Kor. J. Pharmacogn.
49(4) : 328∼ 335 (2018)
328
신규 건강기능식품소재 ‘EGCG 고함유 녹차추출물(EGTE)’의 장기안정성 평가
천세인1,2#·허은지1,2#·윤민지1,2·최상운3·류건식1*·유시용2,3*
1㈜알앤오식품, 2충남대학교 신약전문대학원, 3한국화학연구원
Evaluation for Long-term Stability of EGCG Rich Green Tea Extract (EGTE)
Se In Cheon1,2#, Eun Ji Heo1,2#, Min Ji Yoon1,2, Sang Un Choi3, Geon-Seek Ryu1*, and Shi Yong Ryu2,3*
1AlnO Food Inc., Jeonju 54810, Korea
2Graduate School of New Drug Discovery and Development, Chungnam National University, Daejeon 34134, Korea
3Korea Research Institute of Chemical Technology, Daejeon 34114, Korea
Abstract − ‘EGCG(epigallocatechin gallate) rich Green Tea extract(EGTE)’ was prepared by a convenient chromatographical manner using water and alcohol which was regarded as the most suitable and appropriate process for food manufacturing. The EGCG content in EGTE was estimated above 97%. Analysis of polyphenol components in green tea, i.e., catechin(C), epi- gallocatechin(EGC), epicatechin(EC), epigallocatechin gallate(EGCG), epicatechin gallate(ECG) and caffeine was performed by HPLC. The optimized HPLC method exhibited a good linearity of calibration curve, accuracy and precision. The long-term stability evaluation of EGTE was carried out with a powdered formulation and solution formulation by estimating the color change and measuring the EGCG content by HPLC analysis for one year. The EGCG content of the powdered EGTE stored in a transparent bottle at room temperature was retained over 97% at the end of the experimental period. The EGCG content of 0.1% water solution of EGTE stored in a transparent bottle at RT were observed to decrease below 30%, whereas that stored at 2oC retained over 70%, respectively. These results suggested that a powdered formulation could be recommended for the commercialized nutraceutical product of EGTE rather than a solution formulation.
Keywords − Camellia sinensis, EGCG, Green Tea Extract, HPLC, Stability
녹차나무 혹은 차나무(Camellia sinensis L)는 차나무과 (Theaceae) 동백나무속(Camellia)에 속하는 다년생 상록관목 으로 우리나라를 비롯하여 일본, 중국, 만주, 인도 등지에 널리 분포하고 있으며 예로부터 중국 등 동북아시아지역에 서 널리 재배되고 있다. 원산지는 중국 쓰촨성과 티베트 경 계의 산악지대 일대로 알려져 있으며, 국내에서는 신라 시 대에 당나라로부터 씨앗이 도입되어 지리산 일대에 최초로 식재되었다고 보고되고 있다. 이와 같은 연유로 현재 보성 군, 하동군을 둘러싼 지리산 일대에 대단위 차재배지가 조 성되어 있다.
녹차는 차나무의 잎을 말려 가공한 것으로 옛부터 중요한 기호음료로 애용되었으며 오늘날에도 커피와 함께 전세계 적으로 가장 대중적인 기호음료로 여겨지고 있다. 최근에는 국민소득의 증가와 더불어 녹차의 각종 생체조절기능성 및 약리학적 효능들이 속속 발표됨에 따라 녹차에 대한 인식 이 종래의 기호음료에서 건강기능성식품으로 전환되고 있 는 실정이다. 실제로 우리나라 식품의약품안전처(KFDA)에 서도 녹차 추출물을 항산화 효과, 체지방 감소, 체내 콜레 스테롤 개선 등을 주목적으로 하는 건강기능식품의 원료로 인정하고 있으며 현재 다수의 기업에서 녹차추출물을 가공 한 건강기능식품들이 출시되고 있다. 이러한 영향으로 국내 의 녹차 소비량는 크게 증가되고 있으며 녹차의 성분연구 를 비롯하여 다양한 생리활성조절기능 및 약리효능에 대한
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These two authors contributed equally to this work.
