가 HIV-1 subtype B형으로 가장 흔한 유전자형으로 나타났 고 이들의 감염경로는 이전 연구결과를 비추어 볼 때 성적 접촉에 의한 것으로 사료된다. 또한 그 동안 헌혈자에서 확인되지 않았던 HIV-1 sub- type A, C, G 형이 각 1예씩 확인되어 헌혈자의 감염 경로가 다양화 되고 있음을 시사한다. 특히, 본 연구를 통해 HIV-1 subtype A형으로 확인된 1

예는 anti-HIV 1/2 선별검사결과 s/co ratio가 2.31 로 낮은 결과 값을 보였고, HIV-1/2 Western blot 확인검사에서도 p24와 gp160 항원밴드에서만 반 응을 보여 초기 감염자로 추측되며, 국립보건원 연구결과 HIV-1 subtype A형이 모두 외국에서 유 입되어 감염된 것을 고려해 본다면 헌혈자에서 발견된 A형 1예도 외국 감염 후 국내에 유입되었 을 가능성이 있다. 일반적으로 국내에서 사용되 는 HIV 검사시약은 외국에서 제조되어 판매ㆍ사 용되는 시약이 대부분이며 이들 제품 개발 시 대 부분이 외국에서 분리된 HIV 표준주를 사용하고 있다. 본 연구에서는 이전 연구와 달리 헌혈혈액 에서 3종의 non-B strain이 밝혀졌으며 최근 여러 원인에 의한 유전적 변이로 인해 새로운 subtype 이 출현하고 recombinant들이 발견되는 등 지역에 따라 다른 HIV-1이 보고되고 있기 때문에 헌혈자 선별검사시약으로 사용하는 진단제제 개발 시 우 리의 실정에 맞는 적합한 표준주의 선정 및 특성 이 규명이 더욱 중요하리라 사료된다.¹⁰⁾ 또한, HIV-1 항체 확인검사인 Western blot 검사에서 보 류 결과를 보인 4예 중 HIV subtype이 A형으로 밝혀진 1예를 포함하여 2예는 anti-HIV 1/2 선별 검사결과 S/CO ratio가 5.0 이하로 낮은 결과를 보 였고, 2예는 S/CO ratio가 10.0∼20.0으로 비교적 높은 결과를 보이면서 HIV-1 subtype이 모두 B형 으로 밝혀져 동일한 아형에서도 감염경로에 따라 혈청학적, 면역학적으로 다른 양상을 보여 추후 HIV Western blot 검사결과에서 보류결과를 보이 는 혈액에 대하여 지속적으로 추적조사를 할 필 요가 있다고 사료된다.

본 연구결과를 토대로 지속적으로 HIV-1 NAT 검사에서 양성결과를 보이는 헌혈자에 대한 유전 자형을 분석함으로써 헌혈자의 HIV 감염 경로의 다양성과 그에 따른 헌혈자 관리를 할 수 있는 기 초 자료로 활용할 수 있을 것으로 사료된다.

요 약

배경: 바이러스의 유전적 변이형은 국가별, 지 역별, 인종, 감염 경로 등에 따라 유전자형이 다 르게 나타나는 특성을 가지고 있다. 본 연구는 2007년 9월부터 2010년 2월까지 HIV-1 NAT 선별 검사와 anti-HIV 1/2 선별검사에서 모두 양성결과 를 보인 검체에 대하여 HIV-1 subtype을 분석하고 국내 헌혈자에서의 유행주의 특성과 감염경로를 파악하여 헌혈자 관리를 위한 기초자료로 활용하 고자 하였다.

방법: HIV-1 NAT 선별검사와 anti-HIV 1/2 선 별검사에서 모두 양성인 검체 90예를 대상으로 HIV 1/2 Western blot 항체 확인검사, HIV-1 RNA 정량검사, HIV-1 nested PCR 및 HIV-1 sequencing 분석을 통해 HIV-1 subtype을 확인하였다.

결과: HIV-1 subtype은 85예(94.4%)에서 확인되 었으며 subtype B형이 82예(95.2%), A형 1예(1.2%), C형 1예(1.2%) 그리고 G형 1예(1.2%)였다. 나머 지 5예는 HIV-1 subtype이 확인되지 않았다.

결론: 헌혈자에서의 HIV-1 subtype은 B형이 우 세함을 확인하였다. 그 외에도 과거 헌혈혈액에 서는 발견되지 않았던 HIV-1 subtype A, C, G 형 이 각각 1예씩 발견된 것으로 보아 국내 헌혈자 의 HIV 감염 경로가 다양해진 것으로 예상되며, 이에 따라 국내 헌혈자에 대해 HIV-1 subtype 분 석을 위한 지속적인 연구와 헌혈자 관리가 필요 할 것으로 사료된다.

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