Effects of Chemical Anoxia Inducers on Cellular Functions of Cultured Rat Cortical Astrocytes

약학희 지 제 43 권 제 6 호 851-860(1999) Yakhak Hoeji Vol. 43, No. 6

배양된 촌!쥐 대뇌 퍼절 astrocytes ^{의 세포기농에 대한}

화학적 무산소증 유도물의 효과

이선애 • 박우규 * • 성연희 **^

충 복 대 학 교 수의 과대 학 , * 한 국 화 학 연 구 소

{Received August 31, 1999)

Effects of Chemical Anoxia Inducers on Cellular Functions of Cultured Rat Cortical Astrocytes

S u n A e L e e , W oo K y u P a rk * and Y eo n H e e S e o n g *

College of Veterinary Medicine, Chungbuk National University, Cheongju, Chungbuk

*Korea Research Institute of Chemical Technology, Taejon, Korea

Abstract — The effects of antimycin A (AA), sodium azide (NaN； ^) and 2,4-dinitrophenol (DNP), which inhibit mitochondrial ATP production, on cellular functions of cultured astrocytes were studied. High con­

centrations of AA (50 NaN3 (100 mM) and DNP (20 mM) significantly decreased 3-(4,5-dime- thylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) reduction, which was known to be related to mitochondrial function and then cell viability. AA (50 |ig/m/) increased lactate dehydrogenase (LDH) release and decreased [^H]glutamate uptake, suggesting severe damage of cellular function by the con­

centrations of the compounds. Meanwhile, low concentrations of AA ( ^ 10 |ig/m/), NaN3 ( ^ 50 mM) and DNP ( < 5 mM) significantly increased M TT reduction, the effect of which was specific to astrocytes. AA (5 and 10 fig/m/) did not affect LDH release and [^H]glutamate uptake, indicating that these compounds increased M T T reduction at the low concentrations without cellular membrane damage. However, the low concentrations of AA produced significant decrease of M T T reduction in a glucose-free medium. Low con­

centrations of A A (1 and 5 did not change ATP production of astrocytes in the medium containing 10 mM glucose, but completely inhibited in a glucose-free medium, suggesting marked increase of cyto­

solic ATP production by the blockade of mitochondrial ATP production with low concentrations of AA.

These results suggest that astrocytes have ability to enhance neuronal function or survival under con­

ditions of incomplete ischemia or early stage of ischemia by enhancement of glycolysis, and that cellular reduction of M TT occurs not only mitochondrially but also extramitochondrially.

Keywords □ Cultured astTocytcs, cellular function, chemical anoxia inducers, antimycin A, M TT reduction.

포 유 동 물 외 중추신경계는 신 경세포와 신경교세포로 구 성 되 며 , 교세포중에서 가 장 그 수 가 많은 별아교세 포 (astrocytes)는 신 경세포가 정상적인 기 능을 할 수 있도록 세포환경을 제공하는 중 요 한 역할을 한 다 . 죽 , astrocytes는 혈액뇌관문을 형성하고, 세포외 수분량 및 이 온농 도 룰 조 절 하 며 ,^'2> 각종 신경전달물질의 흡수와

* 본 논문에 관한 문의는 이 저자세게로

( 견화 ) 0431-261-2968 ( 팩스 ) 0431-267-3150

대사 기능 을 지니며,크스 voltage-dependent ion channel 과 신경전달물질 수 용 체 도 함유하식 신 경 세 포 가 작 용 하 는 데 될 요한 미세 환경구조를 제공하고 있 다 .

그 러므로 astrocytes의 기 능 손 상 은 뇌조직의 팽 창 , 세포 성 또 는 혈관성 부 중 , 이어서 뇌내압의 상 승 및 대뇌 이 탈로 마 침 내 는 뇌 순환부 견 으 로 이 어 지 는 병적 상 황 을 유발하게 된 다 .

