항응고제 혼합이 헌혈혈액 핵산증폭검사에 미치는 영향 분석
이재숙․박규은1․강재원․허광2․오덕자3․서동희
대한적십자사 중앙혈액검사센터, 혈액관리본부1, 중부혈액검사센터2, 중앙혈액원3
The Analysis of the Effect of Mixing of Anticoagulant on Nucleic Acid Amplification Tests for Donated Blood
Jae Sook Lee, Quehn Park1, Jae Won Kang, Kwang Huh2, Deok Ja Oh3, and Dong Hee Seo
Central Blood Laboratory Center, Blood Service Headquarters
1, Jungbu Blood Laboratory Center
2, Central blood center
3, The Republic of Korean Red Cross, Seoul, Korea
Background : In the process of implementing the nucleic acid amplification tests (NAT) for the blood screening, it was needed to change plain tube to EDTA tube for the sampling. Because the sample is taken from the CPDA-1 anticoagulated whole blood, the EDTA of tube could be mixed with the CPDA-1. So, we studied the effect of the mixing of two anticoagulants on the NAT.
Methods : Using HIV-1 and HCV RNA standards, we made the qualitative and quantitative test panels for the EDTA anticoagulant and the EDTA/CPDA-1 anticoagulant containing blood.
The reverse transcription-polymerase chain reaction of Roche and transcription-mediated amplification of Chiron were used for the RNA qualitative and quantitative test.
Results : On the qualitative HIV-1 and HCV RNA tests for the EDTA, CPDA-1 alone and the CPDA-1/EDTA mixture, false negative and false positive reactions were not observed. On quantitative test, viral loads were not different statistically.
Conclusions : Since there were no statistically significant differences between CPDA-1 alone and EDTA/CPDA-1 mixture in both qualitative and quantitative tests for HIV-1 and HCV RNA, it was concluded that mixing of anticoagulants, EDTA and CPDA-1, would not cause an significant effect on the NAT for the donated blood.
Key Words：Blood, Nucleic Acid Amplification Tests, Anticoagulant
교신저자：서동희
우) 138-831 서울시 노원구 상계 6동 764 대한적십자사 중앙혈액검사센터
전화：02-938-3541, FAX：02-938-9376 E-mail：[email protected]
서 론
핵산증폭검사(Nucleic Acid Amplification Tests;
NAT)란 DNA 또는 RNA를 추출, 증폭하여 그 존재 유무 를 파악하는 것으로, 질병의 유무, 유전 상태의 파악, 바이 러스 및 세균의 감염 확인 등에 이용되고 있다. 최근 헌혈 혈액의 바이러스 선별검사에도 핵산증폭검사가 사용되고 있 으며, 헌혈혈액에서의 바이러스 핵산 증폭에는 로슈사의 역
전사-중합효소연쇄반응법(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)과 카이론사의 전사 매개 증폭법 (transcription-mediated amplification, TMA)이 주로 이용되 고 있다.
헌혈혈액의 핵산증폭검사에 권장되는 혈액 검체는 혈장
이다. 대한적십자사 혈액원에서 2004년도에 사용한 항응고
제는 성분혈액 채혈 시에는 EDTA (Etylenediamine-
tetraacetic acid) 튜브(Greiner, UK)를 이용하였으며, 전혈혈
액제제 채혈 시에는 항응고액이 포함되지 않은 plain 튜브를
사용하여 CPDA-1 항응고제가 들어있는 혈액백(citrate-phos-
phate-dextrose solution with adenine, triple bag, 녹십자,
한국)에서 검체를 채취하고 있었다. 2004년 국내 핵산증폭검
사 시범실시 중, 전혈 채혈시 혈액백을 충분히 흔들어 혈액
백 내의 항응고제(CPDA-1)가 충분히 혼합된 후에 검체를 채취하여야 하는데, 항응고제의 불충분한 혼합으로 혈액이 응고되는 등의 문제로 인하여 핵산증폭검사의 혼합검체 제 조(pooling)시에 혈장 분주가 제대로 되지 않아 검사 시간이 지연되는 문제도 생겨 이에 대한 재검토가 필요하였다.
