Journal of Sasang Constitutional Medicine

샤상체질의학회지

1. of. Cons!. Mcd

Vol. 11. No 2.1999

太陰調뽑場이

손상된 大腦皮質 神經細廳에 미치는 影響

Glucose Oxidase 에 의 해

金鍾寬

* .

_柳道坤

_{* *} .

_{金敬쫓 *}

Effects of Taeumjoweetang against Glucose Oxidase-induced

Neuroto

^성

city in the Cultured Mouse Cerebral Cortical Neurons

Kim Jong-kwan*, Ryu Do-gon**, Kim

야lUng-yo

*

* ^{Department of Sasang} Constitutional Medicine

** Department of Physiology, College of Oriental Medicine, Wonkwang Unive π ity, Iksan, Korea

I.Pu

_π

^)()se .

까1e

purpose of this study was to detennine the effects of Taeumjoweetang on the cerebral

neurons ^I

매따ed

by glucose oxi

없se(GO).

2. Methods :

I obse π ed cell viability in mouse cerebral neurons exposed to glucose oxidase by NR assay

and MIT assay and detennined lipid peroxidation in mouse cerebral neurons exposed to glucose

OXI

없

se.

After administration of Taeumjoweetang water extra α s, I observed significant changes of c

터

l

viability, lipid peroxidation in mouse cerebral neurons exposed to glucose oxidase.

. lID

光太짧校 @후醫科太쟁S 맨象짧

&

힘x 휠

"lID

光-人핑校

@후양용科-人행 ,t 理헬 초

-

사상체질의학회지 제 11 권 저

12

호 1999

-

3. Results :

GO induced cell degeneration such as the decrease of cell viability was measured by tv

π

T and

NR assay in the cultured mouse cerebral cortical neurons.

Taeumjoweetang was effective in the increase of total protein of neurons inh

‘

bited by GO.

Taeumjoweetang was effective in the decrease of lipid peroxidation of neurons produced by GO.

Keywords: Taeyeumjoweetang, glucose oxidase, cell viability

- :x: -

^르르

^...,

1.

연구목적

본 실험은 태음조위탕이 대뇌신경세포의 산화적 손상에 대한 효능을 밝히기 위한 것이다

2.

연구방법

신생생쥐에서 순수 분리한 大腦

,

때經細뼈를 t 흠養하여 glucose

oxidase(G

이에 노출시킨 후 이의 毒性效果 를 빼定하였으며

.

^또한

^GO

^{에 의하여 뚫導된 毒↑}

^#

에 대한 太陰빼뽑場의 效果를 調흉하였다

.

3.

결과 및 결론

嚴素自由基인

GO

는 M π、 assay 에 의한 細뼈生存率의 유의한 減少를 보였다 홉훗素딩

m

基인

GO

는

NR

assay

에 의한 細뼈生存率의 유의한 減少를 보였다

GO

의 嚴化的 해傷에 의한 神經毒性에 대하여 太陰調뽑楊

투여로 총단백질양의 유의한 增加를 보였다

. GO

의 짧化的 뼈傷에 의한 神經毒性에 대하여 太陰짧볍場 투여로

lipid peroxidation

의 유의 한 減少를 보였다

.

以上의 實驗結果는 太陰짧볍場이 大腦神經細뼈의 짧化的혐

fg

에 대하여 有意性 있는 防짧的 作用을 나타낸 것으로 , 이와 관련된 老化柳制나 腦虛血 , 多發↑훈硬化끊

.

^용

ⁱ

짜 등 腦機能 UHg 이나 f5; 下로 유발되는 흙恩에 대한 臨皮應用에 대해서도

f

총續的인

Tff

究가 必꽃하다고 믿‘料된다

.

-

太陰調몹훌이 Glucose

Oxidase

어| 의해 손상된 大腦皮質 神經細

R

힘에 미치는 影웰 -

I.

總 論

醫

4

용에서 腦에 관해 언급한 문헌을 보면 『강

^to"

혐 內經 靈樞;-J 海論

11J

에 ‘腦흙짧之방’라 하였으며

.

「經服篇 lJJ 에서는 'A 始生 先 精 精

iffi

腦隨生

.

이 라 하였다 이는 腦의 生理的인 機能과 治擔에 있어

서 心

. !If .

_뿜의

_&

_옳 와 밀접한 연관이 있다는 말이

다

2) r] 훌혐內원

素門 J

r

표藏生成篇

^3)J

에서는 .웹

之合쉰 也

.

라고 한 바와 같이 ’삽은뿜에 屬하고

.

모 든 隨는 腦에 屬하는데 隨는 精에서 기인하며 精은 다시 뽑에서 기인하므로 治濟에 있어서도 룹病

.

^隨

病

.

