메티실린 내성 포도알균의 accessory gene regulator군 다형태 및 항생제 감수성과의 관계
가톨릭대학교 의과대학 내과학교실
이 동 건
Figure 1. The schematic diagram of Staphylococcus aureus accessory gene regulator (agr) locus (A) and the relationship between bacterial growth and the transcriptional change of associated genes (B).
Introduction
황색포도알균(Staphylococcus aureus)은 지역사회 및 병원 감염의 중요한 원인균으로 알려져 있다. 전세계적으로 항 생제 내성이 사회문제화 되고 있고 메티실린 내성 황색포 도알균(methicillin resistant S. aureus, 이하 MRSA)의 증가로 내성전파, 치료실패와 의료비증가 등 많은 문제를 일으키 고 있다. 또한 의학의 발전으로 악성종양, 장기이식 등으로 인한 면역저하환자에서 발생하는 S. aureus 감염 치료를 위 해 장기간 항균제를 사용하면서 치료제인 vancomycin에 감 수성이 저하되거나 내성인 균주가 보고되기 시작하였고, 치료에 반응하지 않는 증례가 나타나고 있다. 국내에서 분 리되는 S. aureus의 내성은 매우 심각한 상태이다. 1997년 대한병원감염관리학회에서는 전체 S. aureus 감염증의 70%
가 MRSA로 내성률이 가장 높은 나라 중에 속하고 1, 2차 병원에서도 S. aureus 감염증에서 MRSA가 차지하는 비율 이 높다고 보고하였다. MRSA의 대부분은 병원이나 보건관 리와 관련된 시설, 환경에서 획득된 것으로 고령, 최근 입 원병력, 투석, 정맥주사, 장기요양기관 재원, 최근의 항균제 사용, 면역저하 등 위험인자가 있는 경우에 주로 발생하고 있지만(hospital or health care-associated MRSA, HA-MRSA) 이제는 위의 위험인자가 없고 건강했던 환자들에게서도 지 역사회획득 메티실린 내성 황색포도알균 (community associated MRSA, CA-MRSA)이 퍼져가고 있다(Fridkin et al, 2005). 이에 따라 vancomycin등의 항균제가 널리 사용될 수 밖에 없고 이는 heterogenous vancomycin intermediate S.
aureus (hVISA), VISA, vancomycin resistant S. aureus (VRSA)의 발생가능성이 높아지고 있음을 의미한다.
최근 S. aureus accessory gene regulator (agr) operon에 대 한 연구가 진행되고 있는데 이는 virulence, metabolism, transport, degradation pathway에 관여하는 수많은 유전자 발 현을 조절하는 two-way quorum sensing system (up-and down regulation)이다. 이 유전자군은 hdl, agrB, agrD, agrC, agrA
로 구성되어 있고, agrB, agrC, agrD는 hypervariable region 이어서 유전자 다형태(polymorphism)가 존재한다(그림 1A).
agr operon이 활성화 되면 hemolysin, exoprotein, exotoxin등 분비되는 독성인자(secreted virulence factors) 생산이 증가하 고, adhesin등 세포관련 독성인자(cell associated virulence factor)의 생산은 감소한다(그림 1B). 또한 agrB-D-C 유전자 다형태에 의해 4개의 주요 agr group으로 분류할 수 있다 (agr group I-IV). 최근 연구는 agr군은 특정질환과 연관된다 고 보고하고 있고, 지역에 따른 agr군 분포차이도 있다. 또 한 glycopeptide 내성이 agr 유전자 조절정도에 따라 영향을 미친다는 연구보고뿐만 아니라, hVISA나 VISA의 연관성이 agr군에 따라 차이가 있다는 보고도 있다. 예를 들면 지역
Figure 2. Molecular Characteristics of each MRSA major epidemiological clusters. It is visualized by PFGE patterns using representative strains of each cluster.
