Body Distribution of 125I-rhEGF Across Normal and Damaged Rat Skins

약학희지 제41권 제 6 호 730-^736(1997) Yakhak Hoeji Vol. 41. No. 6

정상 및 손상된 환쥐 퍼부에 국소 적용된

*"®I-rhEGF

이정욱 • 정석재 ■이민화 ■심창구*

서 울 대 학 교 약 학 대 학

(R e c e iv e d A u g u s t 22. 1997)

Body Distribution of 오요카-rhEGF Across Normal and Damaged Rat Skins

Jeong-Uk Lee, Suk-Jae Chung, Min-Hwa Lee and Chang-Koo Shim*

College o f P harm acy, S eou l N a tio n a l U niversity, Seoul, 151-742, Korea

Abstract— Distribution of radioactivity in the skin tissues, subcutaneous tissues, blood and body organs was examined following topical application of *적-rhEGF (0.4 M-Ci), in the form of a Pluronic F-127 gel. on the normal and damaged (burned and stripped) skins of SD male rats. The radioactivity in the skin tissues and subcutaneous tissues was 3-5 times higher for the damaged skins than for the nor­

m al skin. But pretreatment of the skin with rhEGF (1 나g) twice at 24 hr dose intervals affected the dis­

tribution of the radioactivity yielding the order of burned skin > stripped skin= normal skin. The de­

crease for the stripped skin by the pretreatment might be related either to the pathophysiological change of the skin or to the down regulation of the EGF receptor. Liver showed the highest radioactivity in am ount following sin^e and multiple administration of the drug to the normal and damaged skins. But. in concentration, the kidney and stomach showed higher value than the liver which is consistent with that kidney is a major eliminating organ of EGF and that EGF exerts its phar­

macological effect specifically for the stomach.

Keywords □ Epidermal growth factor (EGF). single dose, multiple dose, burned skin, stripped skin, radioactivity, organ distribution.

언간상피세포 성장인자

(hum an epidermal grow­

th factor. h E G F

cytokine

53

in

.

in U/W

."

E G F

.

E G F

• 본 논문에 관한 문의는 이 저자에 게로 ( 전화) 02-880-7873 {팩스) 02-885-8429

된것이비교적적으며특히피부국소적용후의체내동 태에대하여는전혀보고가없는실정이다

.

E G F

,

E G F

.

.

E G F

E G F

.

따라서 이연구에서는 유전자재조합기법으로생산 된사람

E G F (rh E G F

rh E G F

정상 및 손상된 흰쥐 피부에 국소 적용된 *^-rhEGF의 체내 이행

이 행성을 검토하였다. 이를 위하여 흰쥐의 등 피부에 유 발한 화상 및 창상에 로 표지 된 rhEGF (*^1- rhEGF)를 국소에 적용한 후 , 체내 각 조직으로의 방사 활성의 이행을 검토하였다. 또한 약물을 여러 번 적용하 는 것이 약물의 조직 분포에 어떠한 영향을 미처는가 알 아보기 위하여, 머러 rhEGF를 24 시간 간격으로 2회 적용한 피부에 24시간 후 "^I-rhEGF를 적용한 후 피 부 조직내 방사활성의 분포와 체내 이행을 검토하였다,

실험방법

시약

- rhE G F (대응제약, DWP401)로는 대장균에 서 생성되어 정제된 유전자 재조합 물질로서 순도는 100%(HPLC), 또는 98.15%이상(size exclusion FPLC) 인 것을 사용하였다. 이 약물외 체내동eT는 일 본 W akunaga 제약의 것과 약간의 차이를 보였으나 모두 용량 외존성을 보 였 고 ® 조 직 분포 특성®은 rat EG F*°*와 비숫하였다, 따라서 이 약물은 기존에 발표 된 문헌중의 EG F와 유사한 체내 동태를 나타내는 물 질임을 확인하였다. I*^®-rhEGF(0.2~0.4 ^C i/ng, 대 웅제약)는 순도 98% 이상의 rhEG F에 N-chloro- benzene sulfonamide외 sodium salt (Pierce, 미 국)를 이용하여 iodination 범으로 I *®표지한 후 Sephadex G-25컬럼으로 정제한 것으로, gel filtra- tion시의 순도 96%이상, 15% TCA 침전법상 순도 95% 이상인 것을 사용하였다. 기타 시약으로는 Plu- ronic F-127 (BASF Co., 득일)과 주사용 증류수 (중 외 제약) 등을 사용하였다.

