이 홍 기

대한내과학회지: 제 75 권 부록 2 호 2008 □대한내과학회연구비 결과보고□

-S 592 -

철분결핍성 빈혈 환자에 있어서 헬리코박터 제균치료가 Hepcidin의 농도에 미치는 영향

건국대학교 의과대학 내과학교실

이 홍 기

연구 배경 및 목적

헬리코박터 감염은 전 세계적으로 흔한 감염으로 생존하기 위해서는 철분이 필요하기에 철분결핍성 빈혈과 연관이 있다

1). 최근 원인을 모르는 철분결핍성 빈혈 환자에서 헬리코박터 제균치료를 할 경우, 빈혈이 호전된다는 사실이 알려졌다^{2, 3)}. 하지만 일상 진료에서 접하는 모든 철분결핒성 빈혈 환자가 헬리코박터 제균치료에 반응하는 것은 아니며, 같은 헬리코박 터 감염이 있어도 일부의 환자에서만 철분 보충 없이도 빈혈 수치가 호전된다^4). 이에 몇 연구자들은 헬리코박터 감염이 철 분결핍성 빈혈과의 인과 관계에 대해서 논한 바 있다^{5, 6)}.

Hepcidin (hepatic bacterial protein)은 간에서 만들어지는 25개의 amino acid disulfide-rich peptide로서 전신적인 철분 조절 호르몬으로 작용하며, 소장에서의 철분 흡수에 영향을 미치는 것으로 알려진다⁷⁾. Hepcidin은 감염이나 lipopoly- saccharide 생산에 의해서 생성되는데, 이는 주로 만성 빈혈 과 연관이 있는 것으로 추정된다^8-10). Hepcidin이 과도하게 생성될 경우, 철분은 간과 췌장의 reticuloendothelial system 에 축적되고 이는 곧 철분결핍성 빈혈로 이어진다¹¹⁾. 반면에 hepcidin 유전자 발현이 없는 knockout mice에서는 과도한 철분 생산이 관찰된다¹²⁾. 따라서 혈청 ferritin 수치는 혈청 hepcidin 수치와 연관이 있으며[Dallalio 2003], 이는 hepcidin 과 철분결핍성 빈혈간의 연관성을 시사한다¹³⁾.

이에 이 연구에서는 철분결핍성 빈혈 환자에서 헬리코박 터 제균치료 전과 후의 hepcidin 수치의 변화에 대해서 알아 보고, 왜 헬리코박터 제균치료가 원인을 모르는 철분결핍성 빈혈 환자에게 도움이 되는지를 설명하고자 하였다.

연구 대상 및 방법

1. 피험자의 선정기준

- 본원에서 Fe, TIBC, ferritin level 측정 후에 철분결핍성

빈혈로 확진이 된 경우

- 본원에서 헬리코박터 검사를 한 경우 (여기서 헬리코박 터 감염 여부는 내시경 검사시에 시행한 rapid urease test나 조직검사 및 Giemsa 염색이나 혈청 검사 중 한가지라도 양 성으로 나온 경우를 말한다.

- 위내시경 검사와 대장내시경 검사상 급성출혈의 원인 이 밝혀지지 않은 경우

- 연구의 취지를 이해하고 동의서에 서명한 경우

2. 피험자의 제외기준

- 만성 염증성 질환, 감염, 악성 종양의 증거가 있는 경우 (이러한 질환은 hepcidin 농도를 상승시킬 수 있으므로 제외 한다.)

- 기질적 질환이 있는 경우 (기질적 질환에 대한 평가는 기본적으로 문진, 신체검사와 함께 혈액검사 등을 시행하여 이상여부를 판단한다. 또한 필요시, 각 증상에 대한 정밀검 사를 추가적으로 시행하여 기질적 질환의 유무를 평가한다.)

- 이미 헬리코박터 제균치료를 받은 경우 - 현재 규칙적으로 철분제를 복용 중인 경우

- 헬리코박터 제균치료 후에 추적검사가 불가능한 경우 (여기서 추적검사란 urease breath test나 rapid urease test, biopsy with Giemsa stain과 Fe, TIBC, ferritin 농도를 포함한 혈액검사를 말한다.)

