MPO Gene Polymorphism in Behcet's Disease

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Vol. 12, No. 2, June, 2005

베체트병에 있어 MPO 유전자 다형성

경북대학교 의과대학 내과학교실, 경북대학교병원 의학연구소*

조장희․김성욱․서재석․강봉석*․남언정․강영모

= Abstract =

MPO Gene Polymorphism in Behcet’s Disease

Jang Hee Cho, M.D., Sung Uk Kim, M.D., Jae Seok Seo, M.D., Bong Seok Kang, Ph.D.*, Eon Jeong Nam, M.D., Young Mo Kang, M.D.

Department of Internal Medicine, Kyungpook National University School of Medicine, Medical Research Institute, Kyungpook National University Hospital*, Daegu, Korea

Objective: Behcet’s disease (BD) is a systemic vasculitis in which hyperfunction of neutrophils is one of the major pathophysiologic features. Myeloperoxidase (MPO) is an important neu- trophilic lysosomal enzyme and has been implicated in tissue damage of BD. As the A allele of -463G/A polymorphism of the MPO gene is associated with diminished activity of MPO, we analyzed the association of -463G/A polymorphism of the MPO gene with BD.

Methods: We analyzed -463G/A polymorphism of the MPO gene in BD patients (n=101) and controls (n=138). Genotype of the MPO gene at position -463 was determined by PCR-RFLP assay using genomic DNA.

Results: The allele frequency of -463G/A polymorphism of the MPO gene did not deviate from the Hardy-Weinberg expectation in both BD patients and controls. There were no statistically significant differences in genotype distribution and allele frequency between patients and controls at position -463 (p=0.761 and p=0.549 respectively). Analysis of genotype distribution and allele frequency of the -463G/A according to sex did not show any difference between patients and controls. There were no statistically significant differences in clinical manifestations of BD among different genotypes.

Conclusion: The present data indicate that the -463G/A polymorphism of the MPO gene was not associated with the susceptibility to and clinical manifestations of BD in Korea.

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＜접수일：2004년 12월 17일, 심사통과일：2005년 5월 14일＞

※통신저자：강 영 모

대구시 중구 삼덕 2가 50번지 경북대학교병원 류마티스내과

Tel：053) 420-5495, Fax：053) 420-2046, E-mail：[email protected]

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서 론

베체트병은 반복되는 구강 및 성기 궤양, 포도막 염 및 피부 병변을 특징으로 하는 만성 염증성 질환 으로서 혈관, 관절, 폐, 중추신경계를 비롯하여 위장 관계까지 침범할 수 있는 전신적인 혈관염이다¹⁾. HLA-B51은 베체트병의 유전적 요인으로 잘 알려져 있는데 베체트병 환자군에서 양성 빈도가 13∼81%

로 보고되어 있고, 베체트병의 감수성 및 중증도와 관련이 있다는 보고^2,3)도 있다. 그러나 베체트병의 유전적 감수성에 대한 HLA-B51의 기여도는 20% 미 만으로⁴⁾ 감수성 결정에 관여하는 non-MHC 유전 인 자가 있을 것으로 추정된다.

중성구가 외부의 자극에 의해 활성화되면 리소좀 내의 myeloperoxidase (MPO)의 방출이 증가하게 되 고 MPO는 과산화수소와 염소 이온을 촉매반응시켜 차아염소산을 생성한다⁵⁾. 차아염소산은 살균 효과를 가져 선천성 면역 방어 기전에 관여하지만⁶⁾, 동시에 적혈구의 용해를 일으키고 세포막의 지질과 단백을 변성시키는 작용을 통해 숙주 조직의 손상을 일으킬 수 있다⁷⁾. 베체트병에서 보이는 혈관염 조직에는 활 동성이 과도하게 항진된 중성구가 침윤되어 있으며⁸⁾ 베체트병 환자의 말초혈액에서 분리된 중성구는 과 산화수소 생산 능력이 증가되어 있을 뿐 아니라 주 화성이 높고 탐식 작용이 항진되어 있는 등 세포 활 성이 항진되어 있다고 알려져 있다^9,10). 치료받지 않 은 활동성의 베체트병 환자군 혈장에서 측정한 MPO 농도가 비활동성 베체트병 환자군의 MPO 혈 중농도보다 높다는 보고¹¹⁾는 중성구의 활성화 및 그 에 따른 MPO 생성의 증가가 베체트병의 병인기전 에 중요하다는 것을 뒷받침한다.