사회획득 MRSA는 agr III, VISA는 agr II, exfoliatoxin 생성 주는 IV 군과 관련되어 있다는 보고와, 치료제로 사용되는 vancomycin의 혈중농도가 부적절할 경우 agr 군에 따라 내 성이 유발되고, 특히 agr 기능이상 균주에서 이런 현상이 두드러지게 나타난다고 최근 보고되고 있다.
agr 다형태에 대한 외국연구는 임상특성, in vitro 및 in vitro infection model을 이용한 모의(模擬)였고, 국내 연구는 시작단계로 지금까지 단일 병원에서 임상적 특징과의 연관 성을 보고하였을 뿐이다. 연구자는 국내에서 동정되는 황 색포도알균을 대상으로 agr 다형태군 분포와 독성인자를 파악하고, vancomycin 등의 몇 가지 항균제의 감수성과 agr 각 군의 관계, 임상효과에 따른 차이를 분석하여 효과적인 치료전략을 수립하는데 도움이 되고자 하였다.
Materials & Methods 1. 균주 수집 및 항균제 감수성 검사
박 등의 연구에 사용되었던 137 균주 중 분자역학클러스 터에 분류된 129 균주가 사용되었다. 지역사회관련 메티실 린내성 균주 (CA-MRSA) 정의에 따라 각 균주들은 지역관 련 (CA) 및 병원관련 (HA) MRSA 균주로 분류되었다. 또한
Mu50주와 질병관리본부에서 분양받은 VISA 4주(VISA222, 335, 521, 605)를 같이 실험하였다. Oxacillin, vancomycin, ciprofloxacin, erythromycin, clindamycin, trimethoprim-sulfame- thoxazole, gentamicin, arbekacin, rifampin 등에 대한 감수성 검사를 CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute, 2006)의 기준에 따라 디스크확산법으로 실시하였다. Vancomycin에 대한 최소억제농도(Minimum inhibitory concentration, MIC) 측정은 CLSI (2006)의 방법을 따라 액체배지 희석법을 사 용하여 실시하였다. 정도관리를 위한 균주로는 S. aureus ATCC 29213을 사용하였다.
2. 분자 역학 연구 및 독소 유전자 분포 연관성 연구 PFGE 데이터를 제외하고 균주들의 분자역학 결과 (MLST, spa typing, SCCmec type)는 과거의 연구결과로부터 도출하여 분석하었다. PFGE는 NCTC8325 균주로 normali- zation하여 실시하였는데, PFGE gel image는 Fingerprinting II informatix software (BioRad, Hercules, CA, USA)를 통해 각 균주들의 패턴을 clustering하였으며 similarity 80% 이상으 로 pulsotyping하였다. Jarraud 등이 실시한 enterotoxins, enterotoxin gene cluster (egc), etb, eta, lukS-PV-lukF-PV, γ -hemolysin variant (hlg-v), TSST gene, EDIN gene, γ
MRSA Molecular Epidemiological Clusters
(No. of isolates)
Antibiotics resistance (%)
GEN ABK CIP CLI ERY TET RIF SXT
agr II-ST5-SCCmec II (41) agr I-ST72-SCCmec IVA (32) agr I-ST239-SCCmec III (26)
agr III-ST1-SCCmec IV (23) agr III-ST89-SCCmec II variant (7)
95.1 3.1 100 100 85.7
0 0 7.7
0 0
100 0 92.3
0 0
87.8 3.1 80.8
0 71.4
100 50.0 100 91.3 100
48.8 0 92.3 56.5 0
0 0 7.7
0 0
2.4 0 57.7
0 0 Table 1. The antibiotics susceptibility of MRSA molecular epidemiological clusters
-hemolysin (hlg)등에 대한 PCR을 이용하여 모든 유전자의 독성인자 보유 유무를 확인하였다.
3. Accessory Gene Regulator (agr) group 연구 agr locus는 pan_1n (5′-accagtttgccacgtatc-3′) 및 pan_2n (5′-taaaccacgaccttcacc-3′)의 primer를 이용하여 agr hyper- variable region (agr BDC locus; ～1.8 kb)을 증폭하였다. agr grouping을 위한 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)를 실시하였는데, DraI, AluI 등의 제한효소를 이용 하여 증폭된 PCR product에서 절단한 다음 2% low melting agarose 전기영동을 통해 결과를 분석하였다. 또한 증폭산 물은 auto-sequencing 방법으로 염기서열을 분석하였다.