중추신경계는 신체 중에서 매우 대^b i 이 높 은 곳이

나 저장에너지가 낮아■ , 그둘의 기능적 통 합 성 을 유지

852 이선애 ■ 박 ^ • 성연희

하기 위하여 끊임없는 산 소 와 포도당의 공급을 필요로 한 다 . 한편 생성된 에너지의 약 50%는 주 로 N a V iC - A T P a s e 에 의 한 ion transport와 ion gradient의 유지에 이용된다 7'®^ 띠라서 ischemia나 stroke과 같은 병적 상황서1서 산 소 와 포도당의 공■급어 차단되 면 세포내외의 ion gradient의 파 괴와 더불어 세포내 구성물질의 누출이 일어나는 등의 생화학적 변화 및 뇌세포의 구 조 적 , 기능적 손 상을 초 래 한 다 . 그 러 므 로 , 심 각 한 저 산 소 증 , 기 질 부 족 , 득성대시•산물의 제거기전 의 손 상 등에 의한 허혈증의 결 과 일어나는 뇌세포의 손 상 은 세포의 종 류 에 따 라 매 우 다 양 하 며 , 특히 astrocytes의 부 종 은 대뇌허혈증의 초기단계에 나타나 는 일 차 적 걸 과 로 되어 있 다 . Ast r ocyt es는 hypoglycem ia나 ischemia등 과 같은 병적 상황에 대하 여 신 경 세 포 보 다 덜 민 감 하 다 고 하 는 데 , 이 는 astrocytes가 더 많은 glycogen을 저장하고 있기 때문 이 고 , 그 결과 허혈시 neuron으로부터 다량 유리되는 glutam ate에 의 한 동분득성에도 잘 견딘다고 한 다 . 또 한 , astrocytes는 대사 장해시 신경세포의 생존력을 증가시키는데^^'페 이는 astrocytes가 lactate를■유리하 고 /^'페 세포외 glutamate의 조 절 과 세 포 외 이온 조 성의 조절능력을 가지기 때 문 이 다 그 러 나 , 또 다른 보고에 따 르 면 , ischemia시 astrocytes의 광범위한 팽 윤 (swelling)과 glutamate의 유리로 인하여 neuronal dam age를 더욱 악 화 시 킨 다 고 도 한 다 /^끄*

한 편 , 그 러한 ischemia에 의 한 세포기능의 손상기전 을 연구하기 위 하 여 , 물리적인 저산소성의 환경을 유 발 하 거 나 , 화학적 무산소증유발방법이 많이 이용되고 있 다 . 화 학 적 무 산 소 중 유 도 물 로 서 는 antimycin A (AA), sodium azideCNaNg), 2,4-dinitropheonol(DNP), sodium fluoride(NaF), sodium cyanide(NaCN)-§-°l 있 다 . 이들은 서로 다른 부위에서 서로 다른 양상으로, mitochondria에서 respiratory chain을 차 단 하 거 나 , 또 는 cytos이에서 glycolysis를 차단하여 A T P 합성을 억 제하므로서 hypoxia, hypoglycemia률 유 발 한 다 . 일반 적으로 이들 화학적 무산소증 유도물들은 단시간 처리 에 의하식 세포내외 이온조절을 방해하는 결 과 , 세포 내 N a""농 도 의 급 격 한 상 승 과 더 불 어 K+, C r , H C 03~등이 세포내로 유입되어 cell swelling이 일어난 다 . 또 한 , glutamate uptake눙력이 상 실 되 고 , 여러 가 지 효소의 활성의 번화와 더불어 세포막의 뚝합기능이 억제됨으로서 세포내 내용물의 유출에 이 은 '세 포 시 률

유발하게 된다.퍼 이에 대하여 C a ^ channel antago­

nists, nitric oxide synthase inhibitor 또는 NMDA-re- ceptor antagonist등이 이를 억제함이 보고되어 있 다 .^*

일차배양된 astrocytes에 있어서 화학적 무산소증 유 도물 을 시용하여 허혈성 세포손상외 기전에 관한 연구 를 보 면 , NaN3에 의하쉬 세포내외의 Na+ gradient의 파괴 가 일어나고, acid 및 glutamate가 유리됨이 보고 되 었 고 ,에 A A, N aN j, D N P에 의 [^H]glutamate uptake가 현저히 저하됨이 보 고 되 었 다 .2® 또 한 위의 보고에 었어서, 세포막 통합성의 상실 및 세포사를 측 정하기 위 하 여 , lactate dehydrogenase(LDH) release, trypan blue exclusion, [크 H]glutamate uptake률 지 표로서 측정 하였으며 , 또 세포손상을 일으키기 위하여 고농도의 이둘 화합물을 시용하였 으 며 , 저능도에 의한 생화학적 번화에 대하여는 보고된 바 없 다 .

한 편 , M T T assay란 , Mosmann체에 의하여 확립된 방법으로서, tetrazolium염 인 MTT(3-(4,5-dimethylthia- zol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide)가 mito­

chondria S] dehydrogenase에 의 하 여 formazan으 로 환 원되며, formazan의 생성은 세포수와 직접 비례한다 고 보 고되었다 . 그 리 하 여 , 이 방법은 mitochondria의 기능을 검토하거나, 세포증식 또 는 세포사룰 검토하는 데 시용되어 왔 다 . 그 러 나 , 이 방법에 대하쉬 널러 알 려진 것과는 달 리 , 반드시 mitochondria에 의해서만 M T T 의 환원이 일어나는 것이 아 니 라 , mitochondria 외 에서도 N ADH 및 N A D PH 의존적으로 일어나므로 respiratory chain inhibitor에 의하여 억제되지 않는다 는 보고가 있으며,2^^^ 또 , cell line에 따 라 , 또는 배양 조건에 따라서 감수성이 변화하는 등 ,2*> 이에 대한 확 실 한 기전의 규명이 요구되고 있 다 .