헌혈혈액의 핵산증폭검사용으로 EDTA 튜브를 사용하기 위해서는, 검체 튜브의 EDTA 와 전혈혈액의 CPDA-1이 서로 혼합될 때 발생되는 pH, 이온 강도 등의 변화로 인하 여 핵산증폭검사시 영향이 있는지를 알아보는 것이 필요해 졌다. 이에 저자들은 두 항응고제의 혼합시 로슈사의 RT-PCR법과 카이론사의 TMA법의 헌혈혈액 핵산증폭검 사에 미치는 영향과, 전혈 상에서의 viral load의 변화를 알아보고자 하였다[1-3].
재료 및 방법
1. 바이러스 표준품
바이러스 표준품은 WHO 표준품으로 NIBSC (National institute for biological standards and control)에서 구입하 여 사용하였다. HCV RNA 표준품(WHO International standard NIBSC code 96/798)은 HCV RNA와 항체양성인 사람 혈장을 HCV 음성 human cryosupernatant에 희석한 것으로 genotype 1인 바이러스다. 50,000 IU/vial의 lyophilized virus를 0.5 mL의 RNase-free 멸균증류수에 완 전히 용해시킨 후 NHP (negative human plasma, BBI, USA)에 10 배 희석하여 10,000 IU/mL의 농도로 제조하였 다.
HIV-1 RNA (WHO International standard NIB- SC code 97/656) 표준품은 HIV-1 RNA 와 p24 항원 양성인 사람의 혈장을 negative defibrinated 혈장에 희 석한 genotype B인 바이러스다. 100,000 IU/vial의 lyophilized virus를 1.0 mL의 RNase-free 멸균증류수 에 완전히 용해시킨 후 NHP에 10 배 희석하여 10,000 IU/mL의 농도로 제조하였다.
2. 검체 채취 및 항응고제 혼합 방법
CPDA-1 항응고제혈액으로는 HIV와 HCV 모두 음성인 전혈 헌혈 혈액을 사용하였다. 전혈 혈액을 8 mL 씩 소분 하였고, 소분된 8 mL의 검체에 핵산증폭검사 검출한계 3배 이상 농도의 바이러스 RNA를 첨가하였다. 즉 검체를 HIV-1/HCV 혼합으로 제조하여 혈액 최종 볼륨에 HIV는 200 IU/mL, HCV는 100 IU/mL의 RNA 농도가 되게 첨가 하였다. 이는 핵산증폭검사의 양성정도관리물질의 RNA 농 도였다. EDTA 항응고제 혈액은 60 mL 정도의 혈액을 자 원자에서 채취한 뒤, 5 mL 씩 EDTA 튜브로 옮겨 사용하 였다. 양성검체는 위의 정성 검사용 검체와 같은 방법으로 동일한 농도로 제조하였다. CPDA-1/EDTA 항응고제 혼합
혈액은 CPDA-1 혈액에 적정량의 바이러스를 혼합한 후 CPDA-1 혈액 중 4 mL 를 EDTA 튜브에 주입하여 두 항 응고제가 혼합된 검체를 제조하였다.
제조된 검체는 25
℃이하에서 최대보관기간인 3일간 보 관한 후 원심을 통해 혈장을 분리하였다. RT-PCR법에 300 μL의 혈장을, TMA 시험법에 500 μL의 혈장을 사용 하였다.
3. RT-PCR 핵산 정성검사
CPDA-1 항응고제 검체 24개, EDTA/CPDA-1 혼합검 체 24개, EDTA 항응고제 검체 6개를 대상으로 HIV-1 및 HCV 핵산 정성검사를 실시하였다. 각 항응고제 군별로 각각 4개의 음성 대조물질을 사용하였다.
RT-PCR정성 검사시 핵산추출방법으로는 Boom me- thod[4]를 사용하였다. NucliSens isolation kit와 NucliSens Lysis buffer를 사용하여 lysis 시킨 후, Cartridge에 옮기고 NucliSens Extractor (Biomeriux, Netherlands)를 이용하여 핵산을 추출하였다. 핵산의 증폭과 검출에는 Cobas Ampliscreen HCV Test version 2.0 (Roche Diagnostics, USA) 시약과 Cobas Ampliscreen HIV-1 Test version 1.5 (Roche Diagnostics, USA)시약과 Cobas Amplicor 기기를 이용하였다.