- 치료에 동의하지 않은 경우 (여기서 치료란 amoxicillin 1g bid + clarithromycin 500mg bid + proton pump inhibitor 1T bid로 7일간 하는 제균치료를 말한다.)

3. 연구 측정인자 및 임상시험 진행시 검사항목

- 기본사항 (성별, 나이, 과거력, 위장관 증상, 흡연력, 음 주력, 등)

- 위와 대장내시경 검사 소견

－ 이홍기: 철분결핍성 빈혈 환자에 있어서 헬리코박터 제균치료가 Hepcidin의 농도에 미치는 영향 －

-S 593 - Sex/age Duration of IDA Hemoglobin

(mg/dL) Fe (ug/dL) TIBC (ug/dL) Ferritin (ng/mL) 1

2 3 4 5 6 7 8 9

F/40 F/37 F/39 F/32 F/42 F/40 F/25 F/28 F/40

Recent 1 month 3 months

10 years 2 year

recent 10 years 1 month 2 months

7.7 8.1 9.8 3.7 9.6 8.4 8.1 5.1 8.5

12 10 12 8 21 11 14 6 12

462 476 436 500 432 465 588 530 438

3.48 2.77 3.77 0.93 3.14 2.39 1.22 3.13 3.20 Fe, iron; TIBC, total iron binding capacity

Before H. pylori eradication After H. pylori eradication p-value^* Hemoglobin (g/dL, mean±SD)

Hematocrit (%, mean±SD) Fe (ug/dL, mean±SD) TIBC (ug/dL, mean±SD) Ferritin (ng/mL, mean±SD) Hepcidin (ng/mL, mean±SD)

7.67±2.01 26.36±5.76 11.78±4.21 480.78±51.39

2.67±0.99 224.80±23.23

10.76±2.43 34.26±5.76 45.00±54.39 427.00±66.30 7.39±6.38 179.70±40.84

0.008 0.008 0.038 0.008 0.021 0.015

*Wilcoxon signed ranks test

Fe, iron; TIBC, total iron binding capacity

- 혈액검사 소견 (Hb, Hct, Fe, TIBC, Ferritin, 등) - 혈청 Hepcidin 농도

Serum prohepcidin level측정은 Hepcidin Prohormone ELISA (Solid Phase Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) kit 의 사용법에 준하여 다음과 같이 시행하였다.

혈청 prohepcidin level측정은 Hepcidin Prohormone ELISA (Solid Phase Enzyme‐Linked Immunosorbent Assay) kit의 사용 법에 준하여 다음과 같이 시행하였다.

채혈한 샘플은 영하 20도에 보관한 뒤, 일괄적으로 Hepcidin Prohormone ELISA (Solid Phase Enzyme‐Linked

Immunosorbent Assay) kit (코드 번호 EIA‐4015, DRG 국제 제조자, 미국)을 통해서 측정하였다. Assay buffer 100 uL을 microtiter well에 넣고, 대조용과 혈청을 각각 50 uL씩 넣었 다. Biotin 혼합물 100 uL를 각 well에 넣고 10초간 완벽하게 섞었다. 상온에서 2시간 보관한 뒤, 각 well당 400 uL 세척용 용액으로 5번씩 씻었다. 효소 혼합물 100 uL를 가하고 상온에 서 1시간 동안 incubation하였다. 5회 추가 세척을 한 뒤, 추 출물 용액 100 uL를 추가했다. 상온에서 30분간 incubation한 뒤, stop solution 100 uL을 추가했다. Optical density는 450 nm에 Bio‐Rad PhD^TM system (Bio‐Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)로 stop solution이 투여된 뒤 10분 이내에 판독하 였다. 표준곡선은 mean absorbance plotting으로 그리며, Bio‐

Rad PhD^TM system (Bio‐Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) 에 적합한 4 parameter logistics curve를 통해 흡수치를 Y 축 에 농도를 X 축에 그렸다. 표준 곡선을 통해서 각 샘플의 농도를 자동 계산하였다. 모든 절차는 두번씩 반복하였다.

Coefficient of variation (CV)이 15.0% 이상 차이날 경우에는 다시 실험하였으며, 재검한 결과로 분석하였다.