저 자 들 은 신생 흰쥐의 대 뇌 피 질 a stro cyte s를 일차 배양하여 저산소증에 의 한 세포손상의 기 전을 규명 하 는 과 정 에 서 , m itochondria의 aerobic resp ira­

to ry chain 만 을 억 제 하 는 A A , DNP, NaNg 가 L D H re lea se 및 [크 H ]glutam ate uptake기 능 을 손 상시키 지 않는 저농도에서 M T T reduction을 현저 히 증 가 시 킴 을 확 인 하 였 다 . 또 저 농 도 의 A A 가 glu tam ate에 의 한 a stro c y te s 의 s w e llin g 을 억 제 함 을 확 인 하 였 다 . 이에 본 실 험 에 서 는 A A , DNP, N aN 3등의 저농도에 의 한 배 양 a stro c y te s 의 세포내 에너지 대사의 번화의 특성 및 그 생화학적 기전을 검 토 하 고 자 하 였 다 .

J. Pharm. Soc. Korea

Astrocytes 기눙에 대한 화학적무산소증유도물의 효과 853

실험방법

시약 - A A, NaNg, N a l스 N aCN , A T P assay kit, phioretin, M TT, E agle's minimum essential medi- um(EMEM), Dulbecco's minimum essential medium (D M EM ), poly-L-lysine은 Sigm a Chem ical Co. (St.

Louis, MO, U S A )로부터 구입하여 사 용 하 였 다 . 3 -0 - m ethyl-D-[l-^H ]glucose (fH ]O M G ), pHJglutamate 는 Amersham (Arlington Heights, IL, U S A )로 부 터 구 입 하 였 으 며 , fetal bovine serum (FB S)은 Hyclone (Logan, U T )의 것 을 , dispase는 B oehringer Mann- heim(GmbH, Mannheim, G erm any)으로부터 구 업 하 여 사 용 하 였 다 . Jocklik modified E M E M 은 Gibco B R L(Life technologies Inc., U S A )의 것을 사용하였 고 , DN P 는 Hanawa(Hayashi Pure Chemical Indus­

tries, Ltd. Japan)의 것 을 사 용 하 였 다 . 그 러 고 , 그 이 외의 시약은 특 급제품을 용■ 하 였 다 .

흰쥐 대뇌피질 a s t r o c y t e s 의 분러 및 배앙 - A strocytes는 1 — 2일령의 Sprague-D aw ley (SD) 흰쥐 의 대뇌 피질로부터 Frangakis 와 Kimelberg^으 ^ 방법 에 따 라 초대 배양하였다 . 대뇌 반구를 무균적으로 취 해서 수술 현미경하세서 뇌막과 혈관을 제거하고 피질 만 을 취하여 3 mg/m/ dispase률 함 유 하 는 Jocklik modified E M E M 중에서 처러하여 세 포 를 분 리 하 고 , 10% F B S 함 유 E M E M (배 앙 용 배 지 )중 에 서 3 ~ 4 x 1,000 cells/cm"로 배 앙 용 flask에 심 었 다 . 5% C C y 95% air를 유지하며 3 7 X 에서 배양 하 였 으 며 , 10일 정 도 지 나 세포가 flask 바닥에 confluent하게 퍼 지 면 , 0.25 mg/m/ trypsin으 로 세포 를 단 리 하 여 , 12 w ell 또 는 24 w ell plate에 1 x 10*물 cells/cm으 로 분 주 하 였 다 . 이 후 같은 조건에서 2 주 정 도 지 난 후에 실험에 이용 하 였 다 . 이 단계에서 glial fibrillary acidic protein에 im m unoreactivity가 90% 이 상 나 타 내 는 순 도 높 은 type I astrocytes률 형 성 한 다 .

흰쥐 소뇌 g ra n u le c e lls 의 분러 및 배양 - 7 — 8일 령의 흰쥐 (SD)로부터 소 뇌 를 적출 하 고 M cCaslin과 Ho^혁 방법을 약 간 수 정 하 여 , plastic pipette에 의한 기 계 적 분 산 과 0 .2 5 mg/m/ trypsin 및 0.08mg/m/

D N a s e i： 함유하는 D M E M C N aH O V free ) 중에서 배 양하식 세포를 단 리 하 고 , 10% F B S 함유 D M EM 으로 suspension 시 킨 뒤 , poly-L-lysine coating 된 24well plate에 2 x io S : e lls / m /이 되 도 록 심 고 , 이 를 10%

C02/90% air를 유지하며 3 7 X 에서 배 양 하 였 다 . 배 양 후 48시간 뒤 에 , 배지를 배양용 배 지 (10% F B S, 20

|xM cytosine arabinoside함 유 D M E M )로 교 환 하 여 glial cells의 성 장 을 억 제 하 였 다 . 배 지 는 1주일 에 2번 교 환 하 고 , 배양 후 9 --1 2 일 완 세 포 를 실험에 사 용 하 였 다 .

P C 1 2 ce ll 의 배양 - P C 1 2 cell의 배 양 은 G reen e와 T ischler^^엑 방 법 에 준 하 였 다 . 배 양 은 10 % horse seru m 과 5% F B S , lOOunit/ml penicillin과 100 ^g/

ml streptom ycin을 포 함 한 R P M I 1640 배 앙 액 을 사 용 ^ 조 직 배 양 용 dish상에서 2 - 3 일 배 양 후 , poly- L-lysine coating된 24well plate 에서 2 일 간 배 양 후 사 용 하 였 다 . 세포배양은 5% € 0 ^ 9 5 % air를 유지하며 3TC incubator에서 배 양 하 였 다 .

