304 This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://
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J. Mushrooms 2014 December, 12(4):304-310 http://dx.doi.org/10.14480/JM.2014.12.4.304 Print ISSN 1738-0294, Online ISSN 2288-8853
© The Korean Society of Mushroom Science
*Corresponding author E-mail : [email protected]
Tel : +82-62-230-7518, Fax : +82-62-232-2474 Received November 3, 2014
Revised December 15, 2014 Accepted December 17, 2014
In vitro anti-cancer activity of hydrophobic fractions of Sparassis latifolia extract using AGS, A529, and HepG2 cell lines
Moon-Hee Choi, Hyo-Kyung Han1, Yong-Jo Lee, Han-gyo Jo and Hyun-Jae Shin*
Department of Chemical Engineering, Graduate School of Engineering, Chosun University, 309, Pilmun-daero, Dong-gu, Gwangju 501-759, Republic of Korea
1College of Pharmacy, Dongguk University, Pil-dong-3-ga, Jung-gu, Seoul 100-715, Republic of Korea
ABSTRACT: The use of mushrooms has immense potential in many diverse applications. Until now, more than 3,000 species are consumed around the world, and more than 100 have shown promising clinical activity against cancer and other chronic diseases. Sparassis latifolia (formerly S. crispa) is an edible mushroom that harbors β-glucan reported to possess immunostimulatory and anticancer properties. However there have been no reports on the anticancer activity of hydrophobic fractions of S. latifolia. In this study, the anticancer activities of S. latifolia extract and hydrophobic fractions were investigated using AGS (stomach cancer), A529 (lung cancer), and HepG2 (liver cancer) cell lines. In cytotoxicity results of A529 cells, fractions of A2, A3, A4, A6, A7, A8, A9, and A10 in all 12 fractions show low IC50 values. For HepG2 cells, A7 fraction results in the lowest IC50 value while A7, A8, and A11 fractions show low IC50 values in AGS cells. S. latifolia extract lead to low cell viability in cancer cells, compared to positive control of paclitaxel. A compound with molecular weight of 181 were detected using HPLC- MS but not identified yet. As a result, the hydrophobic fractions of S. latifolia EtOH extract would be a possible candidate as natural anticancer agents in the future.
KEYWORDS:Sparassis latifolia, β-glucan, IC50, Anticancer activity, Paclitaxel, Hydrophobic fractions
서 론
현대 사회의 급속한 산업발전으로 국민 소득이 증대되
고 삶의 질에 대한 요구가 높아지면서 질병 예방 및 건강 증진을 목적으로 하는 건강식품에 대한 관심도가 증대됨 에 따라 식품산업 전반에 걸쳐 우수식품 소재 발굴 등 기 능성식품에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다(Kim et al., 2009). 천연물 유래 생리활성 기능이 뛰어난 식품의 개발은 질병의 치료 및 예방적 측면에서 매우 중요하며, 여러 가지 기능성식품 중에서도 버섯은 광범위한 생리활 성 기능을 가지고 있어 예로부터 건강식품으로 널리 애용 되어 왔다(Lee et al., 2010).
꽃송이버섯(Sparassis latifolia, formerly S. crispa)은 일년생 버섯으로 우리나라의 숲에서는 5월부터 발생하기 시작하여 9월까지 발생하며 주로 7월에 많이 발견되는 버 섯으로 우리나라의 산림 내 낙엽송(Larix kaempferi), 잣 나무(Pinus koraiensis), 소나무(Finus densifora), 전나무 (Abies holophylla) 등의 줄기, 그루터기 및 나무 근처의
토양위에서 찾을 수 있다(Ryu et al., 2009). 꽃송이버섯 은 일반적으로 재배되는 식용버섯과 달리 활엽수 원목이 나 톱밥에서 자실체를 형성하지 않고 침엽수 그루터기나 침엽수 톱밥을 이용하여 만든 배지에서 자실체를 형성 할 수 있어 우리나라에 전역에 널리 분포되어 있는 각종 침 엽수 간벌재나 숲 가꾸기 산물을 꽃송이버섯 재배에 활용 할 수 있으므로 우수한 임산 소득원이라 할 수 있다(Oh et al., 2014).