*교신저자(E-mail):info@alnofood.com, syryu@krict.re.kr
(Tel): +82-63-261-3682, +82-42-860-7163
연구가 광범위하게 이루어지고 있다.
녹차의 주요성분으로는 caffeine 및 흔히 차카테킨이라고 알려져 있는 polyphenol계 성분들이 일반적으로 잘 알려져 있다. 즉 녹차에 함유된 polyphenol 성분은 catechin 골격을 공통으로 가진 성분들이 주종을 이루고 있으며 catechin, epicatechin(EC), epigallocatechin gallate(EGCG), epigallo- catechin(EGC), epicatechin gallate(ECG) 등으로 구성되어 있으며 이들 4종 성분을 흔히 차catechin 성분이라고 부르 고 있다(Fig. 1). 이들 성분 이외에도 녹차에는 다양한 탄수 화물(섬유소, 전분, 덱스트린, 당, 팩틴), 단백질과 질소화합 물(아미노산, 아미드), 각종 식물성색소(엽록소, 카로틴, 키 산트필), 방향류(정유 성분), 유기산 성분(구연산 사과산, 호 박산), 지방산 성분(초산, 길초산), 비타민 성분(비타민 A, B1, B2, C, 니코틴산) 등이 보고되고 있으나 녹차의 다양한 생체조절기능성 및 약리효능은 대부분 차카테킨 성분에서 기인된 것으로 알려져 있다. 그동안 많은 국내외 연구진에 의하여 차카테킨 성분들의 항산화 효능,1) 등 다양한 약리효 능들이 꾸준히 보고되어 왔으며 특히 최근에는 노화억제효 능,2) 암전이억제효능,3) 항비만효능,4,5) 항당뇨효능,5,6) 동맥 경화 및 고혈압에 기인한 심혈관질환에 대한 약리효능,4) 이 상지질혈증 개선효능,1) 보습(humectant),7,8) 주름억제(anti- wrinkle),8,9)여드름(antiacne) 개선효능,7)기억력개선(memory-
improving),10)알쯔하이머증 개선효능(anti-Alzheimer),11)충 치위험감소 효능12) 등에 관하여 임상학적 효능시험를 통한 연구논문들이 다수 보고되고 있다. 한편 카테킨류의 일반적 인 분석법으로는 주석산철을 이용하여 함유되어 있는 tannin 성분을 간이 비색정량하는 방법이 알려져 있으나 최근에는 HPLC를 사용하여 catechin류를 분석하는 방법이 일반적으 로 널리 활용되고 있다.13,14,15,16)
한편 저자 등은 추출 및 가공과정 중 유기용매를 사용하 지 않고 물과 주정만을 사용한 간편 chromatography 방법 에 따라 녹차 열수추출물을 정제한 결과 caffeine은 전혀 함 유되지 아니하고 대표적인 차카테킨 성분으로 알려진 EGCG (epigallocatechin gallate)만 97% 이상 함유된 ‘EGCG 고함 유 녹차추출물’(EGTE: epigallocatechin gallate-rich green tea extract)을 고수율로 확보할 수 있는 제조공법을 개발하
였다.16,17)또한 본 제조공법에 따라 얻어진 ‘EGCG 고함유
녹차추출물’(EGTE )을 소재로 활용하여 다양한 건강기능식 품의 개발을 시도하고 있다. 이를 위하여 우선적으로 ‘EGCG 고함유 녹차추출물’(EGTE)을 서로 다른 실험조건(온도, 차 광유무 등)에 장기간 노출시킨 후 안정성의 변화를 조사 분 석함으로써 가장 적합한 보관조건 및 최종제품의 제형을 도 출하고자 본 연구를 수행하였다.
Fig. 1. Representative ingredients of green tea, five catechins and caffeine.