MPO 유전자의 promoter 부위에 있는 -463G/A 다 형성은 SP1 전사 인자의 결합 부위를 변형시킴으로 써 MPO 단백 발현에 영향을 미치며, A 대립형질은 단백 발현을 감소시킨다고 알려져 있다¹²⁾. 폐암¹³⁾, 관상동맥질환¹⁴⁾, 다발성 경화증¹⁵⁾, 알츠하이머병¹⁶⁾, 급성 골수성 백혈병¹⁷⁾ 그리고 ANCA (antineutrophilic cytoplasmic antibody)와 관련된 혈관염¹⁸⁾ 등에서 MPO 유전자의 -463G/A 다형성과의 관련성에 대한 연구 들이 보고되어 있으나, 베체트병에서는 MPO 유전자

의 -463 다형성에 대한 연구는 아직 보고되어 있지 않다.

본 연구에서는 MPO 유전자의 -463G/A 다형성과 베체트병에 대한 감수성의 연관성을 조사하였으며, 베체트병의 임상양상과 MPO 유전자형과의 상관관 계에 대해서도 연구하였다.

대상 및 방법 1. 대상

2002년 2월부터 2003년 10월까지 경북대학교병원 류마티스내과를 방문한 환자 가운데 1990년 Interna- tional study group for Behcet’s disease의 진단기준¹⁹⁾ 을 만족하는 베체트병 환자 101명을 대상으로 하였 다. 대조군은 설문을 통해 고혈압, 당뇨병 및 자가면 역 질환 등의 병력 및 가족력이 없는 건강한 성인 138명을 대상으로 하였다.

베체트병 환자군의 연령은 39.2±9.1세였고, 남녀 비는 1.2：1으로 남자가 많았다. 대조군의 연령은 33.6±9.1세였으며 남녀비는 0.8：1이었다.

2. PCR-RFLP법을 이용한 유전자형 결정

말초혈액에서 단핵구를 분리한 후 표준방법을 이 용하여 DNA를 분리하였다. MPO 유전자에 있어 promoter 부위의 -463G/A를 포함하는 염기서열 부 분을 PCR을 이용하여 증폭시켰다. 각 PCR 반응액은 25μL였고, 1×Taq polymerase buffer, 각각의 primer 0.5μmol/L, dNTP 0.75 mmol/L, Taq polymerase 0.5 unit 및 DNA 50 ng을 포함하였다. 95ôC에서 10분간 변성시킨 후 다음 반응 조건에서 30 cycle을 반응시 켰으며, 반응 조건은 95ôC에서 30초 간 변성, 55ôC에 서 45초 간 annealing, 72ôC 30초 간 extension 시켰고 이후 72ôC에서 10분간 연장시켰다. 유전자형은 res- triction fragment length polymorphism (RFLP)법을 이 용하여 결정하였으며 증폭된 DNA를 5 unit의 Aci I (New England Biolabs, Beverly, MA, USA)를 이용하 여 37ôC에서 3시간 동안 절단한 다음, 2% agarose gel로 전기영동하였다.

3. 임상 양상의 분류

베체트병의 진단기준에 포함되는 구강 궤양, 성기

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궤양, 피부 소견, 염증성 안질환 외에도 혈관 질환, 근골격계 질환, 신경계 질환 및 위장관계 질환의 유 무에 대해서도 조사를 하였다.

혈관 질환에는 동맥염, 동맥류, 심부정맥 혈전증을 포함하였으며 근골격계 질환에는 관절부위의 부종, 압통 또는 열감이 있는 관절염의 경우만을 포함하였 다. 신경계 질환은 신경학적 증상이 있으면서 뇌 자 기공명영상 촬영 결과 뇌병변이 있는 경우를 포함하 였다. 위장관계 질환은 장천공의 과거력이나 혈변이 있거나 상부 위장관 및 대장 내시경에서 궤양이 발 견된 경우를 포함하였다.