최근 여러 종류의 버섯 자실체 및 균사체 추출물 중에 서 탁월한 항암효능과 당뇨병 개선효과를 보이는 생리활 성 물질이 β-D-gulcan 구조를 갖는 수용성 단백 다당체로 구성되어 있음이 밝혀졌다(Park et al., 2005). 또한 β- gulcan은 인체의 면역시스템에 작용하여 인체의 면역력을 증강시켜 주는 biological response modifiers(BRM) 물질 로 잘 알려져 있으며, 백혈구의 수를 증가시킴으로써 세 포조직의 면역기능이 향상되어 항당뇨, 혈압조절 작용을 한다고 보고되었다(Ohno et al., 2002).
꽃송이버섯에는 β-gulcan과 더불어 다양한 phenolic compound가 많이 함유되어 있는데, 그중 veratric acid와 같은 benzoic acid 계열의 성분을 다른 약용 버섯에 비해 많이 함유하고 있는 것으로 보고되었다(Kim et al., 2008). 꽃송이버섯의 다양한 약리활성은 최근 총설에 잘 정리되어 있다(Chandrasekaran et al., 2011). 기존의 국내 연구들은 꽃송이버섯 재배의 최적 배지 조성과 배양적 특 성에 관한 연구가 대부분이며, 꽃송이버섯의 생리활성 기 능에 대한 여러 보고가 있음에도 불구하고 꽃송이버섯의 항암 활성에 대한 관한 연구는 다른 활성에 비해 상대적
으로 미흡한 실정이다. 특히 대부분의 연구결과가 β- gulcan을 위주로 한 친수성 성분에 집중되어 있고 소수성 성분에 대한 활성연구는 거의 전무하다고 할 수 있다. 따 라서 본 연구에서는 한국인의 주요 3대 암으로 분류되는 위암(AGS), 폐암(A529), 간암(HepG2) 세포주를 이용하 여 꽃송이버섯 추출물의 소수성 분획물의 항암 활성을 평 가하였다.
재료 및 방법
Sparassis latifolia extract preparation and fraction 실험에 사용한 꽃송이버섯은 화순군 소재 백아산 꽃송 이 농장에서 제공 받았으며, 자연건조 후 분말 형태로 만 들어서 사용하였다. 실험에 사용한 ethanol과 ethylacetate, buthanol, hexane, methanol은 Sigma(USA) 사에서 구입 하였고 Silica gel(230~400 mesh)은 Oci(Korea)에서 구입 하였다. 꽃송이버섯 건조물 200 g을 80% 에탄올로 추출 하여 67 g의 추출물을 얻었다. 이 추출물을 다시 물층과 ethylacetate(EtOAc) 층으로 나누어 EtOAc 층을 12 g 회 수하였으며 이를 다시 물층과 butanol 층으로 나누었고 이 butanol 층을 silica open comn chromatograpy(SOCC)를 이용하여 분획하였다. 초기에는 Fig. 1과 같이 12개의 fraction으로 분리하였으며 TLC 및 MTT assay를 사용하 여 5개의 fraction으로 조합하였다. 조합된 5개의 fraction 을 감압농축기로 농축한 후 5개의 fraction을 High performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS) 를 통하여 분석하였다.
Fig. 1. Flow-chart of solvent partition and open column fraction of S. latifolia extract.
Thin layer chromatography(TLC)
Thin layer chromatography는 여지크로마토그래피와 같 이 한쪽 끝에 시료를 붙여 용매를 스며들게 하는 방법으 로 물질을 동정하는데 여지 이외에도 여러 가지 지지체를 이용 할 수 있어 이용범위가 넓다. 또한 분리 후 성분의 검출 방법이 잘 알려져 있고 회수가 쉬워 각 성분의 정성 또는 정량분석이 가능하다. 본 실험에서는 SOCC를 이용 하여 분리된 분획물을 TLC를 통해 확인하였다. TLC plate로는 silica 60(Merck)이 코팅된 aluminium sheets, 발색시약으로는 5% H2SO4 in ρ-anisaldehyde solution(Sigma) 를 사용하였다. 전개 용매는 hexane:ethyl acetate(5:5, v/v), methanol:water(5:5, v/v) 비율로 사용하였다. 전체 전개 길이는 7 cm이었고, 전개가 완료되면 실온에서 건조 후 5% H2SO4 in ρ-anisaldehyde solution(Sigma)으로 발색시 키고 100oC에서 건조하였다.