재료 및 방법
시약 및 분석기기 − HPLC는 Futecs HPLC system(NS- 3000i integrated HPLC System, AT-4000 Column Oven, Korea) 및 INNO column C18(4.6×250 mm, 5 µm)(영진바 이오크롬, Korea)을 사용하였다. HPLC 분석에 사용한 caffeine 및 (+)-catechin (C), (−)-epigallocatechin(EGC), (−)- epicatechin(EC), (−)-epigallocatechin gallate(EGCG), (−)- gallocatechin gallate(GCG), (−)-epicatechin gallate(ECG) 표준품 및 ascorbic acid (vitamin C)는 Sigma-Aldrich (MI, USA)사에서 구입하였다. HPLC용 용매는 J.T Baker(water, MeOH) 및 Tedia(acetonitrile)제품을 사용하였다.
녹차 물추출물 및 ‘EGCG 고함유 녹차추출물’의 조제 − 실험에 사용한 건조녹차는 2016년, 전남 보성산을 구매하여 시료로 사용하였으며 표준시료는 ㈜알앤오식품에 보관되어 있다. 시료 100 g에 증류수 1.5 L를 가한 후 60oC에서 6시 간씩 2회 반복추출하고 추출액은 여과지로 여과 후 여액 3 L을 Diaion HP-20 column(100 ml, ∅4.0×15 cm)에 서서 히 주입하여 흡착시켰다. 이후 Diaion HP-20 column을 증 류수로 수회 세척한 후 10% 주정, 20% 주정, 30% 주정 순 으로 단계적으로 용출시켰으며 기존에 보고된16,17) 방법에 따라 Diaion HP-20 column chromatography를 반복하여
‘EGCG 고함유 녹차추출물’(EGTE) 1.2 g을 얻었다.
HPLC를 이용한 ‘EGCG 고함유 녹차추출물’의 분석법 − HPLC 분석 전 시료 액은 0.45 µm syringe filter(0.45 mm HV, Durapore®)로 여과한 후 기기에 주입하였다. 이동상으 로는 0.1% acetic acid(A)와 acetonotrile(B)의 혼합액을 1.0 ml/min의 유속으로 용출시켰으며 용출용매의 acetonotrile 의 농도를 0분 10% B, 12분 15% B, 25분 30% B와 같이 기울기용리방식에 따라 실시하였다. 분석시 시료 주입량은 100 µl로 하였으며, Oven(AT-4000 Column Oven, Futecs)의 온도는 35oC로 유지하였다. 자외부흡광광도검출기(Model 500, Chrom Tech®)를 사용하였으며 검출파장은 280 nm로 정하였다. 자세한 HPLC 분석조건 및 이동상의 조건은 Table I에 나타내었다.
분석법 타당성 검증(Validation) − EGCG 표준품을 증류 수에 녹여 0.04%, 0.02%, 0.01%, 0.005% 농도 순으로 표준
액을 각각 조제한 후 각 농도별 피크의 면적비를 산출하고, 이를 바탕으로 검량선을 작성하였으며 검량선의 회귀방정 식과 상관계수(R²)를 구하였다. 또 각 농도의 표준액을 30 분 간격으로 4회 반복 측정한 후 피크의 면적비(peak area) 와 retention time을 각각 측정하였으며 이들 값의 상대표준 편차(RSD) 값을 산출하여 일내(intra-day) 정밀도(precision) 를 구하였다. 같은 요령으로 각 농도의 표준액을 3일 간격 으로 반복 측정하여 일간(inter-day) 정밀도(precision)를 구 하였다. 또 분석법의 정확성(accuracy) 판정을 위하여 농도 (0.04%, 0.02%, 0.01%, 0.005%)별로 조제한 검체를 4회 반 복 측정하고 peak area와 retention time의 평균값(mean) ± 표준편차(SD)를 구하였다. 또 통상적인 방법에 따라 signal to noise 비율(S/N ratio)를 바탕으로 검출한계(limit of detection, LOD)와 검량한계(limit of quantification, LOQ)를 산출하였다. EGCG 표준품과 함께 caffeine 및 (+)-catechin (C), (−)-epigallocatechin(EGC), (−)-epicatechin(EC), (−)- epigallocatechin gallate(EGCG), (−)-gallocatechin gallate (GCG) 및 (−)-epicatechin gallate(ECG) 표준품 용액을 Zhu 등18)의 방법에 따라 조제한 후 전술한 방법에 따라 HPLC 를 실시하여 타당성검증을 실시하였다.