퍼부 손상 모델

- 실험 동물로는 Sprague-Daw- ley계 랫트의 수컷(300±30ng)을 사용하였다. 랫트를 에텔로 마취한 뒤, 등부위외 털을 anim al clipper (Model 900, Daito Electric Mfg Co., 일본)와 면도 기를 사용하여 제거하였다. 그 후 화상피부 모델은 섭 씨 200°의 열조절기(아림전자, 서울)로 10초간 화상 (2" 화상)을 일으켜 만돌었고, 창상피부 모델은 스텐레 스제 스크래퍼(NT scraper, NT Inc., 일본)로 부분층 창상을 일으켜 만돌었다. 정상피부 모델로는 털을 제거 하는 것 이외에는 아무런 처치도 하지 않은 피부를 사 용하였다.

퍼부적용을위한제제의조제

- *^I-rhEGF의 25%

Pluronic F-127 용액(2^C i/m /) 200^/를 우레탄 foam tape(한국 3M)를 써서 만든 직경 1.4cm의 원형

틀(표면적 154 m m")에 붓고 37°C에서 30초간 두어 겔 화 시켰다. 기제로서 Pluronic F-127을 선택한 것은 이 기제중에서 hE G F의 안정성이 좋 고 , 37°C에서 2시 간에 80% 이상의 EG F가 용출되며"* 또 25% P lu ­ ronic F-127 용액은 저온에서는 액체 상태이나 37°C 정도에서는 겔화되어 일종의 페취제와 같은 성상을 띠 게 되므로 피부에 적용하기 용이하기 때문이었다.

1

- 상기한 *®I-rhEGF 제제를 우레탄 테이프 틀째로 각 모델 괴부에 붙이고 수술 테이프(한 국 3M)로 고정시켜 투여하였다. 약물 투여 0.5, 1, 2, ,5 및 8시간 경과후 에델 마취하에 복대 동맥에서 채혈하 여 (21G needle) 실혈 처사시킨 후 약물을 투여한 피부 조 직, 피하조직, 간, 신장, 버장 및 위를 적출하였다. 적 출한 조직 및 장기는 상수에 씻고 여지를 이용하여 물기 를 제7극한 뒤. 감마 카운터 (Cobra Auto-Gamma, PACKARD'*, Canberra Co., 미국)로 조직중의 방사 활성 을 측정 하였다.

다회투여실험

- 약물을 여러 번 투여하였을 때 피부 조직에 약물외 측적이 나타나는지 여부를 보기 위하여 비표지 rhEGF 제제룰 24시간 간격으로 2회 피부에 적 용한 뒤 다시 24시간 뒤에 *^I-rhEGF를 피부에 국소 적용한 후 경시 적으로 피부 조직 및 체내 장기중의 방사 활성 외 번화를 추적하였다. 즉 rhEG F의 25% PJu- ronic F-127 용액(rhEGF의 농도=5M^g/mO 200 |j7 (rhEGF로서 1 나g)로 만든 페취형 겔 제제를 24시간 간 격으로 2회 적용한 뒤 다시 24시간 뒤에 하 -rhE G F의 25% Pluronic F-127 용액 (2 nCi/m /, 5 나g/m /) 200 나 KrhEGF로서 1 나g, radioactivity로서 0,4 (xCi)를 투 여하였다. 적용 후 0.5, 1, 2, 5 및 8시간에 1회 투여 실 험시와 같은 방법으로 피부 및 각 장기를 적출하여 각 시료 조직중의 방사활성을 측정하였다.