DPPH radical scavenging
꽃송이버섯 컬럼 분획물 5종의 항산화 활성을 DPPH 방법 으로 측정하였으며, 토코페롤(α-tocopherol)을 이용하여 보 정곡선을 만들고 측정하였다. 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
radical(DPPH, Sigma)과 양성대조군으로 토코페롤(α- tocopherol, Sigma)을 사용하였으며, UV-spectrophotometer 는 Sinco사의 S-3100 모델을 사용하였다. 0.2 mM DPPH 1 ml과 각 농도별 시료 1 ml를 섞어서 30분 동안 반응시 킨 후 UV-spectrometer를 사용하여 517 nm 파장에서 3회 반복 측정하였다. DPPH radical scavenging activity는 다 음 식으로 계산하였다.
DPPH radical scavenging activity (%)
High performance liquid chromatography-Mass spectrometer(HPLC-MS) analysis
HPLC-MS는 Shimadzu(Japan)사의 LSMS-2020을 사용 하였으며, formic acid, acetonitrile, water는 HPLC grade 로 대정화금 (Korea)에서 구입하였다. 질량분석기 의 조건은 Atlantis C18 (2.1×150 mm, 3 µm particle size) 컬럼을 사용하였고, 이동상으로 0.05% formic acid
1 Absorbance of sample–Absorbance of control---
⎝ ⎠
⎛ ⎞ 100×
= Fig. 2. HPLC-MS result of Fr.3 from S. latifolia EtOH
extracts.
Fig. 3. Growth inhibition effect of S. latifolia extracts in A529 cell line. Treated concentration of fractions is 0.25 mg/
mL. (n=12)
Fig. 4. Growth inhibition effect of S. latifolia extracts in HepG2 cell line. Treated concentration of fractions is 0.25 mg/mL. (n=12)
in water:acetonitrile(6:4, v/v)을 사용하였다. 유량은 0.2 ml/min이었고, MS scan은 Positive ion mode로 하였다.
분자량 측정 범위는 150-1000 m/z이고, 각 분획물은 50%
acetonitrile in water로 100배, 200배 희석하여 blank와 비교하였다.
Cell culture
항암 활성 측정을 위하여 AGS, A529, HepG2 세포주 를 사용하였다. 세포 배양 배지로는 10% fetal bovine serum, 100 units/ml penicillin 과 100 mg/ml streptomycin 을 함유하는 Dulbeccos Modified Eagles Medium(DMEM) 배지를 사용하였고 37oC humidified air/CO2 조건하의 incubator 에서 배양하였다.
Anticancer activity measurement
MTT assay를 통하여 꽃송이버섯 추출물의 세포 독성을 측정하였다. 96 well plate의 각 well에 세포를 분주하고 37oC humidified air/CO2 incubator에서 사전 배양하였다.
80% 정도의 confluence에 도달한 후 배지를 serum이 고 갈된 배지로 교체하였고 overnight하여 안정화시켰다. 꽃 송이버섯 추출물의 분획물을 가하고 24시간 동안 배양 후 배양액을 MTT 용 배지로 교체하였다. 2시간 동안 배양 후 MTT 용 배지를 제거하고 DMSO로 다시 용해 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
결과 및 고찰
꽃송이버섯 추출물의 소수성 분획물 준비와 분석 본 연구에서는 꽃송이버섯 에탄올 추출물에 존재하는 다양한 지용성 화합물을 얻기 위해서 n-BuOH 층까지 상 분리 후 SOCC 분획을 실시하였다. 본 연구에서의 지표물 질이 지용성 물질이라는 가정 하에 EtOAc 상분리 시 물 층에 녹는 화합물이 섞일 것을 대비하여 비극성이 약한 n-BuOH를 사용하여 지용성 물질을 분획하였다(Kawagishi
et al., 2007). EtOAc가 n-BuOH보다 극성도(polarity index)가 각각 4.4와 4로 n-BuOH가 낮지만 물에 대한 용 해도가 EtOAc, n-BuOH 각각 8.7%, 0.11%로 EtOAc가 물에 녹는 물질이 어느 정도 섞여있는 것으로 추측할 수 있다. Fig. 1과 같이 SOCC를 통해 12개의 분획물을 용출 하였고, 각각 1 L 씩 용출하였다.