‘EGCG 고함유 녹차추출물’ 검체의 조제 및 안전성 평 가 − ‘EGCG 고함유 녹차추출물’(EGTE) 시료의 안정성평가 는 분말상 시료 및 0.1% 수용액시료로 나누어 실시하였다.
분말상 시료는 투명용기 및 갈색용기에 나누어 담은 후 각 각 실온, 냉장(2oC) 및 냉동(-20oC)조건에서 보관하고 해당 평가일에 0.1% 수용액을 조제한 후 HPLC 분석법에 따라 EGCG의 함량을 측정하였다.
수용액상 시료를 대상으로 한 실험군은 보관조건에 따라 RL, RD, CD, VRL, VRD 및 VCD 등 총 6개의 군으로 나 누었으며 각 군은 동일한 두 개의 검체를 사용하여 duplicate 로 구성하였으며 측정치의 평균값을 구하였다. ‘EGCG 고 함유 녹차추출물’(EGTE) 시료 100 mg을 증류수 100 ml에 녹여 ‘EGCG 고함유 녹차추출물’ 0.1% 표준용액을 조제하 였다. 이 ‘EGCG 고함유 녹차추출물’ 0.1% 표준용액을 투 명용기에 4 ml씩 분주하여서 실온에 보관한 RL군, 동량의 표준용액 시료를 갈색용기에 분주 후 실온에 보관한 RD군, 갈색용기에 분주 후 냉장보관한 CD군으로 나누었다. 각 실 Table I. HPLC running condition for representative tea catechins and tea extract
Solvent elution : gradient manner with acetonitrile in 0.1% acetic acid
0-12 min : 10%, 12-25 min : 15%, 25-28 min : 30%, 28-30 min : 10%
Flow rate 1.0 ml/min
Detection UV detector (280 nm)
Column INNO column C18 (4.6 × 250 mm)
Column temperature 35°C
Injection volume 0.1 ml
험그룹의 안정성평가는 수용액의 색변화(갈변) 및 평가 당 일 HPLC 분석으로 측정한 EGCG의 함량을 지표로 설정하 여 진행하였다. 또, ‘EGCG 고함유 녹차추출물’(EGTE) 시 료 100 mg과 vitamin C(ascorbic acid) 50 mg를 섞은 후 증 류수 100 ml에 녹여 vitamin C 첨가 ‘EGCG 고함유 녹차추 출물’(EGTE) 0.1% 표준용액을 조제하였다. 이후 이 vitamin C 첨가 ‘EGCG 고함유 녹차추출물’(EGTE) 0.1% 표준용액 을 투명용기에 4 ml씩 분주하여서 실온에 보관한 VRL군, 동량의 표준용액 시료를 갈색용기에 분주 후 실온에 보관 한 VRD군, 갈색용기에 분주 후 냉장보관한 VCD군으로 나 누어 실험을 진행하였다.
결과 및 고찰
HPLC 분석조건 및 타당성 검증(Validation) − 신규 건강 기능식품 소재 ‘EGCG 고함유 녹차추출물’의 품질평가시험 법 및 표준화 공정에 활용할 수 있는 새로운 HPLC 분석법 을 개발하고 아울러 HPLC 분석방법의 분석적합도 및 타당 성 평가를 위한 validation 연구를 수행하였다. HPLC 분석 법은 EGCG를 포함한 EG, EGC, ECG 등 주요 녹차 catechin 성분들을 동시 정량할 수 있는 간편한 HPLC 분석방법으로 서 Zhu 등18)의 방법을 일부 수정하여 사용하였다. Validation 연구로는 특이성(specificity), 검량선의 직선성(linearity), 일 내정밀성(intra-day precision), 일간정밀성(inter-day precision), 정확성(accuracy), 최소정량한계(LOQ) 및 최소검출한계 (LOD) 등을 재검토함으로써 분석방법의 타당성 및 시스템 적합성을 판단하였다.