배앙 세포의 화학적 무산소증 유도물에 대한 노출 ~ HEPES-buffered Krebs-Ringer solution(HBKR(mM):

N aCl 156, K C l 5.6, NaHCOg 11, M gS 04 1, CaCl2 1, N aH 2P 04 1, D -glucose 10, H E P E S -N a 20, pH 7.4)로 3회 세척 후 30분 preincubation하여 세 포 를 평형시킨 후 여러 화합물을 농도 별 로 처리하고 일정시 간 배 양한 뒤 여러 가지 분 석 을 하 였 다 . PH JOM G uptake에 의 한 세포내의 w ater space의 죽 정 시 에 는 A A 를 30분 동 안 전 처 러 하 였 다 .

M T T a s s a y - M o s m a n n 2®>의 방법 을 약 간 수정하여 이 용 하 였 다 . M T T assay란 오로지 살 아 있 는 세포만을 즉 정 하 는 tetrazolium염인 M T T 의 formazan으로의 환 원을 측정 하 는 방 법 으 로 , 배양 세 포 률 여러 농도의 각 화합물을 함유하는 배지내에서 일정시간 배 양한 후 배 지 룰 제 거한 다 옴 5 mg/m/ M T T 용 액 (200 n/>을 가하 였 다 . 37°C에서 4시간을 배 양 하 고 , 살 아 있 는 세포의 mitochondria에 의하여 tetrazo liu m S 이 환원되어 생성 되 는 formazan결정을 산성의 isopropanol(0.04N H Cl in isopropanol) 을 200 |i/률 가하여 용 해 하 고 , 이 중 200|i/씩 을 96well plate에 취하여 test파 장 570 nmS]- 참 조 파 장 630nm 에서 E L IS A reader에 의하여 흡 광 도를 측경하여 대조세포의 흡광도에 대한 각 약물처리 에 의하여 나타나는 흡광도 변화의 백분율을 구하 였 다 . L D H 활성의 측정 - B e r g m e y e r 와 B ern t회의 방법에 따 라 시 행 하 였 다 . 대조세포 및 A A 에 노출된 세포의 배 양 medium을 일정량 취하여 medium중에 유리된 L D H 활 성 을 측 정 하 였 으 며 , 각 plate w e ll에 0 .1%

triton을 가 하 여 일 정 시 간 방 처 함 으 로 써 이 를 cell

이선애 • 박 f 규 • 성연희

hom ogenate로 하 고 이로부 터 일 정 량 을 취하여 총 L D H 활 성 (세 포 및 medium>ir 측 정 하 였 다 . LD H 활 성 은 phosphate buffer(pH 7.0)중 에 서 pyruvate와 N A D H 그 리 고 LD H 표품으로서 일정량의 medium을 가하여 spectophotometer에 의하여 3 4 0 피고에서의 몹 광도의 번화를 3분 간 측정함으로써 얻 었 다 . 1분간 1 mol의 N A D ■"룰 생 성시키는 효소의 활 성 을 lim it 로 하며 medium중 으로 유 리 되 는 LD H 의 활성은 다옴 식에 의하쉬 계 산하였다.

L D H a ctivity o f m edia T o ta l L D H a ctivity (cells and m edia) 100

= % L D H re lea se

[^H]Glutamate uptake 의 측정 - Y u 등체의 방법에 준 하 였 는 데 , 세포는 여러 농도의 A A 을 함유하는 배지 내 에 서 일 정 시 간 배 양 된 후 , 배 양 기 간 의 끝에 1심H ]glutam ate (0.15 |0,Ci/well, 50 ^M )를 가 하 고 5분 간 더 배 양 하 고 , 빙냉한 phosphate bufferd saline으 로 세척함에 의하여 응 을 정 지시켰다. 0.1N NaOH 로 세 포 률 가용화하고 scintillation counter에 의하여 방 사 활 성 을 측 정 하 였 고 , 일정량을 취하쉬 L ow ry법^ >

에 의하식 단백량을 측 정 하 였 다 .

세포용적의 측정 ([*H]OMG 의 uptake 측정 ) - 배 양 astrocytes의 intracellular water space률 pH]OM G 률 이용하식 Kletzien등^®*의 방법에 준하여 측정하였 다 . 이 방 법은 대사되지 않는 hexose인 O M G 가 세포 내 로 들 어 가 세포내와 세포외 농 도 가 평형에 이르게 되 는 성 질 을 이 용 한 것 이 다 . Phloretin은 세척하는 동 안 세포내에 들 어 간 OM G가 세포외로 방출되는 것을 방지하기 위하식 사 용 하 였 다 . 배양세포를 H B K R 로 3 회 세 척 한 후 30분■간 같은 buffer로 평 형 시 켰 다 . 이어 서 0.5 m M glutamate률 가하고 1시간 배양하였으며 그 배양의 마 지막 20분간에 [^H]OMG (0.5^Ci/well, I m M )률 가하식 uptake시 켰 다 . 배 지를 제 거하고 세포 는 0.1 m M phloretionlr 함유하는 빙냉 H B K R 로 3 회 세 척 하 였 다 . 세포룰 0.1N NaOH 로 가 용 화 시킨 뒤 , 세 포 내 로 uptake된 [3H ]0 M G 의 방 사 량 을 scin­

tillation counter로 즉 정 하 였 고 일 정 량 에 대하여 L ow ry법폐에 의하여 단 백량 을 측 정 하 였 다 . [^H]OMG 의 방 사 활 성 은 Kletzien등 2®의 방법의 산정법에 의하 여 intracellular w ater space로 나 타 내 었 다 . 따라서 측 정 치 는 m g protein당 H； ； 0 iM로 나 타 내 었 다 .