12개의 분획물에서의 TLC 결과 및 MTT assay 결과를 토대로 조합한 Fraction 5개의 샘플 중에서 유일하게 분 석 할 수 있는 조건이 나타난 것은 Fraction 3번(Fr.3, 0.0804 g) 시료였다. Fr.3은 A4-A6의 SOCC 분획물을 조 합하였고, 용출시 사용된 용매는 비극성 용매인 hexane:
EtOAc 가 각각 4:6, 3:7, 2:8의 비율이었고, 모두 지용성 용매에서 용출된 분획물이다. Fr.3을 HPLC-MS로 측정한 결과 7분에 major peak, 10.7분에 minor peak가 검출되었 다. 7분에 검출된 major peak로 분자량 측정 결과 181.0 m/z ratio가 특징적으로 관찰되었고, 분자량 180.0인 물질 이 존재할 것으로 사료된다. 10.7분에 검출된 minor peak 의 경우 [M+H]+=179.0, 194.1, 233.1의 m/z ratio 를 가 진 물질들이 관찰되었으나 [M+H]+=179.0, 194.1 m/z ratio를 가진 물질들은 blank에서도 약간 관찰되므로 Fr.3 의 특징적인 물질이 아닌 것이라 볼 수 있다.
Fig. 5. Growth inhibition effect of S. latifolia extracts in AGS cell line. Treated concentration of fractions is 0.25 mg/mL.
(n=12)
Table 1. DPPH scavenging activity of five fractions from S.
latifolia EtOH extracts Fractions Absorbance
(517 nm)
Activity (%)
Equivalent of α- tocopherol(μg/g) Fr.1 0.6626±0.017 0.436 ± 2.535 2.41±0.025 Fr.2 0.6809±0.013 -2.314 ±2.018 -2.44±0.020 Fr.3 0.6836±0.015 -2.725 ±2.196 -2.45±0.022 Fr.4 0.6817±0.000 -2.429 ±0.057 -2.44±0.001 Fr.5 0.6584±0.011 1.072 ± 1.584 2.41±0.016 Blank is α-tocopherol. O.D. is 0.6655±0.000
Table 2. Anticancer activity (IC50 value) of hydrophobic fractions from S. latifolia EtOH extract
Fractions IC50 (ug/ml) *
A549 HepG2 AGS
A2 63.4 218.3 116.8
A3 81.1 115.1 30.5
A4 168.6 - 99.7
A6 169.2 - 89.8
A7 73.07 83.8 69.2
A8 77.5 137.2 27.1
A9 88.85 178.7 67.8
A10 103.7 142.4 124.2
A11 - - 35.7
* Mean values from two independent studies (n=6)
합물을 확인 하였다(Ferreira et al, 2010). 또 다른 연구에 서는 꽃송이버섯 acetonitrile(ACN)+0.1 N HCl 추출물 HPLC 분석결과 benzoic acid, ρ-hydroxybenzoic acid, protocatechuic acid, gallic acid, gentisic acid, kaempferol, naringenin, resveratrol과 같이 항산화능을 가진 폴리페놀 류 15종의 화합물이 검출되었으며, 인도산 꽃송이버섯 물 추출물과 메탄올 추출물HPLC 분석결과 tannic acid, gallic acid, protocatechuic acid, gentisic acid, vanillic acid, syringic acid, caffeic acid 7종의 폴리페놀류 화합물 이 검출되었다(Puttaraju et al., 2006).
본 연구에서 발견된 분자량 181의 물질은 항산화활성이 발견되지 않는 것으로 보았을 때 기존에 알려진 benzoic acid 유도체와는 다른 물질일 것으로 예측되며, 좀 더 자 세한 MS/MS 분석과 IR, NMR 분석을 통해 구조식을 밝 혀야 할 것으로 판단된다.