녹차표준품 시료의 retention time과 동일한 위치에서 간 섭피크의 유무를 관찰한 결과 EGCG를 포함한 EG, EGC, ECG 등 주요 녹차 catechin 및 caffeine의 피크들은 모두 정 량분석에 충분한 형상을 나타내었으며, 분석물질과 동일한 retention time에서 간섭피크가 전혀 나타나지 않아 우수한 특이성을 나타내었다(Fig. 2).
EGCG를 포함한 EG, EGC, ECG 등 주요 녹차 catechin 성분들을 모두 Zhu 등18)이 보고한 바와 같이 검량선의 상 관계수는 모두 0.99이상으로 양호한 직선성을 나타내었으 며, 일내정밀성(intra-day precision)은 9%이하, 일간정밀성 (inter-day precision)은 10% 이하, 정확성(accuracy)은 95- 105%로 나타나 모든 항목에서 양호한 시스템 적합성를 보 여주었다. 한편 본 연구에서 중점적으로 분석하고자 하는 EGCG 성분에 대하여 피크면적값(peak area)은 물론 retention time에 대한 일내정밀성(intra-day precision), 일간정밀성 (inter-day precision), 정확성(accuracy) 등을 재검토하였다.
녹차표준품 EGCG 시료를 0.005%, 0.01%, 0.02%, 0.04%
등 농도별로 조제한 후, HPLC 분석을 실시하여 얻어진 각 농도별 피크면적값(peak area)을 산출하고, 이를 바탕으로
작성한 검량선의 회귀방정식은 y = 27424.21x + 20229.75으 로 계산되었으며, 상관계수(R²)는 0.9998로 산출되어 우수 한 직선성을 나타내었다. 또 각 농도별 시료를 30분 간격으 로 4회 반복측정하고 retention time 및 피크면적값(peak area)의 평균값 및 상대표준편차(RSD) 값을 구하여 본 결과 0.04% 수용액의 경우 retention time의 상대표준편차(RSD) 는 1.06으로 나타났으며 피크면적값(peak area)의 상대표준 편차는 1.26으로 각각 산출되어 우수한 일내정밀성을 보여 주었다. 또, 0.02% 수용액, 0.01% 수용액, 0.005% 수용액의 경우에도 retention time의 상대표준편차는 1.65, 1.81, 0.68 으로 각각 산출되었으며 피크면적값(peak area) 역시 상대 표준편차가 각각 1.30, 3.95 및 1.87으로 산출되어 우수한 일내정밀성을 나타내었다. 또, 동일시료를 사용하여 1일 간 격으로 3회 반복 측정한 일간정밀성 실험 역시 0.04% 수용 액의 경우 retention time의 상대표준편차가 1.84로 나타났 으며 피크면적값(peak area)도 상대표준편차 3.26으로 우수 한 정밀성을 보여주었다. 이하 0.02% 수용액, 0.01% 수용 액, 0.005% 수용액의 경우 retention time 및 피크면적값 (peak area)의 상대표준편차는 각각 3.16, 1.83, 0.41 및 2.37, 4.22 및 4.12으로 산출되어 우수한 일간정밀성을 나타내었 다. 또 HPLC분석법의 정확성(accuracy) 평가를 위하여 시 Fig. 2. HPLC chromatogram of a) standard 5 catechins and caffeine in green tea and of b) whole extract of green tea and c) EGTE. HPLC: column; INNO column C18 (4.6×250 mm), mobile phase; acetonitrile in 0.1% acetic acid, gradient elution;
0-12 min : 10%, 12-25 min : 15%, 25-28 min : 30%, 28-30 min : 10%. detection; UV 280 nm. Peaks: 1. EGC, 2. catechin, 3.
caffeine, 4. EC, 5. EGCG and 6. ECG.