腦病 모두 治뽑과 補뽑을 한다고 할 수 있다 이외에 腦의 病옆으로는 腦隨不足 ,

n

血廣虛 , 腦絡

W:ll

등이 있다

4)

한편 李濟馬

0837-1900)

는

r

짜

{

醫뚫世保KJ

「職 論 5)J 에서

'Hilig

位 在뼈下背上 법院mH 立 在 짧下뼈 「故 背

r.JJ

댐上

tu:.

謂之

t

뭘

.

라 하고법院 與 좀 耳 頭腦 皮毛 皆

Hili

之

;

짧也 라 하여 頭腦를

Hili

之黨에 소속시켰다

.

:4>:

質驗에서 使用된 太陰調몹楊

6)

은 李濟馬가 創 案한 處方으로

!If

大빠小한 太陰

A

의 뽑脫受寒表寒 病에 쓰이며

6.7)

떼의

Of

散之氣 不足으로 발생하는 操病證에서 發꽉과 潤操시키는 작용이 있다

8)

洪

7)

은 食後씬滿 , 뼈

^R

왜無力 ,

t

빠

i

월

I찢願에 太陰調뿜場을

사용하였다 . 또한 陰血흉觸

. ^]

^{훌素弱 , 맺願 등의 病}

옆에서는 快辰黑元升

,fiE

흉大補楊

.

調몹升j 하場과 함 께 사용되었으므로

5)

빠의

Pf

散之力을 極大化시켜 떼之黨에 해당되는 頭腦의 작용에도 긍정적인 효과 가 있을 것으로 사려된다 .

本 :t{ 옳의 주제로 삼은 嚴素

; gBtI

基는 中樞뼈經系 를 비롯하여 末稍빼원系에 影響을 미쳐 파킨스써병 이나 근위축성측삭경화증과 같은 빼원흉 ,뽕、을 유발하 는 病因으로 밝혀지고 있다

9.1O.1lJ

그러나 아직도

이의 정확한 病理하j 機햄에 대해서는 정확하게 料明 되어 있지 않으나 최근에 운동신경원질환의 病

I

집으

로서

Superoxide Dismutase(SOD)-l

遺傳子의

突然變異에 의한다는 것이 밝혀지면서 홉찾素터

m

基가 많은 빼원病變에 관여하고 있음이 證明되어 홉쫓 엄 머基의 毒性현상에 대한 기전규명과 짧素멈由基에 의하여 유발되는 흉뿔、에 대한 治濟的 접근을 위하여 국내외 많은 학자들이 동물을 대상으로 꾸준히 돼究 를 진행하여 오고 있다

12.13)

그간 太陰

A

表病에 사용되는 太陰調뽑場에 대하 여 慣꽃 fiP 制效能

14)0]

나 HE 滿

15)

등에 관한 實옳하1

%

究報告는 있었으나 뻐之黨에 속하는 頭腦와 관련 된 質똥용的

m

究報告는 아직 없었다

.

이에 著者는 太陰調뿜場이

j-j

휠의 빠之짧에 所

l

홈 되는 頭腦에 일정한 機能을 호

t

상시키는 효과가 있으 리라 ‘낸慮되어

.

^{홉쫓素임 由基의 神經毒↑}

*

^{에 대한 太陰}

調뽑場의 합

4

響을 究明하기 위하여 신생생쥐에서 순 수 분리한 大腦빼經細뼈를 배양하여

Glucose

Oxidase (GO)

에 노출시킨 후 이의 毒性效果를 얘IJ

定하였으며

.

^{또한 太陰뼈몹場 處理 후}

^Glucose

Oxidase

에 의하여 홉發된 毒性에 대한 防훌 效果를

調흉하여 有훌; 한 結果를 얻었기에 報告하는 바이다

.

II. 實驗차큐

^{및 方法}

1.

材 料

1)

動 物

:4>:

實옳에 使用한 동물은

1CR

계통의 생후

3

일

된 건강상태가 양호한 생쥐를 使用하였다

.

2)

藥 材

4:

實뚫에 사용한 太陰뼈볍楊의 處方內容은

rj/t

?

혔 名

.j:

혔 名

m ¯€': (g)

ff.DNÁ ^{Semen Coicis 12}

ÖÄl: . ^{Semen Castaneae 12}

Éçill[P- ^{Semen Raphani 8}

1i味子

Fructus Schizandrae 4

찢門4

Tuber Liriopis 4

감‘텀浦

Rhizoma Acori 4

t6 f1 ^{Radix Platycodi 4}

i!'Jt 黃 Herba Ephedrae 4

Total Amount 52

-

사상채질의학회지 제 11 권 제

2

호

1999 -

뽑끊世保

. 6)ic.J

에

{

衣據하였으며 , 햇材는 떠IJ\:; 大學앉 짧方病院에서 購入한 후 嚴

i

탤하여 使다

l

하였고

.