4. TMA 핵산 정성검사
CPDA-1 항응고제 검체 10개, EDTA/CPDA-1 혼합검 체 10개, EDTA항응고제 검체 4개를 대상으로 핵산 정성 검사를 실시하였다. 각 항응고제 군별로 각각 2개의 음성대 조물질을 사용하였다. TMA 핵산 정성검사에는 Procleix HIV-1/HCV Assay (Chiron, USA)를 사용하였으며 핵산유 리 및 표적 핵산 탐지에는 Target capture system (Chiron, USA)을 이용하였다. 핵산증폭 산물의 확인은 Luminometer (Chiron, USA)를 이용하여 RLU (relative light unit)값을 측정하였다.
5. 바이러스 핵산 정량검사
CPDA-1 항응고제 검체와 EDTA/CPDA-1 혼합 검체 를 대상으로 각각 24개를 검사하였다. 혈액검체 최종량에 HIV-1은 2000 IU/mL, HCV는 1000 IU/mL의 농도가 되도 록 하였다. 바이러스의 농도는 정량시약의 신뢰범위를 고려 하여 정성검사에 사용한 농도의 10배로 제조하였다.
HCV 정량은 Cobas Ampliscreen HCV Monitor Test version 2.0을 사용하였다. 100 μL의 바이러스 particle 포함 혈장을 NucliSens Lysis buffer를 사용하여 용해시키고 추 출기를 사용하여 핵산을 추출하고 추출된 핵산을 최종 1 mL로 맞추어 그 중 50 μL를 정량 PCR에 사용하였다.
HIV-1 정량은 Cobas Ampliscreen HIV-1 Monitor Test
version 1.5를 사용하였으며 RNA 추출은 시약 사용설명서
Table 1. Qualitative test results of HCV and HIV-1 RNA in RT-PCR with different anticoagulant
CPDA-1 CPDA-1+EDTA EDTA
N % positives N % positives N % positives
HCV positives 24 100% 24 100% 6 100%
HCV negatives 4 0% 4 0% 4 0%
HIV-1 positives 24 100% 24 100% 6 100%
HIV-1 negatives 4 0% 4 0% 4 0%
N= Number of tested
Table 2. Qualitative test results of HCV and HIV-1 RNA in TMA with different anticoagulant
CPDA-1 CPDA-1+EDTA EDTA
N % positives N % positives N % positives
HCV positives 10 100% 10 100% 4 100%
HCV negatives 2 0% 2 0% 2 0%
HIV-1 positives 10 100% 10 100% 4 100%
HIV-1 negatives 2 0% 2 0% 2 0%
N= Number of tested
의 ultra-sensitive method를 사용하였다. Ultra-sensitive method는 500 μL의 바이러스 particle 포함 혈장을 23,600 g 에서 한 시간 동안 원심분리하여 농축한 후 lysis 하여 isopropanol로 핵산을 침전하여, 최종 100 μL로 하여 그 중 50 μL를 정량 PCR에 사용하였다.
CPDA-1 항응고제군과 EDTA/CPDA-1 혼합 검체군에 서의 바이러스 핵산 정량검사 결과는 엑셀 프로그램의 t-test 통계함수를 이용하여 비교하였다.
결 과
1. RT-PCR 핵산 정성검사 결과
HCV 검사 대상 검체를 8개씩 3회 반복하여 검사를 실 시한 결과, CPDA-1과 EDTA, CPDA-1/EDTA 혼합 양 성 검체 54개 모두가 양성 결과를 보였고, 12개의 음성 검 체도 모두 음성을 보였다(Table 1). 위음성이나 위양성 결 과는 관찰되지 않았다. HIV 검사에서도 54개의 양성 검체 가 모두 양성으로 검출되었으며, 12개의 음성 검체도 모두 음성 결과를 보였다(Table 1). 결과적으로 RT-PCR 검사 에서 CPDA-1과 EDTA의 항응고제 혼합은 CPDA-1이나 EDTA 단독 사용시와 동일한 정성 검사 결과를 보였다.
2. TMA 핵산 정성검사 결과
HCV 검사 대상 검체를 2회 반복하여 검사를 실시한 결 과, 24개의 양성 검체는 모두 양성 결과를 보였고, 6개의 음성 검체도 모두 음성을 보였다. 위음성이나 위양성 결과 는 관찰되지 않았다(Table 2). HIV 검사에서도 CPDA-1 과 EDTA 항응고제 단독, CPDA-1/EDTA 혼합 모두 양
성 검체는 모두 양성을, 음성 검체는 모두 음성을 보였다.