료를 농도(0.04%, 0.02%, 0.01%, 0.005%)별로 조제한 후, 각 농도별 검체를 4회 반복 측정하고 각 농도별 검체의 피 크면적값(peak area)과 retention time의 mean ± 표준편차 (SD)를 구하였다. 0.04% 수용액의 retention time은 100 ± 0.53, 피크면적값(peak area)는 100 ± 0.63, 0.02% 수용액의 retention time은 100 ± 0.82, 피크면적값(peak area)는 100 ± 0.65, 0.01% 수용액의 retention time은 100 ± 0.91, 피크면적 값(peak area)는 100 ± 1.98, 및 0.005% 수용액의 retention time은 100 ± 0.34, peak area는 100 ± 0.93으로 산출 되어, 표준편차는 모두 1.0 이하의 값을 나타내었다. 또, signal to noise 비율(S/N ratio)이 각각 3배(LOD)와 10배(LOQ)되는 농도로 검출한계(limit of detection, LOD)와 검량한계(limit of quantification, LOQ)를 구하여본 결과 검출한계(LOD)는 2-4 ppm, 검량한계(LOQ)는 6-12 ppm의 값을 나타내었다 (Table II).
‘EGCG 고함유 녹차추출물’ 검체의 안전성 평가 − 추출 및 가공공정 중 유기용매를 사용하지 않고 물과 주정만을 사용하는 간편 chromatography 방법에 따라 녹차추출물을 정제하여 caffeine은 전혀 함유되지 아니하고 녹차의 대표 카테킨 성분으로 알려진 EGCG(epigallocatechin gallate) 성 분이 97% 이상으로 함유된 ‘EGCG 고함유 녹차추출물’
(EGTE: epigallocatechin gallate-rich green tea extract)을 개 발하였으며 이를 소재로 활용하여 다양한 건강기능식품의 개발을 시도하였다. 이를 위하여 우선 ‘EGCG 고함유 녹차 추출물’을 서로 다른 실험조건(온도, 차광유무 등)에 1년에 걸쳐 노출시킨 후 색도의 변화 및 EGCG의 함량을 지표로 하여 안정성의 변화를 조사분석하였다.
우선 투명용기 및 갈색용기에 담은 후 각각 실온, 냉장 및 냉동조건에서 보관한 분말상 시료의 경우 HPLC 분석법에 따라 각 해당실험일에 EGCG의 함량을 측정한 결과 실험 개시 1년이 경과한 시점에서도 EGCG의 함량변화가 관찰 되지 않았으며 이러한 결과는 모든 보관조건에서 동일하게 관찰되었다(Fig. 3).
한편 수용액상 시료를 대상으로 한 실험군에서는 각각의 보관조건에 따라 안정성의 변화가 큰 차이를 보여주었다.
투명용기에 담은 후 실온에 보관한 RL군의 경우 실험개시 후 색도가 서서히 진해지기 시작하였으며 3주 경과시점부 터는 육안으로도 쉽게 갈변현상을 관찰할 수 있었다(Fig. 3).
또 EGCG의 함량도 서서히 감소하여 3주 경과시에는 50%
이하로 감소되었으며 실험개시후 1년 경과시점에서는 초기 EGCG의 함량의 30% 정도만 유지되고 있음을 관찰하였다 (Fig. 4).