베체트병의 임상적인 중증도를 정량화하기 위하여 성기 궤양, 피부 소견, 염증성 안질환, 혈관 질환, 근 골격계 질환, 신경계 질환 및 위장관계 질환 등 7가 지 소견 가운데 각 환자에게 동반된 항목을 계산하 였으며 이를 유전자형에 따라 비교 분석하였다.

4. 통계처리

실험 결과는 평균±표준편차로 표시하였고, 통계 처리는 SPSS (statistical package for the social sci- ence) 10.0 for Windows를 사용하였다. 대립형질의 빈도는 측정된 유전자형의 수를 근거로 계산하였고, 유전자형의 분포가 Hardy-Weinberg 평형에 따르는 지 확인하기 위하여 chi-square 검정을 이용한 적합 도 검사를 시행하였다. 베체트병 환자군과 대조군 사이의 유전자형과 대립형질의 빈도의 차이는 Fisher 의 정확한 검정을 이용한 교차검정으로 분석하였으 며 유의성은 p＜0.05로 하였다.

결 과 1. MPO -463G/A 다형성과 베체트병

베체트병 환자의 임상 소견은 표 1과 같았다. 베 체트병 환자군과 대조군 모두에서 MPO -463G/A 다형성 부위의 유전자형의 분포는 Hardy-Weinberg 평형에서 벗어나지 않았다. MPO -463G/A의 유전 자형의 분포는 베체트병 환자군에서 GG, GA, AA형 이 각각 77.2%, 21.8%, 1.0%이었고, 대조군에서는 각 각 81.2%, 18.1%, 0.7%로 두 군에서 모두 GG 동형 접합체의 빈도가 가장 높았다(표 2).

2. 성별에 따른 유전자형과 베체트병과의 관계

환자군과 대조군을 성별로 나누어 유전자형을 비 교하였을 때 남성의 경우에는 베체트병 환자군에서 -463G/A의 유전자형의 분포는 GG, GA, AA형이 각 각 76.4%, 23.6%, 0%이었고, 대조군에서는 74.2%, 24.2%, 1.6%이었으며, 여성의 경우에 베체트병의 유 전자형의 분포는 GG, GA, AA형이 각각 78.3%, Table 1. Demographic and clinical features of the patients

with BD

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BD (n=101)

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*Values are expressed as mean±S.D. ^†HLA-B genotype was determined in 77 patients

Table 2. MPO genotype distributions (%) and allele frequencies in patients with BD and controls

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G⁴⁶³→A polymorphism

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BD (n=101) 78 (77.2) 22 (21.8) 1 (1.0) 0.881 0.119

Controls (n=138) 112 (81.2) 25 (18.1) 1 (0.7) 0.761 0.902 0.098 0.549 ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ

*p-values refer to genotype distribution, ^†p-values refer to allele frequency

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19.6%, 2.2%이었고, 대조군에서는 86.8%, 13.2%, 0%

이었다. A 대립형질의 우성유전 분석 결과도 통계적 으로 유의성이 없었다(표 3).

3. 임상 양상에 따른 유전자형과 베체트병과의 관 계

베체트병 환자군에서 임상양상을 유전자형에 따라 비교하였으며 AA형을 가진 환자는 환자군과 대조군 에서 각각 1명씩만 있어 GA형과 AA형을 한 군으로 합하여 분석하였다. GG형과 GA+AA형에서 각각 성기 궤양은 66.7% 및 69.6%이었고, 염증성 안질환

은 66.7% 및 69.5%, 피부 소견은 38.5% 및 34.8%으 로, 베체트병의 진단 기준에 해당하는 증상들은 유 전자형에 따라 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않 았다.

GG과 GA+AA형에서 혈관 질환은 각각 23.1% 및 21.7%이었으며, 골격계 질환 28.2% 및 34.8%, 신경 계 질환 3.8% 및 4.3%, 그리고 위장관계 질환 20.5%

및 21.7%로 기타 장기의 침범 소견은 유전자형에 따라 통계적으로 유의한 차이가 없었다.

