Effect of Hot-water Extracts from Laminaria japonicus on Melanin Production in B16 Melanoma Cells

약학회 지 제 48 권 제

6

호 374-378 (2004)

Yakhak Hoeji

Vol. 48, No.

6

稱學舍확

B 1 6 M e l a n o m a 세 포 에 서 다 시 마 열 수 추 출 물 이 멜 라 닌 생 성 에 미 치 는 영 향

박 연 종 • 윤 미 연 • 임혜원 • 이지윤 • 김창종 • 심상수 #

중앙대학교 약학대학

(Received November 22，2004; Revised December 2, 2004)

Effects of Hot-water Extracts from Laminaria japonicus on Melanin Production in B16 Melanoma Cells

Yeon Jong Park, M i Yun Yoon, H ye W on Lim , Ji Yun Lee, Chang Jong K im and Sang Soo Sim #

College o f Pharmacy, Chung-Ang University, 221 Huksuk-dong，Dongjak-gu, Seoul 156-756, Korea

A b s tra c t

ᅳ

To investigate the whitening activity of Lam inaria japonicus，we measured the effect of hot-water extracts on

melanin production in B16 melanoma cells. Melanocyte stimulating hormone (MSH, 1 |iM)-stimulated melanin production in B16 melanoma cells was significantly inhibited by fucoidan and hot-water extracts, but not by alginate. The purified tyro­

sinase activity was not affected by hot-water extracts, alginate and fucoidan. However, tyrosinase expression was sig­

nificantly inhibited by fucoidan and hot-water extract in Western blot. These results suggest that inhibitory mechanism of hot-water extracts on melanin production may be due to the inhibition of tyrosinase expression but not to direct inhibition of tyrosinase, such an effect of which may be dependent on fucoidan.

K e y w o rd s □ Lam inaria japonicus， alginate, fucoidan, melanin, tyrosinase

다시마는 갈조 식물에 속하는

2 〜 3

년생의 해조류로서 곤포 또 는 해태라고 하며，잎은 황갈색의 띠 모양으로 폭이

25〜 40 cm

길이는

1.5~ 3.5 m

로 큰 편이며 줄기는 짧은 원주상으로 곧게 서 고 바위에 붙어산다. 다시마는 종류에 따라 약간 차이가 있으나，

대체로 수분

16%

• 단백질

7%

• 지방질

1.5%

• 탄수화물

49% •

무기질

26.5%

정도를 함유한다. 탄수화물 중

5 ~ 1 0 %

는 섬유소 인데 나머지는 알긴산을 주체로 한

lam inaran

과

fucoidan

같은 다

이다.

다시마 열수추출물은 다양한 약리작용이 있다는 것이 보고되 고 있다. 당뇨 환자에서 혈당의 감소와 insulin 분비가 정상적으 로 이루어지며 , 당대사와 관련된 glucokinase와 hexokinase를 활 성화 시키는 것으로 나타났다.1} 한편 다시마 섭취가 대장염 발 생을 감소시킨다는 보고와2} 다시마 추출물이 충치균에 대한 항 균활성이 있다는 것이 보고되었다.3) 이와 같이 다시마는 성인병 예방, 다미어트, 변비해소, 각질제거들이 알려져 있으며,4) 이중 식이섬유 alginate와 아미노산의 일종인 laminaran이라는 성분이

#본 논문에 관한 문의는 저자에게로 (전화) 02-820-5615 (팩스) 02-816-7338 (E-mail) [email protected]

성인병 예방에 작용하는 주요 구성 물질로 알려져 있다. 특히 다 시마의 조탄수화물에 포함되어진 alginate, fucoidan, laminaran 의 함량비는 각각 10.3-11.6%, 5.9~7.2%, 13.5-21.5% 이루고 있다. 다시마에 함유되어 있는 조탄수화물의 alginate와，fucoidan 은 갈조류의 점질다당류로，laminaran은 저장다당류로 분류되는 데 묽은 산이나 염기 혹은 열수로 추출되는 이들 수용성 다당류 들은 식이섬유로서의 정장작용, 중금속의 배출 및 콜레스테롤의 혈관 침착 방지 등의 효과 뿐만 아니라,5귀 항혈액응고, 항종양 및 항바이러스 작용이 있다는 것이 보고되었다.8’9)