A T P 측정 - L o w i y ®>의 방법에 따 라 측 정 하 였 다 . 12 Well plate에 배양된 astrocytes를 glucose를 함유 하 는 H B K R 과 glucose률 함유하지 않는 H BK R 로 3 희 세 척후 각각의 buffer에 A A 틀 농도별로 처리하고 1시 간 배 양 한 후 빙 냉 한 5% perchloric aid를 가하고 cell을 scrapping하여 eppendorf tube로 옮겨 homo- g en ise하 였 다 . 이 룰 시 험 관 에 옮 겨 , 빙 냉 한 1M K H C O 3률 넣어 중 화 한 후 , 4°C 220X 용에서 14분간 원 심 분 리 하 고 , 상 층 액 을 filtration하 였 다 . 상층액중의 A T P 생성정도는 A T P biolum inescence assay kit률 이용하여 luciferin-luciferase법에 의하여 죽정하였으며, 대 조 세 포 에 있 어 서 의 A T P 에 의 한 luminoscent intensity!- 100으로 보고 이에 대한 백분율을 구하였다.

통계처리 -통 계 자 료 의 평균값은 m e a n ± S E M 5 로 표 시 하 였 다 . 유의성은 student's t-test룰 실시하여 확 인 하 였 다 .

실험결과 및 고찰

화 학 적 무 산 소 증 유 도 물 로 서 , mitochondria 의 aerobic respiratory chain을 억 제 하 는 A A, NaN3, D N P 와 mitochondria 의 에 너 지 대 사 뿐 아 니 라 cytoscjl의 anaerobic glycolysis를 억 제 하 는 N aCN 과 N aF 가 M T T reduction에 미치는 영향을 검 토 하 였 다 . 각 화 합 물 을 가 하 여 2 시 간 동 안 배 양 한 후 M T T assay를 한 결 과 , N aC N 및 N aF에 의하여는 농도에 관계없이 M T T reduction이 현저히 억제되는 반 면 , mitochondria의 에너지대사만을 억제하는 A A, NaN^

및 DNP는 농도에 따 라 전혀 다른 앙상을 나타내었다.

화 합물을 처치하지 않고 같은 시 간 배양한 w ell에 함 유된 세포에 의하여 일어나는 M T T reduction에 의한 흡 광도를 100%로 하였을 때 , NaCN와 NaF는 낮은 농 도 에 서 도 M T T reduction의 증가 는 나타내지 않고 용량의존적으로 억제룰 나타내어 50 m M 에 의하여는 각 각 8.3%와 19.0%로 낮은 M T T reduction율을 나 타 내 었 다 . 한 편 , 50|_ig/m/ A k 는 48.1% , 100 mM NaNg는 76.2%, 그 리 고 20 m M DN P는 5.1% 로 , 이 화 합 물 둘 을 고농도로 처치하면 M T T reduction율이 현저히 감소하였다. 그 러 나 , 요요의 5 및 lOng/m /에 의 하 여 는 각 각 149.0% 와 147.3% , NaN； j의 10 파 5 0 m M 에 의하식는 각 각 138.2% 와 117.0 % , 그리고 D N P의 5 m M 에 의하식 는 132.3% 률 나타내 는 등 , 각

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0 5 10 50 Antimycin A (ug/ml)

Fig . 2

- Change of LDH efflux to the culture medium after 2 hr treatment with antimycin A. Cells were incuba­

ted with antimycin A at 37^C for 2 hr. Values are means ± SEM of 4-8 wells. **p<0.01 compared to control cells.

Ischem ia에 노 출 된 신 경 세 포 는 다량의 glutam ate를 세 포 외 로 유 리 하 며 , astrocytes는 이 를 흡수하므로서 glutam ate에 의 한 신 경 득 성 을 억제하여 신경세포의 기 능 을 유지케 한 다 . 그러므로 astrocytes의 세포막의 통 합성 M ? 5~ 죽 정 하 는 지표로서 glutam ate uptake정

0 5 10 50

Antirrvcin A

{\igfrri)

Fig. 3 - Effect of antimycin A on [^HJgiutamate uptake in cultured astrocytes. Cells were incubated with various concentrations of antimycin A at 37 산 C for 2 hr.

Uptake of [^Hjglutamate was performed for the last 5 min of incubation. Values are means ± SEM of 4- 8 wells. *p<0.05 compared to control cells.