이 실험에서 rhEG F를 3희 투여한 것은 개방 창상 및 화상에 상처 부위당 10 g 씩외 rhEG F를 24시간 간격 으로 3회 국소 적용하였을 때 유의성있는 처유 효과가 있었다는 보고들3 을 참고로 한 것이 었다.

퍼부상태의 현미경관찰

- 1회 또는 다회 약물투여 가 피부 상태에 미처는 영향을 조사하기 위하여 약물을 투여한 일정 시간 뒤 괴부 부위를 적출하여 바로 10%

PBS buffered 포르말린으로 고정한뒤 파라핀 포매하

였다가 6 nm 의 두께로 절편을 만들었다. 각 조직 절편

을 M aye/s hematoxylin과 eosin으로 염색한 다음

전자 현미경으로 관찰하였다.

실험결과 및고찰

1

- 정 상 및 손상 (화상 및 창상) 피부에 ^"l-rhEGF를 1회 적 용한 후 약물 적용 부위의 피부 조직과 피하 조직 중의 방사활성 (cpm/g)-시간 추이는 Fig. 1(A) 와 같았다. 피 부조직에 었어서는 손상된 퍼부에 투여하였을 때가 정 상 피부에 투여하였을 때 보다 약 3~5배 높은 방사활 성 농도를 보였다(윗그럼). 그러나 피하조직에 있어서 는 일반적으로 화상피부에 투여하였을 때가 가장 높은 값을 보였고 다옴으로 창상피부, 정상피부의 순이었다.

정상피부에 투여한 후외 피하조직중 방사활성 농도 추 이는 피부조직중 방사활성의 5% 미만이었으며 , 피부조 직중 농도추이보다는 오히려 혈액중 농도추이(데이터 미표시)를 반영하고 있었다, 이는 피부에 적용한 눅- rhEGF가 피부 조직에 분포된 혈관을 통해 혈액중에

Fig. 1

T in e (h r)

S ingle Dose Study M u ltip le Dose Study

(A) (B)

Concentration of radioactivity (cpm/g tissue, mean SE of three determinations) of skin (upper low) and subcutaneous tissue (lower low) after single (left A column) and multiple (right B column) topical application of '^-rhEGF pre­

paration. Applied skin area： 154 mm오 Applied dose： (A) 200 n/ of ^^-rhEGF preparation (0.4

|iCi/200 ^1/ in 25% Pluronic F-127). (B) 200 |i/ of rhEGF solution (1 ^g/200 ji/) was pretreated every 24 hr for two days and 200 M-/ of rhEGF solution (0.4 (iCi/200 M7 in 25% Pluronic F-127) was applied after 24hr. ■, □ and A ： represent normal, burned and stripped skins, respectively. * p<0.01, ** p<0.05 different from the normal skin.

이행된 투 소량의 방사활성이

피부 조적으로 이송 된 때문으로 추정된다. 이는 생체 내에 투여된 의 약 25%가 피부에 측적되었다는 보고**'와도 일치한다.

다회 투여 후 퍼부조직 및피하조직 중 약물 농도

(Fig. 1) - 약물을 여러 번 투여하였을 때 피부 조직 및 피하조직 중 방사활성의 추이는 Fig. 1(B)와 같다. 1회 투여시에 비하여 화상 및 정상 피부모델에서는 현저히 높은 피부조직(윗 그림) 및 피하조직(아랫 그림)중 방 사활성 농도를 나타냈으나 창상 피부모델에서는 오히려 낮은 농도를 나타냈다. 이는 EGF 수용체의 노출이 가 장 컸던 창상군에서 down-regulation이 현저하게 일 어나 hEG F 의 세포내 uptake가 감소하였기 때문이거 나, 다회 투여에 외해 단순히 피부 조직외 조직학적 상 태가 달라졌기 때문일 가능성이 있다. 실제로 화상 피부 에서는 다회 투여후 퍼부 조직에 삼출액이 생겼으나 창 상 피부에서는 삼출액이 보이지 않았다. 또 피부의 손상 여부에 따라 수화의 정도가 달라 약물외 이 행에 영향을 미쳤을 가능성도 배제할 수 없었다.

rhEGF

(Fig.