베체트병에서 침범된 장기의 수는 양 군에서 각각 2.69±0.93 및 2.78±1.00으로 유전자형에 따른 중증

Table 4. Clinical features according to MPO genotypes in patients with BD

G⁴⁶³→A polymorphism

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Genital ulcerations 52 (66.7) 16 (69.6) NS

Skin lesions 69 (88.5) 21 (91.3) NS

Ocular lesions 30 (38.5) 8 (34.8) NS

Vascular lesions 18 (23.1) 5 (21.7) NS

Arthritis 22 (28.2) 8 (34.8) NS

Central nervous system lesions 3 (3.8) 1 (4.3) NS

Gastrointestinal lesions 16 (20.5) 5 (21.7) NS

Organ involvement (≥2)* 24 (30.8) 8 (34.8) NS

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*Organ involvement (≥2) means the number of patients who have more than two organ involvements, which include genital ulceration, skin lesion, ocular lesion, vascular lesion, arthritis, central nervous system lesion and gastrointestinal lesion

Table 3. The genotype distribution of MPO according to gender in BD

G463→A polymorphism

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Male G/G G/A A/A p-value* G allele p-value^†

BD (n=55) 42 (76.4) 13 (23.6) - 0.882

Control (n=62) 46 (74.2) 15 (24.2) 1 (1.6) 1.000 0.863 0.700 ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ

G463→A polymorphism

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Female G/G G/A A/A p-value* G allele p-value^†

BD (n=46) 36 (78.3) 9 (19.6) 1 (2.2) 0.880

Control (n=76) 66 (86.8) 10 (13.2) - 0.289 0.934 0.163 ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ

*p-values refer to genotype distribution, ^†p-values refer to allele frequency

(5)

도의 차이는 없었고, 침범된 장기의 수에 따라 분류 하여 2개 이상의 장기를 침범한 빈도 역시 유전자형 과 무관하게 유사한 분포를 보였다(표 4).

고 찰

본 연구에서 조사한 MPO 유전자 promoter 부위의 -463G/A 다형성과 베체트병과는 유의한 관련성을 보이지 않았고 성별로 나누어 비교하였을 때에도 유 의한 차이는 없었으며 유전자형에 따른 임상 양상의 분포에도 차이가 없었다.

MPO는 중성구의 리소좀 내에 존재하는 효소로서 단핵구에서도 일부 존재하나 단핵구가 탐식구로 성 장하게 되면 없어지게 되므로²⁰⁾, 성숙한 중성구에만 존재하는 특이적인 효소이다. 또한 MPO의 촉매반응 으로 발생하는 차아염소산은 중성구에서만 생성되는 산화물로서²¹⁾ 조직 손상에 직접적으로 관여하는데 염증 상태에서는 이동한 중성구에서 활성형의 MPO 가 분비되므로 염증 진행에도 관여한다⁷⁾.

MPO 유전자는 17번 염색체에 위치하며 12개의 exon과 11개의 intron으로 구성되어 있는데, MPO 유 전자의 promoter에 위치한 -463G/A 다형성에서 G 대립형질은 SP1 결합 부위를 포함하고 있어 강한 promoter 활성을 가지는 데 비하여, A 대립형질은 SP1 결합 부위를 변형시켜 estrogen이 결합하도록 함 으로써 MPO 유전자의 발현을 감소시킨다¹²⁾. MPO 유전자의 -463G/A 다형성은 MPO 생산에 영향을 미침으로써 MPO와 관련된 질환들의 발병에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다^13-18). 급성 골수성 백혈병 과 폐암에서는 MPO가 생성한 산화 자유 라디칼이 DNA의 돌연변이나 전위를 일으켜 암 발생을 유발 할 것으로 추정된다^13,17). 알츠하이머병에서는 MPO가 생성한 산화물들이 뇌세포의 지질 변성에 관여함으 로써 세포 손상을 일으키며¹⁶⁾, 동맥경화증에서는 MPO에 의해 산화된 저밀도 지단백이 세포내에 축 적되어 대식세포를 포말세포로 변형시킴으로써 동맥 경화반의 형성에 관여한다고 보고되어 있다¹⁴⁾. 베체트병은 여러 장기에 혈관염을 유발하는 자가 면역 질환으로 중성구의 활동성이 과도하게 항진되 어 있다는 연구들이 보고되어 있다. Pathergy 검사에 의한 피부 병변을 포함하여 베체트병에서 보이는 병

변 조직에는 감염의 증거 없이 중성구가 침윤되어 있고⁸⁾, 환자의 말초혈액에서 분리된 중성구는 활동 성과 이동성이 항진되어 있는 점들을 고려할 때 비 특이적 자극이나 내부항원에 대한 면역 반응이 일어 나는 곳에 중성구의 침윤이 항진되어 있을 가능성이 있으며 이는 MPO 생산과 베체트병의 발병에 연관 성이 있을 가능성을 시사한다.