0 5 10 50 10 50100 5 10 20 5 10 50 5 10 50 AA (pgM ) NaN3 DNP NaCN NaF

W

Fig. 1 - Effects of chemical hypoxia inducers on MTT reduction in cultured astrocytes. After washing and equilibration of 30 min with HBKR, cells were incubated with various agents at the indicated concentrations at _3TX2 for 2 hr. At the end of the incubation, cells were processed for MTT assay.

Control cultures (0) were treated with HBKR.

Values are means ± SEM of 4-8 wells. **p<0.01,

*p<0.05 compared to control cells.

화합물의 저농도에 의해서는 M T T reduction이 유의 성 있게 증가하였다(Fig. 1). 이는 mitochondria에서 aerobic respiratory chain을 억제히는 물질들이 저농 도에서 는 세포손상을 유발하지 앉고 세포의 에너지대 사 룰 촉 진할 수 있다는 것을 시사하는 결 과 였 다 .

일반적으로 여러 원인에 의한 세포막 및 세포기능의 손상의 지표로서 medium중으 로 유리되는 LDH 링을 죽 정 한 다 . 그러므로 M T T assay결과 M T T reduction 을 증 가 또 는 감 소 시 키 는 각 농 도 의 A A 을 배 양 astrocytes에 가하고 2시 간 배양 한 후 medium중 으 로 유리된 LDH 량을 측 정 하 였 다 . Fig. 2에 나 타 냈 듯 이 , AA 률 처치하지 않은 w ell(대조세포)의 L D H 유리정 도 는 10 .7% 룰 보 였 는 데 50 ng/m/ A A 에 의 하 여 는 LD H re lea se 가 4 1.8 % 로 현 저 히 증 가 하 여 M T T reduction을 감소시키는 고농 도 에 서 는 세 포 막 손 상 을 일으킨 것을 알 수 있 었 고 , 반면 M T T reduction을 증가시킨 농도인 5와 lOi-ig/m/에 의하여는 8.5%로 대 조 세포 와 비교하식 LD H 유리에 영향을 미치지 않았 다 . 죽 , A A ^ 저농도에서는 세포막손상을 야기하지 않 으면서 M T T reduction을 증가시킴을 확 인 하 였 다 .

50 160

60

a l

Astrocytes 기능에 대한 화학적무산소증유•도물의 효과 855

해

^

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{lelouoo/o

} 9S8918JHCn

? 120 l o

I :

^ 40

20

Fig. 4 - Effect of antimycin A on MTT reduction in cultured astrocytes in a glucose-free HBKR. After washing with glucose-free HBKR, astrocytes were incubated with antimycin A in the same butter at 37^'C for 1 hr.

At the end of the incubation, cells were processed for MTT assay. Values are means ± SEM of 4-8 wells. **p<0.01 compared to control cells.

앞의 결과에서 저농도의 요요에 의하여 mitochon­

dria 의 기능이 부 분 적 으 로 차 단 되 면 cytosol에서의 anaerobic metabolism의 증 가 할 가능성을 제 시 하 였 다 . 그 러 므 로 , 저능도의 A A 와 M T T reduction을 현저히 억제하는 고농도의 A A 가 10 m M glucose를 함유하는 정상 H B K R 과 glucose free의 H B K R 에서 A T P 생성 량에 미치는 효과를 검 토하였다 . 정상 H BK R 에서 A A 을 처차하지 않은 세포에서 생성되는 A T P 량을 100%

로 하였을 때 glucose-free의 H BK R 에 의한 A T P 생 성 정도는 번함이 없었으며, 이는 많은 보고와 일처하 는 결 파 이 다 . 그리고 정상 H B K R 중에서 및 5 ng/m/의 A A 1 - 함유시키고 1시 간동안 배양한 세포에 서 생성된 A T P 함량은 대조세포에 비하식 유의성있는 변화률 나타내지 않았 으 나 , M T T reduction을 감소시 키는 농도인 50 ng/m/에 의하식는 약 60%의 감소를 나 타 내 었 다 . 한편 glucose-free H BKR중에 A A 를 함 유시키 고 배양한 세포에서는 모 든 농도에서 A T P 합성 이 완전히 차 단 되 었 다 (Fig. 5). 이 결과로부터, 저농도 의 요요에 의하여 mitochondria내에서의 aerobic A T P 합 성은 완전히 차단되며, 그 걸 과 cytos이에서의 anaero­

bic A TP 합성이 크게 증가하였옴을 알 수 었었 다 . 심 한 ischemia시 신 경 세 포 로 부 터 다 량 유 리 되 는

J. Pharm. Soc. Korea 도 를 죽 정 한 다 . 따라서 M T T reduction을 증 가 또는

감 소 시 키 는 A A 의 각 농도에 대하식 세포손상의 정도 를 측 정 하 는 또 다 른 방 법 으 로 서 [^H]glutamate uptake에 대 한 초요의 영 향을 측 정 하 였 다 . Fig. 3에 나 타 냈 듯 이 , A A 를 처 치 하 지 않 은 세 포 에 의하여 pH ]glutam ate uptake는 13.2 nmo]/mg protein을 나 타낸 데 비하여 50|_ig/m/ A A 에 의하여 6.4 nmol/mg protein으 현 저 한 억제를 보인 반 면 , 5와 10|xg/m/

•요요에 의해서 각 각 13.0, 17.5 nmol/mg protein으로 대조세포에 비하여 번 화가 없었 다 . 즉 , 새 는 astro­

cy tes의 M T T reduction을 증 가 시 키 는 저농도에서는 [^H]glutamate uptake에 영향을 미치지 않아 세포막에 손 상 을 일으키지 않는다는 것을 알 수 었 었 다 .