피부색을 결정하는 3대 요소로서 헤모글로빈, 카로틴, melanin 이 있는데 그 중에서도 melanin의 양에 따라 인간은 흑인과 백 인, 황인으로 구분되며 따라서 melanin은 사람의 피부색을 결정 하는 가장 큰 인자이다. melanin은 자연계에 널리 분포하는 페 놀류의 고분자 물질로 검은 색소와 단백질의 복합체로서 melanocyte에서 tyrosine0-로■부터 생합성된다. 멜라닌 생합성 경 로에서 tyrosinase에 의해 DOPA로 전환되고 다시 DOPA oxidase에 의해 DOPA quinone으로 전환되어 최종적으로 melanin이 된다. 최근 미백제 개발에 있어서 tyrosinase 활성을 억제하는 물질의 탐색은 중요한 요소가 되고 있다.10)

위와 같이 다시마는 생체 내에서 다양한 약리작용이 보고되고

374

멜리닌 생성에 미치는 다시마 열수추출물의 효과 375

있으며 피부 보습과 화상환자에 있어서 피부 보호제로서 사용되 고 있으나 미백효과에 대한 보고는 없는 실정이다. 그러므로 이 논문에서는 다시마(Lawfworia 로부터 얻은 열수주출 물의 미백작용 기전을 규명하기 위하여

B16 m e lanom a cells

에 서

m elanin

생성과

tyrosinase

활성 및 발현을 관찰하였다.

실험 방법

재료

a-Melanocyte stim ulating horm one, tyrosinase, L-DOPA, melanin, alginate, fucoidan

은

Sigm a Chem ical C o S

■부터 구입 하였으며

tyrosinase

항체는

Santa C ruz B iotechnology(U SA)

로 부터 구입하였다.

다시마 열수추출물 분리

다시마로부터

N ishide

등이

(1988)

확립한 방법으로 다시마 추 출물을 분리하였다.11) 다시마

^{2 0}

g l： 작은 조각으로(lx

¹ cm )

세 절하고

3.7% form aldehyde

용액

200 m *

가하여

30oC

에서

12

시간 이상 방치하였다. 증류수

400 m/

를 가하며

100oC

에서

4

시 간 진탕하였다.

nylon cloth

과

Celite 545 la y e r#

이용하여 여과 한 후 전체 부피가

1/4

이 되도록 농축하였다.

ethanol

을 최종

80%

농도로 조절하여 침전물을 얻고

ethan

이과

acetone

으로 침 전물 을 세척하였다. 침전물을

30oC

에서 공기 건조시킨 후 이를 증류 수에 녹여 열수추출물

(Hot-water extracts)

로 사용하였다-

세포 배양

B16 m elanom a

세포는

10% fetal bovine serum

과

penicillin/

sfreptomysin(100 IU/50 ^g/m /)

을 함유한

Dulbecco's modified Eagle's m e d iu m (D M E M )

용액으로

37°C

로 유지되는

5% C 02

배양기에서 배양하였다 .

B16

세포를 이용한

m elanin

측정시 phenol red가 없는 D M E M i： 사용하였다.

6

well plate에

5

x 10

4

cells/mZ로 분주하고

1 2

시간이 지난 뒤 세포가 plate에 완전히 부 착된 것을 확인한 후 시약을

1 0

분간 전처치하였다 .

m elanin

생 성을 촉진하기 위하여

1

(xM cc-melanocyte stimulating hormone (MSH)를 처치하고 72시간 지난 뒤에 melanin을 정량하였다.

항산화 활성 측정

96 w ell plate

에 에탄올에 녹인

0.1 m M D P P H

용액

180

와 각 농도별로 조제한 열수추출물과

alginate, fucoidan 2 0 n/

를 가 하고

37°C

에서

30

분간 배양한 후

F L 600 spectrofluorom etei

를 이용하여

517 ran

에서 흡광도를 측정하였다.

T yrosinase 활성 측정

B16

세포에 약물 처치 후 배양이 끝나면

l% (w /v ) Triton X-

100을 함유한 10 m M phosphate buffer(pH

6

.

8

)를 100 (i/를 가 하고 5분•간 shaking 한 후에 세포와 용액을 모두 eppendorf tube 로 이전시키고 원심분리하여 상충액은 tyrosinase 활성과 단백질 정량에 이용하고，cell pellet은 멜라닌 정량에 사용하였다. 96 well plate에 약물 처치 후 얻은 상층액 40 p/를 분주하고 0.1 M sodium phosphate buffer(pH 7.2) 에 녹인 2 mg/m/ L-DOPA 200 n/를 가하여 37°C에서 1시간 동안 배양하였다. Tyrosinase 에 의해 생성된 DOPA chrome은 475nm에서 흡광도를 측정하 였다.12) 순수하게 정제된 tyrosinase를 貢个 활성의 표준 검량선 으로 이용하여 산출하였다. Bovine album ini： 표준 용액으로 하 여 상층액 내의 단백질 양을 정량하였으며, tyrosinase 효소 활 성은 unit/mg protein0.?. 표기하였다.