DPPH radical scavenging activity
생체 내에서 생성되는 활성산소종(O2-, H2O2, OH-)은 지 질 이중층의 세포막의 손상을 초래함으로써 여러 가지 생 리적 장애를 일으키는데 지질과산화 반응을 억제할 수 있 는 대표적인 성분인 vitamin C, E 같은 항산화물질이 체 내에 존재하여 이를 방어하는 역할을 한다(Bagchi et al., 1997). 인간의 노화현상은 항산화 물질의 감소 또는 독성 물질의 생성으로 인한 생체 내 항산화 방어시스템이 원활 하지 않아 발생하며, 생체 방어력에 이상이 생기거나 과 도한 활성산소에 노출 될 경우 노화는 물론 암을 비롯하 여 뇌졸중 파킨슨씨병과 같은 각종 질병을 일으키는 것 으로 알려져 있다(Han et al., 2009). 꽃송이버섯의 항산 화 활성에 관한 기존의 연구에서는 대부분 수용성 물질 의 항산화 활성을 확인한 연구가 대부분으로 꽃송이버섯 에 함유되어 있는 폴리페놀류의 물질들은 산화성 자유 라디칼과 반응하여 산화력을 억제시키는 역할을 한다고 보고되었다(Moradali et al., 2007). 선행연구에서 꽃송 이버섯 추출물의 수용성 물질에서 항산화활성을 확인 하 였는데 gallic acid, kaempferol, naringenin, resveratrol과 같은 폴리페놀류 화합물에 상응하는 항산화활성을 확인한 것으로 보고되었다(Kim et al., 2008).
꽃송이버섯의 생리활성 물질로 알려져 있는 β-D-gulcan
시키는 β-D-gulcan을 가장 많이 함유하고 있어 암환자와 암을 예방하려는 사람들의 많은 관심을 받고 있는 추세이 다(Hong et al., 2004). 버섯유래 β-D-gulcan은 수용성의 성향은 낮으나 온도를 높여주면 약간 수용성을 띄게 되는 데 이와 같은 성향이 DPPH radical 소거능에서 항산화 활성을 나타내는 것으로 생각되어 진다. 대부분의 항산화 물질이 물에 잘 녹는 수용성 물질로 알려져 있지만 vitamin E에 속하는 α-tocopherol 같은 경우 생체 내에서 활성산소를 제거하는 대표적인 지용성 물질로 알려져 있 다(Fryer, 1992). 본 실험에서는 기존에 연구되어 있지 않은 꽃송이버섯 추출물의 지용성 물질에 대한 항산화 활성을 확인하고자 하였으며, 기준물질로 토코페롤(α-tocopherol) 을 이용하여 보정곡선을 만들고 항산화 활성을 측정 하였 다. TLC 결과에 의해 선택된 꽃송이버섯 컬럼 분획물 5 종의 항산화 활성을 DPPH 방법으로 측정하였는데 지용 성 물질 5개의 분획물 모두에서 DPPH 활성을 보이지 않 는 것으로 보아 본 실험에서 사용한 꽃송이버섯 추출물의 지용성 물질은 폴리페놀성 화합물 및 항산화 활성을 갖지 않는 것으로 판단된다.
Anticancer activity measurement
버섯에서 알려진 항암 활성은 주로 β-D-gulcan 면역기 능 향상 효과에 기인하는데 β-D-gulcan의 면역 활성 및 항암 효과의 검증을 위해서는 대식세포인 Raw 264.7 cell 을 주로 사용하여 사이토카인인 TNF-α, inter-leukin-1β 의 분비량을 측정한다(An et al., 2002). 대식세포는 항원 의 자극을 받아 활성화되면 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12, GM-CSF 등을 분비하여 면역 반응을 조절하며 TNF-α는 종양괴사인자(Tumor Necrosis Factor)로 알려진 물질로 종양세포를 파괴시킨다(Trapnell et al., 2002).