일 반 적 으 로 세 포의 M T T reduction정 도 는 mito­

chondria 의 기능을 나 타 낸 다 고 알려져 있 다 . 그러므로 위의 결 과 는 mitochondria 의 respiratory chain 만 을 억제하 는 A A, NaN j, D N P의 낮 은 농도에 의하며는 m itochondria의 기능을 증 강 시 켰 다 고 도 추 론 할 수 있 다 . 그 러 나 , Berridge 와 Tan2구 >에 의 하 면 , 대부분의 세포내 M T T reduction이 mitochondrial inner mem- braneifi에서의 N A D H 및 N A D P H 의존성 기전에 의 하여 이 루 어 지 며 , 이 는 respiratory chain inhibitor에 의해 억제되지 않는다고 하였다. 그러므로 저농도의 화 학적 무 산 소 증 유도물들이 mitochondria의 기능을 자 극 하였다면 medium중에 glucose를 제거하여 cytosol 에서의 glycolysis률 차 단 한 후 저농도의 이돌 화합물 들 을 가 하 면 오 로 지 mitochondria에 의 한 M T T reduction정도만을 측 정 할 수 있을 것 으 로 가정하였다.

그 러 나 , Fig. 4에 나타냈듯이 glucose-free medium중 에 A A 를 가하 고 1시간 incubation한 푸 M T T assay 를 한 결 과 , glucose 함유배지에서는 M T T reduction 을 증가시켰던 저능도에서도 M T T reduction은 현저 하게 감 소 하 였 다 . 이 러한 결 과 와 , Fig. 1의 NaCN과 N aF 에 의 하 식 는 낮 은 농 도 에 서 도 M T T reduction이

감 소하는 결 과로부터 , 이 화합물들이 저농도에 의하여 도 mitochondria의 기 능을 증 가 시 키 는 것이 아 니라 억 제 하 며 , mitochondria의 기능이 약하게 억제된 상태 에서 cytos이의 anaerobic metabolism이 증 가한다는 것 을 추 정 할 수 었 었 다 . 또 한 M T T reduction이 cytosol에 의하 여 도 나 타 남 을 확 인 시 켜 주 는 결 과 였 다 . Data에 는 나타내지 앉 았 지 만 , A A (5 ng/m/)에 의 한 M T T reduction의 증 가 는 8시간까지도 지 속 되 었 다 .

이선에 ■ 박우규 • 성연희

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Fig. 6 - Effect of antimycin A on glutamate-induced increase in intracellular water space (measured as [ 크 H]OMG space). Cultured astrocytes were incubated with 0.5 mM glutamate (L-glu) for Ihr in the presence or absence of antimycin A. Antimycin A was treated 30 min prior lo glutamate treatment. The uptake of [ 크 H]OMG was carried out for the last 20 min of incubation. Values are means + SEM of 4-8 wells.

행 fxO.Ol, compared to control. **pc0.01, *p<0.05 compared to glutamate.

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AntiTTVCin A (pg/mi)

Fig. 5 - Effect of antimycin A on ATP production in cultured astrocytes. After washing, cells were incubated with antimycin A in normal (10 mM glucose) or glucose- free HBKR at 37^C for 1 hr. At the end of the incubation, cells were processed for ATP assay.

Control cultures were treated with HBKR without antimycin A. The ATP level produced in the normal HBKR was taken as 100%. Values are means ± SEM of 4-8 wells. **p<0.01 compared to control cells.

glutam ate등*의 동분성 아미노산은 astrocytes에 의하여 흡수되어 대사됨으로서 신경세포 및 astrocytes의 기 능을 유지하는데, 유리된 다량의 롱분성 아미노산에 의 하여 astrocytes의 sw elling기 뇌부종에 선행하여 일어 나 며 , 일종의 기전으로서 곧 회복하는 능력이 있 다고 한 다 . 그 러나 장시간의 병태적 인자에 노출되면 대사적 에너지의 감소 와 함께 glutamate의 uptake에 이어 다량의 Na'", Ca^■"등의 이 온과 물의 유입으로 비 가 역 적 swelling을 유 발 한 다 그 리 하 여 M T T reduction을 증 가 시 키 는 저 농 도 의 A A 가 0.5 m M glutam ate에 의하여 일어나는 astrocytes의 swelling에 는 어떻게 영향을 미처는지률 검토하였다. Fig. 6에 나 타냈듯이 0.5 mM glutamate에 의하여 약 2배의 pH]