위음성이나 위양성 결과는 관찰되지 않았다(Table 2). 결 과적으로 TMA 정성검사에서 CPDA-1과 EDTA의 항응고 제 혼합은 CPDA-1이나 EDTA 단독 사용시와 동일한 정 성 검사 결과를 보였다.
3. 바이러스 핵산 정량검사 결과
HIV-1 RNA 2000 IU/mL을 포함한 CPDA-1 항응고제 검체와 CPDA-1/EDTA 혼합 항응고제 검체를 정량한 결과 는 Fig. 1과 같았다. 사용한 HIV-1 표준품은 IU단위로 되어 있으며 정량에 사용한 Cobas Ampliscreen HIV-1 Monitor Test 시약의 결과는 RNA copy로 결과가 산출되게 되어 있 다. 정량한 결과로 추정할 때 HIV의 경우 1 copy가 1.5~2 IU에 해당되었다. HIV-1 각 검체를 개별 정량하여 RNA level 을 log 로 전환하여 비교하였을 때, CPDA-1 단독 항 응고제와 CPDA-1/EDTA 혼합 항응고제 각각의 평균치는 3.026과 2.995이었으며, 표준편차는 0.095와 0.082이며 Coefficient variation (CV)은 21%와 19%였다. 각 항응고제 군 간의 HIV RNA 정량결과는 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다(P=0.72).
HCV RNA 1000 IU/mL을 포함한 CPDA-1 항응고제
군과 CPDA-1/EDTA 혼합 항응고제군을 정량한 결과는
Fig. 2와 같았다. HCV 각 검체를 개별 정량하여 RNA
level을 log로 전환하여 비교하였을 때, CPDA-1 단독 항
응고제와 CPDA-1/EDTA 혼합 항응고제 각각의 평균치는
3.367과 3.396이며 표준편차는 0.147과 0.130이며 CV
는 32%와 29%였다. 항응고제의 혼합군과 각 항응고제군
의 바이러스 HCV RNA 정량결과를 비교했을 때 통계적으
Fig. 1. Comparative results of HIV-1 RNA level in plasma collected with CPDA-1, CPDA-1/EDTA anti- coagulants.
Fig. 2. Comparative results of HCV RNA level in plasma collected with CPDA-1, CPDA-1/EDTA anticoagulants.
로 유의한 차이가 없었다(P=0.47).
고 찰
혈장내의 바이러스 RNA 농도에 영향을 주는 요인으로는 채혈시 사용되는 항응고제[5-7], 혈액 처리 시간, 혈장을 얼리는데 소요된 시간, 측정법 등이 알려져 있다[8-11].
바이러스 RNA는 전혈상에서는 불안정하며 혈청보다 혈장 상태에서 보다 안정하다는 것과 PCR based viral load assay에서는 헤파린이나 ACD 같은 항응고제보다 EDTA 가 더 좋다고 보고되어있다[5,8]. 따라서 대한적십자사에서 는 헌혈혈액의 핵산증폭검사용 검체로 전혈 혈액제제의 검 체를 기존의 Plain 튜브 대신 EDTA 튜브에 받는 것이 최 선이라 판단하였는데, 이 경우 전혈 혈액백 속의 CPDA-1 항응고제와 검체튜브 속의 EDTA 항응고제의 혼합이 문제 가 되었다. 여기에 대해서 핵산증폭검사 시약 제조사에서는 각각의 항응고제에 대해서는 검사결과를 보증하지만, 항응 고제가 혼합된 경우에는 자료가 없어 검사결과를 보증할 수 없다는 입장이었다.
본 연구에서 혈액 검체의 항응고제를 달리하여 RT-PCR 과 TMA법으로 바이러스 핵산을 정성 검사한 결과, HCV-1 100 IU/mL와 HIV 200 IU/mL의 양성 검체를 CPDA-1 단 독, EDTA 단독, 그리고 CPDA-1/EDTA 혼합 모두 100%
양성으로 검출하였으며 음성 검체도 100% 음성으로 검출하 였다. 검사상 위음성이나 위양성 결과는 관찰되지 않았다.