2) - 정상피부, 화상괴부 및 창상피부에 rhEGF를 1회 (왼쪽 칼람) 또는 다회투여 (오른쪽 칼람)하였을 때의 조직 병리학적 관찰 결과를 Fig. 2에 나타내었다. 정상 피부(Fig. 2-a)에 대해서는 1회투여 (왼쪽)와 다회투여 (바른쪽) 간에 차이 가 보이 지 않았다. 화상피부(Fig. 2- b) 에 대해서는 다회투여시 (바른쪽) 파괴되 었던 상피 및 진피 구조가 소실된 후 일부 상피 세포가 재생되기 시작 하였다. 창상피부(Fig. 2-c)에 대해서는 다희 투여시 (바른쪽) 1회 투여시(왼쪽)와 비교할 때 상피하에 염증 세포의 침윤은 아직도 존재하나 상피 분화도 좋고 상처 의 회복 양상이 보였다. 이에 따라 손상피부에 rhEGF 를 다회 투여시의 방사활성 농도추이가 1회 투여시와 달라졌을 가능성이 시사되었다.

1

(Fig. 3) - 1회 투여시 혈중 방사활성량은 화상과 창상에 의해 증가하였으며 특히 창상군에서는 1시 간에 최 고 값을 나 타내었다(데이타 머표시). 1회 투여시 각 장기중의 방 사활성 이행량을 Fig. 3(왼쪽 칼람)에 보였다. 이행량 은 모든 피부 모델에서 혈액을 제외한 모든 장기(신장, 위. 비장, 간)중 간에서 가장 많아 간 클러어런스가 EGF외 전신 클리어런

80%

차지한다는 보고*^

와 일처하였다. 그러나 각 장기중 방사활성외 농도 (Fig. 3, 바른쪽 칼람)로 검토하면 간 조직중 농도가 신

732 이정욱• 정석재• 이민화•심창구

^

^

에

i -

I

(c)

Fig. 2 — Vertical section views of normal (a), burned (b) and stripped (c) skins following single (left column) and multiple (right column) dose studies. Skin tissues were embedded in paraffin and were cut into 6 sec­

tions followed by staining with Mayer's hematoxylin and eosin. and photographed at the magnification of X63.

정상 및 손상된 흰쥐 피부에 국소 적용된 *""l-rhEGF외 체내 이행 733

' ' 어

(a)

，하

(b)

Fig.3

TiseChr)

Body distribution of radioactivity to major organ tissues expressed as percentage to dose (left column) and concentration (right column) after single topical application of

^-rhEGF pre­

paration to various skin models. Each point represents mean S.E of three determinations.

□ and ^ in the left column represent normal burned, and stripped skins, respectively, and ■

□ and A in the right cloumn represent normal burned, and stripped skins, respectively. * p<0.01

** p<0.05 different from the control (normal) skin.

Tiine(hr)

Fig. 4 — Body distribution of radioactivity to major organ tissues expressed as percentage to dose (left column) and concentration (right column) after multiple topical application of '^^-rhEGF preparation to various skin models. For others, see the legends of Fig. 3.

734 이정욱• 정석재• 이민화• 심창구

장이나위장중농도보다오히려낮았다. 신장으로외방 사활성이행량은간보다적었으나방사활성농도는높

아 E G F외겉보기조직중분포용적이간에서보다신

장에서더높은값을보인다고하는보고*®*와일처하였

다. 위장은 E G F가특이적약리작용을나타낸다고알

려져있는장기인데이조직에서의방사활성이행량은 신장과버숫하였으나조직중량당방사활성농도는관 찰된조직중가장높았다. 비장은방사활성이행량, 조 직중농도모두가장낮은값을보였다. 특기할만한사 실은창상괴부에약물을적용하였을때모든장기에서