4. Vancomycin 감수성에 대한 Population Analysis Profile (PAP)
음성대조군 ATCC 25923, 양성대조군 Mu50을 같이 실 험하였다. 또한 질병관리본부 약제내성팀으로부터 분양받 은 VISA 4 균주들의 PAP를 실시하였다. 각 균주들을 tryptic soy broth에서 24시간 배양 후 107-8 CFU/mL 농도가 되도록 배양액을 생리식염수로 희석하고 vancomycin 1-10 μg/mL가 함유되어있는 brain-heart infusion agar에 접종하여 37℃, 48시간 동안 배양 후 생균접종수를 계산하였다. 각 농도별 생균수 그래프를 그리고 area-under-the curve (AUC) 를 계산하였다.
Results & Discussion
1. MRSA 임상분리주의 분자역학 클러스터 특징과 agr 그룹간의 연관성 연구
MRSA 임상분리주들은 MLST, SCCmec type을 근간으로
그룹화하였다(그림 2). 이들 그룹들은 spa complex, PFGE type 등에 일치하는 경향을 나타내고 있었다. 총 6개의 그 룹으로 나뉘어지는데, 가장 많이 분포되어 있는 ST5- SCCmec II 그룹으로 agr II type을 가지고 있었으며, toxic shock syndrome에 관여된 tst-egc 독소를 주된 특징이었다.
ST72-SCCmec IVA군은 CA-MRSA에서 가장 많이 분포되 어 있었으며, agr I type 이었다. 그리고 이들은 egc variant 를 가지고 있는 것이 가장 큰 특징이었다(그림 2). ST239- SCCmec III (sea)과 ST239-SCCmec IIIA군은 agr I type, ST1-SCCmec IV군 (seh)과 ST89-SCCmec II 혹은 NT군 (etb) 은 agr III type 이었다(그림 2). agr IV 형은 국내에서 매우 드문 형으로 국내 MRSA 감염증에 주된 역학군에는 존재 하지 않았다. HA 균주에서는 agr II군이 가장 많이 분포하 고 있었으며, CA 균주에서는 agr I군이 주된 균주였다. 위 의 결과를 종합적으로 판단할 때, 특정 분자역학군들은 고 유의 agr 형을 가지고 있는 것으로 판단되었다.
2. Molecular epidemiological groups의 항생제 감수 성 및 Vancomycin MIC
각 역학 그룹들의 항생제 감수성을 살펴볼 때, 국내 HA 주요 형인 agr II-ST5-SCCmec II 및 agr I-ST239-SCCmec III 군은 모두 다제 내성을 나타내었다(표 1). 이들 균주들은 vancomycin 감수성이었으며 주된 VAN MIC는 1-2 μg/mL (range; 0.5-2 μg/mL) 이었다. CA 균주의 주요 군인 agr I-ST72-SCCmec IVA그룹은 항생제 내성이 많지 않았다(표 1). 이들의 VAN MIC는 주로 ≤0.5 μg/mL (range; 0.25-1 μg/mL) 이었다.
나머지 agr III에 속하는 균주들은 CA 및 소아청소년 환 자에서 많이 분리되는 균주로, 중간 정도의 항생제 내성을 나타내었다(VAN MIC range; 0.5-2 μg/mL) (표 1).
Figure 4. Multiple Alignment analysis of Agr A amino acid sequences from VISA strains by ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html). Differences from the Agr A of typical agr II type (DQ157968) are shown in the boxes.
Population Analysis Profiles of Vancomycin Susceptibility
VAN Conc. ug/mL
0 2 4 6 8 10 12
Log CFU/mL
0 2 4 6 8 10
VSSA Mu50 VISA222 VISA335 VISA521 VISA605
Mu50 VSSA
Domestic VISA
Figure 3. Population analysis profiles of VSSA, domestic VISA, and homogenous VISA.
3. Vancomycin 감수성에 대한 PAP 및 agr locus의 유전자 변화
질병관리본부 약제내성팀으로부터 분양받은 VISA 4주와 대표적인 homogenous VISA 균주인 Mu50를 비롯하여 임상 분리주에 대한 PAP를 실시하였다. VAN 0-10 μg/mL 에서 의 각 CFU 값은 log10으로 전환하여 AUC를 측정하였는데,
Mu50은 54.36±2.87 이었으며, 국내 VISA 균주들의 평균값 은 35.71±4.17 이었다(그림 3). 실험에 사용된 임상분리주들 은 VISA 균주들의 AUC 평균값의 ratio 0.9 이하인 VSSA로 판정되었다. VSSA는 VAN 1-2 μg/mL 이후 급격히 viability 가 떨어지는 경향을 나타내었으며, 국내에서 분리된 VISA 들은 3-4 μg/mL 가 지나면서 급격히 떨어졌다(그림 3).