CPDA-1과 CPDA-1/EDTA 혼합시의 HCV와 HIV 바이러 스 핵산 정량 비교분석 결과도 통계적으로 유의한 차이를
보이지 않았다. 따라서 헌혈혈액의 바이러스 검출에 항응고 제 혼합으로 인한 영향은 없는 것으로 판단되었다. 결론적 으로 항응고제의 혼합으로 유발될 수 있는 pH, 이온 강도의 변화는 핵산의 정성, 정량 실험에 유의한 차이를 보이지 않 으며, 항응고제가 혼합되어도 전혈상의 viral load에 영향을 미치지 않는 것으로 보인다.
Grant 등[12]은 전혈 상에서 EDTA 단독 사용시와 EDTA/CPDA-1 혼합 사용시 25
℃이하에서 5일까지 HCV RNA level에 유의한 손실이 없다고 보고하고 있다.
따라서 혈액상에서 항응고제 CPDA-1과 EDTA의 혼합은 바이러스 입자나 RNA level에 영향을 미치지 않아 헌혈혈 액의 핵산증폭검사에 문제가 없을 것으로 판단된다. 하지 만, 시약회사의 권고사항이나 시약사용 설명서에 단일 종류 의 항응고제 사용 시에만 검증이 되어 있으며, 바이러스 양 성자 혈액을 CPDA-1이 혼합되어 있는 전혈백에서 채취한 검체와 직접 EDTA 튜브로 채취한 검체에서 바이러스 RNA level을 정량한 결과 CPDA-1의 liquid formation 으로 인한 희석 효과로 인하여 14%에 해당하는 viral load의 감소를 보인다는 보고가 있다[6]. 또한, Jennings 등[13]에 의하면 바이러스 RNA에 관련된 모든 검사에 사 용하는 항응고제에 대해서는 가능한 한 하나로 통일하는 것 이 바람직하며, 모든 virology assay에 사용하는 전혈에 대해서는 EDTA 항응고제 사용을 권하고 있다.
본 연구 결과를 토대로 대한적십자사는 전혈의 핵산증폭
검사용 검체 튜브를 2004년도 도입시에 계획하였던 plain
튜브에서 EDTA 튜브로 전환하여 현재 사용하고 있다. 향
후 적정한 채혈 및 혈액선별검사를 위해 채혈관 부착 혈액
백이나 샘플링용 백이 달린 혈액백의 도입이 필요하다고 본 다.
요 약
배경: 헌혈혈액에 대한 핵산증폭검사를 도입하는 과정에 서 전혈에서 검체채혈시 기존의 plain 튜브에서 EDTA 튜 브로 전환이 필요하게 되었다. 전혈 혈액백에서 EDTA 튜 브로 검체를 채취시 혈액백 속의 CPDA-1항응고제가 혼입 되므로, 두 항응고제의 혼합이 핵산증폭검사에 미치는 영향 을 알아보고자 하였다.
방법: HIV-1과 HCV 바이러스 RNA 표준품을 이용하 여 EDTA 항응고제 사용 전혈과 EDTA/CPDA-1 항응고 제 혼합의 전혈에 검출한계 이상의 농도를 혼합하여 정성용 및 정량용 검사 패널을 제작하였다. 로슈사의 역전사-중합 효소연쇄반응과 카이론사의 transcription-mediated amplification 법으로 핵산 정성 및 정량 검사를 실시하였 다.
결과: HIV-1과 HCV 바이러스에 대한 핵산 정성검사에 서 EDTA, CPDA-1 항응고제 단독과 EDTA/CPDA-1 항응고제 혼합시 모두에서 양성검체는 모두 양성결과를, 음 성검체는 모두 음성결과를 보였으며 위음성이나 위양성 결 과는 관찰되지 않았다. 핵산 정량검사에서도 통계적으로 유 의한 차이를 보이지 않았다.
결론: EDTA와 CPDA-1 혼합시의 HCV, HIV 각 바 이러스 정성 및 정량 비교분석 결과, 통계적으로 유의한 차 이를 보이지 않아, 헌혈혈액의 핵산증폭검사시 항응고제 혼 합으로 인한 영향은 없는 것으로 판단된다.
감 사
실험에 사용된 혈액을 제공해주신 중앙혈액검사센터 신 종관 선생님께 감사드립니다.
참고문헌