베체트병에서 혈액내 MPO 농도가 정상인에 비해 높을 뿐 아니라 치료받지 않은 활동기에는 치료 후 활동성 혹은 비활동성 질환에 비해 더 높고, 활동기 에 분리한 말초 혈액 중성구 배양에서 MPO 생산량 이 비활동기에 분리한 중성구에 비해 더 많다는 연 구결과¹¹⁾는 중성구가 활성화됨에 따라 세포 표면에 발현되는 MPO가 활동성 베체트병에서 더 많다는 것을 시사한다. MPO 생산이 많은 유전적 경향이 있 을 경우 중성구 활성화 후 MPO 분비가 더 많아져 조직 손상에 관여하는 차아염소산 등의 물질의 생산 이 높고 베체트병의 염증도 더 쉽게 일어날 가능성 이 있을 뿐 아니라 혈관염 등의 조직손상도 심하게 동반될 가능성도 있을 것으로 추정된다. 저자들은 MPO 생산에 영향을 미치는 것으로 알려진 -463G/A 다형성과 베체트병의 관계에 대하여 연구하였으나 베체트병과의 관련성이 없었으며 각 유전자형에 따 른 임상적 소견도 차이를 보이지 않았다. 베체트병 환자의 경우 정상인에 비해 TNF, IL-1β 그리고 IL-8 등의 혈중 농도가 증가되어 있는데^22-24) 이와 같은 사이토카인은 중성구의 활성화에 관여하며 내피세포 에서 세포부착분자의 발현을 증가시켜 중성구의 이 동을 촉진함으로써 염증반응을 항진시킨다. TNF 유 전자 다형성의 연구에서 단핵구의 TNF 생성에 영향 을 미치는 것으로 알려진²⁵⁾ LT α NCo 1 유전자형이 베체트병의 안구 침범의 발병과 유관한 것으로 보고 되어 있으며²⁶⁾, IL-1 유전자 집단의 다형성 연구에서 IL-1A -889C와 IL-1B +5887T 대립형질은 베체트 병의 감수성과 관련있는 것으로 보고되었다²⁷⁾. 베체 트병의 병인에서 중성구의 활성화에 관여하는 사이 토카인 유전자들의 다형성이 연구보고 되고 있는 사 실을 고려할 때, 베체트병에서 보이는 중성구의 활 성화 및 MPO 혈중 농도의 증가 등은 이들 사이토 카인에 의한 영향 때문일 가능성도 있으며 중성구는 하위단계에서 작용하는 세포로서 중성구의 생성도를

(6)

반영하는 MPO의 유전자 다형성이 베체트병의 감수 성이나 임상 양상과 직접적으로는 관련되어 있지 않 을 개연성이 있다.

한편으로 MPO의 생산에 영향을 미치는 MPO 유 전자의 다른 단일핵산다형성들이 베체트병과 관련 있을 가능성을 배제할 수 없다. 최근의 연구에서 -463 다형성 외에도 -129G/A 다형성의 경우 A 대 립형질은 MPO 혈중 농도의 감소와 관련되어 있

어^28,29) 베체트병의 감수성이나 중증도와 관련 있을

가능성이 있으므로 향후 MPO 유전자에 있는 다른 단일핵산다형성에 대한 연구가 필요할 것으로 생각 한다.

결 론

베체트병은 다장기적 혈관염으로 병태생리에서 중 성구의 활동성이 항진되어 있다. MPO는 중성구에서 중요한 역할을 하는 리소좀 효소이며 베체트병에서 나타나는 조직 손상과 관련이 있으며 MPO 유전자 의 -463G/A 다형성에서 A 대립형질은 단백 발현을 감소시킨다고 알려져 있다. 저자들은 MPO 유전자의 -463G/A 다형성이 베체트병의 감수성과 임상 양상 에 미치는 영향에 대해서 연구하였으나 유의한 관련 성을 보이지 않았다.

감사의 글

이 연구는 1997년도 경북대학교병원 의학연구소 연구비의 지원으로 이루어졌음.

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