M elanin 정량

Tyrosinase 활성을 즉정하는 과정에서 얻은 pellet을 1N NaOH 100 야와 증류수 200 n ® 가하고 60oD 에서 1시간 배양하 여 멜라닌을 완전히 녹인 후 96 well plate에 200 nl를 옮긴 후 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 표준물질로 얻은 검량 선을 이용하며 각 well에서 생성된 멜라닌 양을 산출하였다. 멜 라닌 생성량은 각 well에서 측정한 단백질 농도를 기준으로 |ag/

mg protein으로 표기하였다.

T yro sin ase im m unoblot

M S H

를

72

시간 처치한

B16 m e lanom a c e ll

을

extracting b u ffe r(l% Triton X-100

을 함유한

0.1 M s o d iu m phosphate

buffer, pH

6

.

8

)를 가하며 세포를 파괴시키고 얻은 균질액을

8

~ 20% gradient SDS-PAGE를 이용히여 전기영동하고 nitrocellulose membrane으로 이전시켰다. 1% BSA를 함유한 Tris 완충용액에 서

30

분

■

이상 배양한 후

tyrosinase

항체와

alkaline phosphatase

가 결합된 항체를 가한 早

alkaline

phosphatase 기질 용액을 가 하여 발색시켰다 .

자료 분석 및 통계적 검정

실험 결과는 평균土표준오차로 표기하였으며，실험 성적은 non- paired Student's

t

test로 검정하였고 P 값이 5% 미만일 때 통 계적으로 유의하다고 간주하였다.

실험 결과

다시마 열수추출물의 항산화 작용

열수추출물이 항신:화 작■용이 있는 지를 확인하기 위하여 DPPH

를 이용한 유리 라디칼 소거 반■응을 관찰하였다. Table I에서 보

다시피 항산화 작용이 강한 ascorbic acid는 농도 의존적으로 항

산화 直과를 나타내고 있지만 열수추출물, alginate 및 fucoidan

376 박연종 • 윤미연 • 임혜원 • 이지윤 • 김칭종 • 심싱수

2 . 0

1.5 -

1 . 0

0.5

X

*

0 . 0

Control MSH ASC 1 0 1 0 0 Control MSH ASC 1 0 1 0 0

Alginate (

나

g/ml) Alginate (jig/ml)

Fig. 2 - Effects of alginate on tyrosinase activity and melanin production in 1 [iM MSH-stimulated B16 melanoma cells. The cells were incubated with 100 |iM ascorbic acid (ASC) and alginate, and then stimulated with 1 jiM M SH. Results are means ±SD from 4 separate experiments. *Significantly different from M SH alone (/)<0.05).

0 . 0

Control MSH ASC 1 0 1 0 0 Control MSH ASC 1 0____1 0 0

Hot-water Extract (jig/ml) Hot-water Extract (jag/rnl)

Fig. 1 - Effects of hot-water extracts on tyrosinase activity and melanin production in 1

나

M melanocyte stimulating hormone (MSH)- stimulated B16 melanoma cells. The cells were incubated with 100 jiM ascorbic acid (ASC) and hot-water extracts, and then stimulated with 1 jiM M SH. Results are means ±SD from 4 separate experiments. *Significantly different from M SH alone (/><0.05).

Table I

一

Anti-oxidant activity of hot-water extracts of Laminaria japonicus in D PP H assay

Treatments Concentrations Radical scavenging activity (% change)

Control 0

Ascorbate 100 |iM 78.9±2.8

Hot-water extracts 1 0 0 [Lg/ml 2.1±1 . 8

Alginate 100 [Lg/ml 1.7±2.4

Fucoidan 1 0 0 [ig/ml 2.8±0.7

은

D P P H

라디칼 소거에 영향을 주지 않는 것으로 보아 항산화 효과가 없는 것으로 사료된다.

B 1 6 m elan om a 세포에서 ty ro sin ase 활성과 m elanin 생성에 미치는 영향

다시마 열수추출물이 미백효과가 있는지를 알기 위하여 B16 melanoma 세포에서 melanin 생성에 미치는 영향을 관찰하였다.

melanin 생성시 rate-limiting 단계에 관여하는 tyrosinase 활성 은 안정시 0.67± 0.08 unit/mg proteinP ᅵ였으나，1)iM melanocyte stimulating hormone(MSH)로 자극한 세포에서는 1.56±0.15 unit/mg protein■ 으■로 2.3배 증가하였다. MSH에 의한 tyrosinase 활성 증가는 열수추출물와 fucoidan에 의해 농도 의존적으로 억 제되었으나 alginate는 tyrosinase 활성에 별 다른 영향을 미치지 못했다(Figs. 1，2 and 3). melanin 생성에 있어서도 MSH는 1.7 배 증가시켰다 . MSH 에 의한

m elanin

생성은

tyrosinase

활성에 서 마찬가지로 열수추출물과

fucoidan

에 의해 농도 의존적으로 억제되었으나

alginate

는

tyrosinase

활성에 별 다른 영향을 미치 지 못했다(Figs. 1，2 and 3).