1시간에 방사활성이 현저히 중가하였다가 2시간째에 급격히감소하는현상이었다. 이러한현상은표피가제 거되어약물과조직세포와외접촉이가장용이한창상

군에서는, 세포표면에 있는 E G F 수용체의 dow n-

r e g u la tio n이일어나세포내에서소실되는속도가느

려지기때문에조직중농도가최고치를보였다가, 약물

■F-M . »■배.설플

. w j

에계속하여노출되어수용체수가늘어남에따라약물 이소실되는속도도다시회복되어조직중농도가감소 하는것이아닌가추론할수있었다. 그러나역시조직

중방사활성만으로 r h E G F의분포를추론할수는없으

므로앞으로이에대한연구를더진행시켜야할것으로 생각되었다. 한편화상피부모델에서는화상을업은표 피가어느정도약물에 대한장벽으로작용하는지. 또 화상에외해증가하는것으로보고된단백분해효소가 약물투과외장벽으로작용하는지알수없었으므로이 에대한검토도필요할것으로생각되었다.

다회투여후장기중방사활성농도추

0|(Fig. 4) -

1회투여시와동일한장기순위를보였다. 그러나 1회투 여시에는대체로창상) 화상) 정상피부외순인데반하여 다희투여시에는화상)창상)정상괴부외순을보였다.

1

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정상 및 손상된 흰쥐 피부에 국소 적용된 *^-rhEGF의 체내 이행 735

수된제제중방사활성과제제룰떼어낸후피부틀닦아 내어회수한방사활성을뻔값)은투여량의 3 0 ~ 4 0%로 대체로창상피부)화상피부)정상괴부의 순이었으나피 부손상에따른유외적인차이는보이지않았다. 다회투 여시의 8시간동안의흡수량은다소많아져투여량의

3 0 ~ 5 0%이었고대체로창상피부)화상피부)정상피부

의순이었다. F ig . 1. 3, 4에서의유의적인차이가전신

흡수량에반영되지않은것은개체차와같은편차때문 으로생각된다.

이상외결과가곧바로 in t a c t E G F의이행을반영한

다고는생각할수없다. ® I- r h E G F가피부내에서대사

되어대사된 가 in ta c t E G F와무관하게검출되었을

가능성을배제할수없기 때문이다. '^ - r h T N F (re ­

c o m b in a n t h u m a n tu m o r necrosis factor)를생체내 에투여하였을때간. 신장등외주요장기가 의저장 고로작용하였다는보고®가이러한생각을뒷받침한다.

따라서앞으로피부조직에존재하는방사활성중어느

정도가 in ta c t E G F에기인하는것인지확인하여야할

것이다.

결 론

흰쥐의피부에손상(창상및화상)을일으킨후 *^1-

r h E G F를 1희또는다회투여한후의피부조직및피하

조직, 체내장기돌에의방사활성의 이행을비교하였다.

손상된피부에 1회투여하였을때가정상피부에 1회투

여하였을때에비하여약 3 ~ 5배의높은피부조직이행

을보였으며창상피부와화상피부간의차이는없었다.

즉 1회투여시괴부조직중방사활성농도는창상 = 화상

>정상피부의 순이었다. 그러나다회투여시 피부조직 중방사활성농도는 1회투여시에비하여정상피부의경 우는증가한데반하여 창상괴부에서는오히려감소하 여화상)창상= 정상피부외순이었다. 피하조직에 있 어서도대체로비숫한경향이었다. 창상피부에대하여 다희투여가 1회투여보다낮은피부조직및피하조직중 농도를보인것은약물의다회투여에의하여창상피부 조직의 병태생리학적상태가번화한때문일가능성이 있다. 피부상태또는투여방범에 관계없이 8시간까지 체내로이행된총방사활성량은투여량의 2 0 ~ 4 0%이 었으나혈액및각조직으로이행된방사활성량은투여

량외 0 .5 % 미만이었다. 그러나, 각장기중방사활성농

도는약물을적용한피부조직중의방사활성농도를반

영하고 있었다. 앞으로 조직중 방사활성 중 in t a c t

E G F의분율이얼마나되는지를규명하여야정확한체

내이행기전을이해할수있을것으로생각된다.

감사의 글

이실험은보건복지부연구버로수행되었습니다. 실 험에도움을주신대웅제약중앙연구소박명환부소장 님과강진석연구원께감사드립니다.

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