본 실험에서는 기존의 연구에서 항암 활성이 밝혀져 있 는 Raw 264.7 cell을 사용하지 않고 한국인의 3대암으로 알려져 있는 위암 (AGS), 폐암 (A529), 간암 (HepG2) 세 포주의 항암 활성을 MTT assay 를 통해 확인 하였다. 꽃 송이버섯 추출물을 컬럼 분획한 분획 (A1~A12까지 12개 분획물)을 이용하여 꽃송이버섯 추출물의 암세포성장 억 제를 측정하였다. 위암 (AGS), 폐암 (A529), 간암 (HepG2) 등 3대암 세포에 대한 세포독성 여부를 % inhibition 또는
IC50값으로 확인 하였는데 1차 screening 시에는 0.25 mg/mL 농도에서 % inhibition을 측정하였고 2차 screening에서는 1차에서 선별된 시료에 대해 IC50값을 측정하였다. 세포주 당 배양시간은 시료 처리 후 72시간이었으며 양성대조군 으로는 대표적인 항암제로 알려져 있는 paclitaxel, 음성대 조군은 증류수를 사용하였다.
폐암 세포주인 A529 cell 의 세포독성 평가에서는 꽃송 이버섯 추출물 12가지 분획물중 A2, A3, A4, A6, A7, A8, A9, A10의 경우가 IC50값이 낮았으며, 간암의 경우는 A7이, 위암의 경우에는 A7, A8, A11의 수치가 낮았다.
전체적으로 보았을 때, 꽃송이버섯 추출물은 양성대조군 인 paclitaxel보다 낮은 세포 생존율을 보였다. 꽃송이버섯 추출물이 암세포의 성장을 억제 하는지 확인하기 위해 in vivo에서 암을 잘 유발한다고 알려진 murine B16F10 melanoma 세포를 C57BL/6J mouse의 복강에 주사하여 암을 발생시켜 꽃송이버섯 추출물을 21동안 식이 하였을 때 꽃송이버섯 추출물을 먹인 mouse의 경우 tumor의 volume이 증가하지 않음을 통해 항암 활성을 확인 하였으 며(Kim et al., 2013), 꽃송이버섯 열수 추출물을 mouse 육종암 세포인 sarcoma 180 세포주에 처리하여 세포독성 을 확인하였고 BALB/c mouse 암컷 생쥐에게 복강 내에 이식하여 항암 활성을 조사 하였는데 in vitro에서는 1000µg/ml의 농도에서 현저한 세포 독성을 발휘하였으며, In vivo에서는 400 mg/kg 투여군에서 유의성이 관찰 되었 다(Chung et al., 2005). 또한 꽃송이버섯 자실체로부터 분 리한 1,3-β-D-gulcan의 항암효과 및 cyclo-phosphamide로 유발된 백혈구 감소증 생쥐에서의 조혈기능 증강 효과도 보고 된 바 있다(Ohno et al., 2000). 이 같은 선행결과들 은 본 실험 결과와 일치하였으며, 꽃송이버섯이 식용버섯 뿐만 아니라 약용버섯으로서 암의 예방과 치료에 널리 사 용될 수 있음을 시사한다.
적 요
본 실험에서는 꽃송이버섯 (Sparassis crispa, formerly S. crispa) 에탄올 추출물의 소수성 분획을 분리하고 각 분획의 DPPH 항산화 활성과 위암 (AGS), 폐암 (A529), 간암 (HepG2) 세포주를 이용한 항암 활성을 MTT assay 를 통해 확인 하였다. SOCC를 사용하여 총 18개의 fraction으로 분획하였고 TLC와 세포주를 이용한 항암 활 성 확인을 통하여 5개의 fraction으로 압축하였다. 항암 활성이 높은 5개의 fraction은 HPLC-MS를 통해 각 분획 물을 분석한 결과 항산화 활성을 보이지 않았으며 약 181.0의 분자량을 가진 물질이 지표물질로 확인되었으므 로 이 물질의 화학식 동정을 위하여 추가실험이 필요하다.
세포주를 이용한 항암실험 결과 꽃송이버섯 추출물은 위 암 (AGS), 폐암 (A529), 간암 (HepG2) 세포주 모두에서 양성대조군인 paclitaxel보다 낮은 세포 생존율을 보여 주
었으며(IC50 value), 이것은 추후 꽃송이버섯 추출물에 포 함된 항암 물질 분리 연구를 위한 기초연구 결과로서 무 척 의미가 크다고 할 수 있다.
감사의 말씀
본 연구는 산림청 산림과학기술개발사업(S110912L020100) 에 의해 이루어진 것으로 이에 감사드립니다.
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