또, 갈색용기에 담은 후 실온에 보관한 RD군의 경우에도 3주 경과시 EGCG의 함량이 50% 수준으로 감소되었으며 RL군의 경우와 마찬가지로 실험개시 후 1년 경과시점에서 는 초기 EGCG의 함량의 30% 미만정도만 유지되고 있어 Table II. Validation of HPLC method for quantitative analysis of EGCG
Concentration (mg/ml)
Precision (RSD) Accuracy (Mean±SD) Intraday Interday
Retention time
0.005 0.68 0.41 100±0.9
0.01 1.81 1.84 100±1.9
0.02 1.65 3.16 100±2.4
0.04 1.06 1.84 100±1.2
Peak area
0.005 1.87 4.12 100±2.7
0.01 3.95 4.22 100±5.4
0.02 1.65 2.37 100±1.9
0.04 1.26 3.26 100±1.9
Fig. 3. Change of EGCG content (%) in EGTE powder according to the storage period. a) stored in transparent bottle at room temperature (RT), b) in brown colored bottle at RT, c) in brown colored bottle at 2oC and d) in brown colored bottle at -20oC.
‘EGCG 고함유 녹차추출물’ 수용액을 실온에서 보관할 경 우 용기의 차광여부에 따른 안정성의 변화는 미미한 수준 이라고 판단할 수 있었다. 그러나 갈색용기에 분주 후 냉장 보관한 CD군의 경우에는 EGCG의 함량감소가 서서히 진 행되었으며 실험개시후 1년 경과시점에도 초기 EGCG의 함 량의 70% 이상의 수준을 유지하고 있어 보관온도조건이
‘EGCG 고함유 녹차추출물’ 수용액의 안정성유지에 보다 큰 영향을 미치고 있음을 알 수 있었다. 한편 ‘EGCG 고함유 녹차추출물’ 수용액의 안정성을 높여줄 목적으로 ‘EGCG 고함유 녹차추출물’ 수용액에 vitamin C를 추가한 후 동일 한 실험조건에서 보관한 VRL, VRD 및 VCD군의 경우 vitamin C를 추가하지 아니하고 동일한 실험조건에서 보관 한 RL, RD 및 CD군과 상호비교하여 볼 때 VRL군의 경우 RL군에 비하여 색도의 변화가 비교적 서서히 진행됨이 관 찰되었다(Fig. 3). EGCG의 함량 역시 VRL군이 RL군에 비 하여 서서히 감소되고 있음이 관찰되었고 특히 RD군에 비 하여 VRD군은 EGCG의 함량감소가 유의적으로 지연됨을 관찰할 수 있었다. 그러나 갈색용기에 분주 후 냉장보관한 CD군과 VCD군의 경우에는 두 군 간의 EGCG 함량감소에 있어서 유의적인 차이를 관찰할 수 없었다. 따라서 ‘EGCG 고함유 녹차추출물’ 수용액에 vitamin C를 추가하여 보관할 경우 실온 보관조건에서는 안정성이 어느 정도 향상되었음 이 관찰되었지만 그 효과는 미미한 수준이라 사료된다. 또 냉장보관(CD군과 VCD군)의 경우에 있어서는 vitamin C의 추가에 따른 안정성의 향상효과는 관찰되지 아니하였다(Fig 5).
이와 같은 연구결과를 종합하여 볼때 신규건강기능식품 소재 ‘EGCG 고함유 녹차추출물’(EGTE)은 액상제제로 개
Fig. 4. Color change of EGTE solutions according to the storage period. RL: EGTE solution stored in transparent bottle at RT, VRL: EGTE solution + vitamin C stored in transparent bottle at RT.
Fig. 5. Change of EGCG content (%) in EGTE solution according to the storage period. a) EGTE solution stored in transparent bottle at room temperature (RT), b) EGTE + vita- min C solution in transparent bottle at RT c) EGTE solution in brown colored bottle at RT and d) EGTE + vitamin C solu- tion in brown colored bottle at room temperature (RT), e) EGTE solution in brown colored bottle at 2oC and f) EGTE + vitamin C solution in brown colored bottle at 2oC.