－ 대한내과학회지: 제 75 권 부록 2 호 2008 －

-S 594 - 4. 통계분석

치료 전후의 수치 변화는 Wilcoxon signed rank test를 통 해서 한다. 양군간의 차이는 chi-square test나 Student’s t-test 로 하며, 나이는 평균값±표준편차로 한다. P 수치가 0.05 이 하일 때를 통계학적으로 유의가 있다고 판단한다.

연구 결과

원인 불명의 철분결핍성 빈혈로 진단된 9명의 여성이 제 균치료 후의 혈액검사를 마쳤다. 현재 치료를 진행 중이거 나 추적 관찰 중인 나머지 환자들은 이후 최종보고에 포함 될 예정이다.

위 9명의 여성은 헬리코박터 제균치료가 모두 성공적으 로 이루어졌으며, 치료 전후의 혈액검사 수치의 변화는 다 음과 같았다.

나아가서 위 환자들의 개인별 hepcidin 수치의 변화를 본 결과, 다음 그림과 같았다.

고 찰

현재 치료를 마친 9명 환자의 수치만 살펴본 결과, 원인 을 모르는 철분결핍성 환자에서 헬리코박터 제균치료가 빈 혈수치의 상승과 함께 hepcidin 수치의 하강을 가져옴을 알 수 있었다. 흥미롭게도 위 그림에서 유일하게 제균치료 후 에 hepcidin 수치 상승을 보인 subject 4는 난소종양(2 cm sized ovarian teratoma)이 최근에 발견되어 산부인과에서 수 술을 받았다.

이상의 결과로 미루어 볼 때, 헬리코박터 감염은 혈청내 hepcidin 수치를 상승시켜 철분결핍성 빈혈 치료에 여향을 준다. 헬리코박터 제균치료를 할 경우, hepcidin 수치의 감소

와 함께 철분 교정이 원활히 이루어져서 철분결핍성 빈혈 치료에 이바지하는 것으로 추정된다. 나아가서 헬리코박터 감염이 없는 철분결핍성 환자에서의 철분치료 전후의 hepcidin 수치 변화 및 헬리코박터 제균치료에서 실패한 철 분결핍성 환자에서의 치료 전후의 hepcidin 수치 변화도 추 적관찰하고 있으므로, 최종적으로 종합하여 비교 분석하면 흥미로운 결과가 나올 것으로 추정된다.

∙이상 보고한 내용은 추적 검사가 완료된 9명의 환자의 것만 분석한 것으로, 현재 제균치료 중인 환자를 포함하 여 추적 검사결과가 나오는 대로 10월 내과학회 발표 전 에 최종보고서를 작성할 것을 약속합니다.

REFERENCES

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Helicobacter 4:135-9, 1999

6) Gessner BD, Baggett HC, Muth PT, et al. A controlled, household-randomized, open-label trial of the effect that treatment of Helicobacter pylori infection has on iron-defi- ciency in children in rural Alaska. J Infect Dis 193:537-46, 2006

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FEBS letter 480:147-50, 2000

8) Pigeon C, Ilyin G, Courselaud B, et al. A new mouse liver- specific gene, encoding a protein homologous to human antimicrobial peptide hepcidin, is overexpressed during iron overload. J Biol Chem 276:7811-9, 2001

9) Shike H, Lauth X, Westerman ME, et al. Bass hepcidin is a novel antimicrobial peptide induced by bacterial challenge.

Eur J Biochem 269:2232-7, 2002

10) Weinstein D, Roy C, Fleming M, et al. Inappropriate

－ 이홍기: 철분결핍성 빈혈 환자에 있어서 헬리코박터 제균치료가 Hepcidin의 농도에 미치는 영향 －

-S 595 - expression of hepcidin is associated with iron deficiency anemia: implications for the anemia of chronic disease. Blood 100:3776-81, 2002

11) Nicolas G, Bennoun M, Devaux I, et al. Lack of hepcidin gene expression and severe iron overload in upstream stimulatory factor (USF2) knockout mice. Proc Natl Acad Sci USA 98:8780-5, 2001

12) Dallalio G, Fleury T, Means RT, et al. Serum hepcidin in

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2004

14) Kulaksiz H, Gehrke SG, Janetzko A, Rost D, Bruckner T, Kallinowski B, et al. Pro-hepcidin: expression and cell-specific localization in the liver and its regulation in hereditary hemochromatosis, chronic renal insufficiency, and renal anemia. Gut 53:735-43, 2004