정제한 tyrosin ase 활성에 미치는 다시마 열수추출물의 효과 열수주출물의 B16

m elanom a

세포에서

m elanin

생성과

tyrosinase

활성억제가

tyrosinase

에 직접적인 작용에 의한 것인

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ᅵ

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X

X

木

x

0 0

80

60

40

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O30 2

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木 X

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9W (DUWI

ᄋ J

>.1

J. Pharm. Soc. Korea

멜라닌 생성에 미치는 다시마 열수추출물의 효과 377

0 . 0

Control MSH ASC 1 0 1 0 0 Control MSH ASC 1 0

____

1 0 0

Fucoidan (jig/ral)

Fig. 3 - Effects of fucoidan on tyrosinase activity and melanin production in 1 (iM MSH-stimulated B16 melanoma cells. The cells were incubated with 100 |iM ascorbic acid (ASC) and fucoidan, and then stimulated with 1 [iM M SH . Results are means ±SD from 4 separate experiments. *Significantly different from M SH alone (/><0.05).

Table I I - Effects of hot-water extracts on purified tyrosinase activity

Treatments Concentrations Tyrosinase activity (% Change)

Control ^{1 0 0}

Arbutin 1 0 0 88.2 ±1.4

Hot-water extracts 1 0 0 |ig/m/ 106.2 ±1 . 8

Alginate 1 0 0 [Lg/ml 101.7±2.4

Fucoidan ^{1 0 0} |ig/m/ 102.3±0.7

Fig. 4에서 보다시피 MSH에 의해 tyrosinase 활성이 증가된 것 과 마찬가지로 M SH에 의한 tyrosinase의 발현이 증가된 것을 볼 수 있다. fucoidan과 열수추출물은 MSH에 의한 band보다 약 하게 나타나는 것으로 보아 M SH에 의한 tyrosinase 발현을 억 제하는 것으로 사료된다.

고 찰

지를 규명하기 위하여 정제한 tyrosinase와 열수추출물을 배양한 후 tyrosinase 활성을 측정 하였다. 열수추출물과 alginate 및 fucoidan은 DOPA chrome 생성에 영향을 주지 않는 것으로 보 아(Table II)，tyrosinase에 직접적인 작용을 하지 않는 것으로 생 각된다.

T yrosinase 발현에 미치는 영향

열수주출물에 의한 tyrosinase 활성 및 melanin 생성억제가 B16 melanoma 세포에서 tyrosinase 발현과의 연관성을 알아보 기 위하여 tyrosinase 항체를 이용한 immunoblot을 수행하였다.

1 2

4 5

Tyrosinase

Fig. 4 - Immunoblot of tyrosinase in MSH-stimulated B16 melanoma cells. B16 cells were treated for 48 hr with distilled water (lane 1), 1 |xM M S H (lane 2)，100 |ig/m/ alginate plus 1 |iM M SH (lane 3)，100 fig/m/ fucoidan plus 1 fxM M S H (lane 4) and 100 |ig/m/ hot-water extracts plus 1 jjM M S H (lane 5).

Total protein (20 |ig) was electrophoresed in a 8 —20%

gradient SDS-PAGE gel and transferred to a nitrocellulose membrane. Specific detection of tyrosinase was performed with the polyclonal antibody against tyrosinase. Similar results were observed in three independent experiments.

다시마는 성인병 예방 및 다이어트 식품，변비 해소 및 각질제 거 , 진정 효과 등이 보고되고 있으며 콜레스테롤의 혈관 침착 방 지 같은 효과뿐만 아니라 항혈액 응고성, 항종양 활성 및 항바이 러스 활성 등이 보고되고 있다.8’9) 그러나 지금까지 미백 효과에 대한 보고는 거의 없는 실정이다. 이 실험에서는 다시마의 열수 추출물의 미백 기전을 알아보았으며, 다시마 성분 중 주성분인 alginate와 fucoidan의 효과를 열수주줄물의 효과와 비교 분석하 여 미백 성분을 간접적으로 규명하고자 하였다.