Homogenous VISA인 Mu50은 4 μg/mL에 떨어지기 시작하 여 10 μg/ml까지 다른 VISA 균주에 비해 완만히 떨어지는 경향을 보였다(그림 3).
agr locus 변화와 vancomycin 감수성과의 관계를 살펴보 기위하여, agr locus의 염기서열들을 분석하였는데, 이번 연 구에 사용된 임상분리주들(VSSA)의 agr 염기서열 등은 전 형적인 염기서열과 큰 차이를 발견할 수 없었다. 하지만 전 형적인 염기서열은 질병관리본부로부터 분양받은 국내 VISA 균주들과 대조군으로 사용되는 homogenous VISA인 Mu50의 염기서열과는 여러 차이를 나타내고 있었다. Mu50 의 agr type은 II형이었고, 국내 VISA 균주 중 두 균주(V222, V335)는 Mu50과 같은 II형, 한 균주 (V521)는 I형이었으며, 나머지 한 균주(V605)는 agr locus가 증폭이 안 되어 분석이 불가능하였다. agr 염기서열 분석에서, 특히 II형의 VISA 균주들은 Agr A 부분에서 두드러진 차이를 나타내고 있음
을 알 수 있었다(그림 4). 일반적으로 전형적인 II형의 Agr A 마지막 아미노산 서열은 Isoleucine (I)인데 반해, 여러 논 문에서 밝혀진 대로 Mu50은 Lysine (K)로 치환되어 있음을 알 수 있었다(그림 4). 하지만 다른 국내 VISA 균주들의 Agr A의 마지막 아미노산에서는 전형적인 아미노산 서열 (I) 과 동일하였다(그림 4). 그러나 각각 다른 돌연변이를 가 지고 있었는데, V222 agrA의 524번째의 T 염기서열은 deletion되어 frame shift가 일어나게 되었다(그림 4). 이후 아 미노산은 생성하지 못하는 결과로 이어질 것으로 예상되었 다. V335의 Agr A 아홉번째 아미노산은 aspartate (D) → Glyccine (G)로 치환된 것을 확인할 수 있었다(그림 4). agr I형 VISA인 V521은 II형 VISA 균주들과 달리 Agr C에서 두드러진 차이를 확인할 수 있었는데, 511번째 T 염기서열 이 deletion되어 frame shift가 일어났다. 불완전한 Agr C가 생성되어 agr 기능에 큰 영향을 줄 것으로 판단된다. agr 염 기서열 분석방법은 vancomycin 감수성 감소와 agr 기능간 의 관계 연구에 매우 유용하게 사용될 것으로 생각된다.
Conclusion
이번 연구에서 agr II형이 국내 HA 감염증 유행균주에서 가장 많이 분포하고 있으며 agr I형은 CA 감염증 균주에서 가장 크게 유행하고 있었다. agr 그룹은 분자 역학 그룹과 매우 긴밀한 연관성을 가지고 있어 agr typing은 분자역학 연구에 유효한 분석방법으로 판단된다. VISA 균주의 대부 분은 agr II형으로 알려져 왔는데, 비록 이번 연구에 사용된 임상분리주들은 모두 VSSA이었으나, 국내 HA 균주 주요 분자역학군 중 ST5-SCCmec II이 agr II형 그룹이므로 앞으 로 VISA 균주 출현 가능성에 주의가 필요할 것으로 생각된 다. 또한 이번 VISA 균주의 agr locus 염기서열 결과는 단 순한 돌연변이들이 agr 기능에 영향을 주어 vancomycin 감 수성 감소로 이어질 수 있다는 것을 보여준다. agr 기능뿐 만 아니라 다른 여러 영향들이 복합적으로 영향을 미치겠 지만, 이번 결과를 토대로 다른 영향과의 관계를 분석하는 데 도움이 될 것으로 판단된다.
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