발될 경우 비록 냉장보관 시에는 1년 후에도 70% 이상으 로 유효성분이 유지될 수는 있으나 제품의 생산, 유통, 보 관과정 중에 더 많은 함량손실이 예측되고 있어 상업적 제 품에는 적합한 제형이 될 수 없으리라 예측된다. 따라서 본 소재 ‘EGCG 고함유 녹차추출물’(EGTE)은 보관 중에 함량 손실이 쉽게 발생될 수 있는 액상제제보다는 보다 우수한 안정성을 보여주는 캡슐제, 정제, 스틱제 등 분말상의 제형 으로 개발되어야 하리라 사료된다.
결 론
‘EGCG 고함유 녹차추출물’(EGTE)을 서로 다른 실험조 건(온도, 차광유무 등)에 1 년간에 걸쳐 노출시킨 후 색도 및 EGCG 함량의 경시변화를 조사 분석하였다. 이를 위하 여 EGCG를 포함한 EC, EGC, ECG 등 녹차의 주요 catechin 성분 및 caffeine 성분을 동시 정량할 수 있는 간편한 HPLC 분석방법을 개발하였으며 검량선의 직선성(linearity), 특이 성(specificity), 일내정밀성(intra-day precision), 일간정밀성 (inter-day precision), 정확성(accuracy), 최소정량한계(LOQ) 및 최소검출한계(LOD) 등을 검토하여 분석법의 validation 연구를 수행하였다.
한편 ‘EGCG 고함유 녹차추출물’(EGTE)을 본 HPLC방 법에 따라 분석한 결과 EGCG의 함량은 EGTE 전체량의 97% 이상으로 측정되었으며 그외 ECG, EC, EGC, GCG 등 의 존재가 미량이나마 확인되고 있지만 이들 성분들은 EGTE 전체량의 3% 이내를 점유하고 있었으며 caffeine 성분은 검 출되지 않아 ‘EGCG 고함유 녹차추출물’(EGTE)은 식품의 약품안전처(KFDA)에서 규정한 고시형 건강기능식품의 규 격조건에 잘 부합되고 있음을 확인하였다(Fig. 2).
분말상 ‘EGCG 고함유 녹차추출물’(EGTE) 시료의 경우 보관조건에 상관없이 보관후 1년이 경과한 시점에서도 EGCG 의 함량감소 현상이 관찰되지 않았으며 수용액상 시료의 경 우에는 보관조건에 따라 안정성의 변화가 큰 차이를 보여 주었다. 투명용기에 담은 후 실온에 보관한 경우 3주 경과 시점부터 육안으로 갈변현상을 관찰되었으며 1년 경과시점 에서 EGCG의 함량이 30% 이하로 감소되었고 이러한 현 상은 갈색용기에 담은 후 실온에 보관한 실험그룹의 경우 에도 동일하게 나타났다. 갈색용기에 분주 후 냉장 보관한 경우에는 실험개시 후 1년 경과시에도 EGCG의 함량의 70%
이상의 수준을 유지하고 있어 안전성의 유지를 위하여 보 관용기의 차광유무보다는 보관온도가 중요한 요인임을 알 수 있었다. 또 ‘EGCG 고함유 녹차추출물’ 수용액의 안정성 을 높여줄 목적으로 ‘EGCG 고함유 녹차추출물’ 수용액에 vitamin C를 추가하여 보관할 경우 실온 보관조건에서는 안 정성이 어느 정도 향상되었음이 관찰되었으나 그 효과는 미 미하다고 사료된다. 또, 이상의 연구결과는 추후 신규건강
기능식품소재 ‘EGCG 고함유 녹차추출물’(EGTE)의 제품제 형연구에 유용한 자료로 활용될 수 있으리라 기대된다.
사 사
본 연구는 농림축산식품부 수출전략기술개발사업(116133- 03) 및 고부가가치식품기술개발사업(317074-3)의 지원으로 수행되었으며 이에 감사드립니다.
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(2018. 11. 14 접수; 2018. 12. 3 심사; 2018. 12. 7 게재확정)