열수추출물이 항산화 작용이 있는지를 일마보기 위하여 DPPH 를 이용한 유리라디칼 소거 반응을 관찰한 결과 열수추출물이나 alginate 및 fiicoidan은 항산화 효과가 없는 것으로 사료된다.

다시마 열수추출물이 미백효과가 있는지를 알기 위하여 B16 melanoma 세포에서 melanin 생성에 미치는 영향을 관찰하 였다. melanin을 생성하는 B16 melanoma 세포에서 M SH 는 tyrosinase 활성 및 melanin 생성을 증가시켰다. M SH 에 의한 tyrosinase 활성과 melanin 생성 증가에 있어서 열수주출물은 농 도 의존적으로 억제시켰다. 한편 fucoidan도 M SH 에 의한 tyrosinase 활성과 melanin 생성 증가를 농도 의존적으로 억제하 였으나 alginate는 tyrosinase 활성에 별다른 영향을 미치지 못했 다. 이러한 결과로 미루어 볼 때 열수추출물이 B16 melanoma 세포에서 MSH에 의한 tyrosinase 활성 및 melanin 생성을 억제

*

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*

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378 박?!종 • 윤미연 • 임혜원

■

이지윤 . 김칭종 • 심상수

하는 것으로 보아 미백제로서의 개발

7 1

능성을 제시할 수 있으 며，이러한 미백 효과는 다시마 성분중 fucoidan이 관여하는 것 으로 생각된다.

다시마 열수추출물의 미백효과 기전을 규명하기 위하여 단일 분리 정제한 tyrosinase와 반응시켜 L-DOPA가 DOPA chrome 으로 전환되는 양을 측정하였다.12) Tyrosinase 억제제로 알려진 arbutin은 tyrosinase의 기질 결합 부위 (L-tyrosine 훅은 L- DOPA)에 경쟁적 억제제로서 작용하는 것으로 알려져 있다.13) Arbutin(100 |iM)은 tyrosinase 활성을 억제하였지만, 열수추출물 과 alginate 및 fucoidan은 DOPA chrome 생성에 영향을 주지 않은 것으로 보아 tyrosinase에 직접적인 작용을 하지 않는 것으 로 사료된다.

다시마의 열수추출물이 B16 melanoma 세포에서 M SH에 의 한 tyrosinase 활성과 melanin 생성을 억제하는데 이러한 현상 이 tyrosinase 발현 억제와 연관성이 있는지를 알기 위하여 tyrosinase 항체를 이용하여 세포내 tyrosinase 양을 관찰하였다.

MSH는 대조군에 비하여 tyrosinase 발현을 중가시키는 것을 볼 수 있다. fucoidan과 열수추출물은 MSH에 의한 band보다 약하 게 나타나는 것으로 보아 MSH에 의한 tyrosinase 발현을 억제 하는 것으로 사료된다. 이러한 결과로 미루어 볼 때 열수추출물 이 melanin 생성을 억제하는 미백 작용은 tyrosinase 발현과 활 성 억제를 통하여 작용하는 것으로 사료된다.

결 론

L a m in a ria

yfl/wm'cws로부터 얻은 열수주출물이 미백작용기전 을 규명하기 위하여 B16 melanoma cells에서 melanin 생성과 tyrosinase 활성에 미치는 영향을 관찰하였다. DPPH를 이용한 항산화 assay에 있어서 alginate과 fucoidan 및 다시마 열수추 출물 자체는 항산화작용이 없는 것으로 나타났다 . B16 melanoma 세포에서 M SHXl^iM )에 의한 tyrosinase 활성과 melanin 생성 증가는 다시마 열수추출물과 fucoidan에 의해 유 의하게 억제되었으나 alginate는 별 다른 영향을 주지 않았다.

정제한 tyrosinase 활성에 열수주줄물과 alginate 및 fucoidan은 직접적.0■로 영향을 주지 않았으나，Western blot에서 fucoidan 과 열수추출물은 tyrosinase 발현을 억제하였다. 이러한 결과로 미루어 볼 때 다시마 열수추출물의 미백작용은 tyrosinase의 활 성을 직접 억제하는 것이 아니라 tyrosinase 발현을 억제하는 것에 기인되는 것으로 생각된다. 열수추출물의 미백 효과는 다 시마 추출물에 함유된 fucoidan과 연관성이 있음을 보여준다.

이상의 모든 결과를 종합하며 볼 때 다시마 열수추출물은 미백 제로서 개발 가능성이 있는 것으로 생각되며，이러한 미백작용 을 나타내는 주요 성분으로는 fucoidan이 관여하는 것으로 사 료된다.

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