O M G space (5.7 버/m g protein)의 증 가 를 나타내었 으 며 , 이에 대히여 A A 률 30분간 견처리한 후 공존시 키면 P H ]0 M G space는 용 량 의 존 적 으 로 억 제 되 어 , 10n//n\g에 의하여 3.3n//rrig^ protein을 나 타 내 었 다 . 이 와 같은 결과는 저농도의 A A 에 의 한 cytosol내의 energy metabolism의 증가 로 인하여 세포막의 기능을 유지 하 는 효 소 , 특히 N a V i C A TPase의 활성이 증가

하므로서 효과적으로 세포막내외의 이온의 균형이 유 지 되 어 , cell s w e llin g ! 효과적으로 억제되었옴을 시 사 하는 결 과 이 다 . 이에 대 하여 , glycolysis에 의하여 생성 되 는 A T P 가 N a V K + A TP ase에 보 다 선 택 적 이 라 는 보 고 도 있 다 .^**

이상의 결괴■들이 astrocytes에 서 만 나 타 나 는 특이적 효 과 인 지 , 신 경 세 포 등 에 서 도 나 타 나 는 결 과 인 지 를 검 토하기 위하여 흰쥐의 소뇌로부터 granule neuron을 배 양 식 여러 농도의 A A , NaNg 및 D N P 를 2시간 동 안 처 처 한 후 M T T assay룰 하 였 다 . A A , N aN j 그 리 고 D N P은 저농도에서 고농도에 이르기까지 모 두 M T T reduction의 유 외 성 있 는 억 제 만 을 나 타 내 었 다 (Fig. 7A). 또 한 , A A . N aN j, D N P 의 다 양 한 농도에 의 한 P C 12 cells에서의 M T T reduction정도를 검토 한 결 과 , 각 화합 물 들 은 astrocytes에 서 와 같 은 M T T reduction의 증 가 는 나타내지 않 았 다 (Fig. 7B ). 죽 이 둘에 의 한 M T T reduction 증 가 효 과 는 astrocytes에 서 만 나 타 나 는 특이적 작용임이 확 인 되 었 다 .

이 상 의 결 과 로 부 터 , astrocytes는 저 농 도 의 A A, NaNq 및 D N P에 의하여 mitochondria의 기능이 억제

Astrocytes 기능에 대한 화학적무산소증유■도물의 효과 857

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Fig. 7 - Effects of antimycin A (AA), sodium azide (NaN

), 2,4-dinitrophenoI (DNP) on MTT reduction in cultured granule neurons (A) and PC 12 cell lines (B). After washing and equilibration of 30 min with HBKR, cells were incubated with various agents at the indicated concentrations at 37°C for 2 hr. At the end of the incubation, cells were processed for MTT assay. Control cultures were treated with HBKR.

Values are means ± SEM of 4-8 wells. **p<0.01,

*{x0.05 compared to control cells.

되 면, 세포의 기능을 정상적으로 유지하기 위하쉬 신경 세포등의 다 른 cell type에 비하여 매우 특이적으로 cytosol내에서의 glycolysis률 현저히 증 가 시 키 며, 그 결 과 세포막의 통합성이 그 대로 유지된다는 것을 알 수 있 었 다 . 이는 astrocytes가 허혈증의 초기 또는 가벼운 허혈증에 있어서 신경세포의 생존환경의 유지를 위하여 신경세포의 손상에 대한 강한 방어 효과능력을 가짐을 나 타내는 결과라고 생각된다. 또 한 , M T T reduction이 mitochonria뿐만 아 니 라 mitochondria외에서도 다량 일 어난다는 것을 확실히 하였으나 그 자세한 기전에 대하 여 는 더욱 연구되어야 할 것으로 생각된다.

결 론

배양 astrocytes에 있어서 A A 를 중심으로 한 화학 적 무산소증 유도물들에 의한 능도에 따른 세포활성의 번화를 실험한 결 과 , 다옴과 같은 결과률 얻 었 다 .

1) 고농도에 의하여는 M T T reduction의 현 저 한 감 소 와 함께 LD H 유리 및 glutamate uptake를 감소시 켰 다 .

2) 그 러 나 저농도에 의 하 식 는 M T T reduction율은 현저히 증 가 하 고 , LD H 유리 및 glutamate uptake에 는 영향을 미처지 않아 세포손상을 나타내지 않 았 다 .

3) Glucose-free배 지 중 에 서 는 저 농 도 에 서 도 M T T reduction을 현저히 감 소 시 키 며 , A T P 합 성 도 완벽히 차 단 되 었 다 .

4) 이 러 한 결과는 배양neuron 및 P C 12 cell line 에 서는 관 찰할 수 없었던 astrocytes에서만의 특이적 효 과 였 다 .

따라서 astrocytes는 허혈증의 초기 또는 가벼운 허 혈증에 있어서 신경세포 및 astrocytes 자체의 기능을 유지하기 위하여 glycolysis틀 자국히는 것으로 생각되 며 , M T T reduction은 mitochondria내에서뿐 아니라 mitochondria외 에서도 일어남 을 확 인 하 였 다 .

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