^太陰

해법場 內容과 分닮.은 다음과 같다

PrescriPtion Contents of Taeyeumjoweetang

(T JT) Per Pack

2.

方 法

1)

檢浪의 調웹j

太陰調볍楊 4 貼 分뚫인

208g

을 증류수와 함께 환저플라스크에 넣고 冷최1器를 附휩하여

2

시간동안 핸場한 후

3.000rpm

에서

20

분간 원심분리하고 회 전진공 농축기로 감압농축한 후 i東結乾操옮에서

i東

結乾操하여 각각

49.04g

^{의 분말 시료를 얻었다 .}

2)

藥郵

l

^훨造

本 1'f. 똥용에 사용한 약제로는

glucose oxidase(GO.

Sigma)

로서 각각

100mU/ml. 10mU/ml.

lmU/ml

의 저장액을 만들어 냉암소에 보관한 후

實뚫 당일 적당한 양으로 희석 사용하거나 필요한 양을 직접 펌養波에 첨가하여 사용하였다

.

3)

細뻔培養

大腦

I

때원細뼈의 분리는

Michikawa

등

16)

의 방법 에 따라 시행하였다

.

즉 생후

1-3

일된 생쥐에서 적

출한 뇌조직은

0.25% trypsinc]

포함된

phosphate buffered saline(PBS)

으로 처리한후

36"C. 5% CO:J95%air

^{로 조절된 항온기 내에서}

땅養하였다

.

培養완료후

10% fetal bovine serum

(FBS. Gibeo)

이 포항된

Eagle's minimum

essential medium(EMEM. Gibeo)

으로

3

회 세

척후

Pasteur

피엣으로 세포를 분리시켰다 분리된

세포들은

Poly-L-]ysine (Sigma)

으로 전처리된

96-multiwell

에 3X 106cells/well 의 밀도로 세포

를 분주하였다

.

분주된 세포는

3

일 간격으로 새로운

!g 養뼈으로 교환하여 주었으며 7

일동안 땀養後

^4>:

實뚫에 사용하였다

. 4)

醒素自由基 처리

홉찾뚫-벼由基가 생쥐의 大腦神經細뼈에 미치는 彩響 을 調흉하기 위하여 일정시간 땀養한

^j

때經細뼈를

0.6%-D glucose

가 함유된

MEM

^으로

3

회 세척한

다음 l-30mU/ml

glucose oxidase(GO)

가 포함 된 챔養浪에서

2-12

시간 동안 처리후 分析하였다 .

5)

細뼈毒性 및 防찢效果 檢定

( 1)

細뼈生存率 分析

CD MTT

뭘

MIT- 3-( 4. 5-dimethylthiazol-2-yl )-2. 5-diph

enyltetrazolium bromide(Sigma)

定꿇은

Mosmannl7)

의 방법에 의하였다

.

짧素自 m 훌나 항

산화제를 처리한 II:\' 養 빼원細뼈를

PBS

로

3

회 세척한 후 전날 제조한

50mg/ml

의

MTI

를 well 당 최종

iC'l

It

로 희석하여 넣어

37"C. 5% C02

로 조절된 정온 기에서

t

픔養하였다 I. 흡養

^I

완료 후

dimethyl-

-

大陰調몹場이 Glucose

OXidase

에 의해 손상된 大腦皮짧 神經細뼈에 미치는 影훌 -

sulfoxide(DMSO. Merk)

를 처리한 다음 spectro-

photometer

로

503nm

에서 홉광도를 측정 후 대조

군과 比 . 야

1

호하였다.

(2) NR

짧닮

Neutral red(NR. Sinma)

의

JE

置은

Borenfreud

와 Puerner 삐의 방법에 따랐다. 즉 여러 j 없않의

GO

를 처리한

!g:

養 神經細뼈를 phosphate

buffered

saline(PBS)

으로

3

회 세척 후 전날 제조한

5mg/ml

의

NR

을 well 당 최종慮않로 희석하여 넣은 다음

3

시간 동안

37'C. 5% C02

로 조절된 정온기에서 t 흩 養하였다

.

培養 완료 후

PBS

로

3

회 세척 후

1%

formalin

으로 고정하고

1 % glacial acetic acid

로

처 리한 다음 spectrophotometer 로

540nm

에서 홉 광도를 측정하여 대조군과 比較 調흉하였다 .

<ID SRB

定월

훌쫓素붐由基나太險調볍場으로 일정시간 동안 처리 한 大腦神經細뼈에

0.4% sulforhodamine ¹³

를

200

μ 씩 첨가하여

1

시간 동안 실온에 방치한 다음

1.0% acetic acid

^로

3

^{회 세척하였다}

^.

^{세척 완료}

후

10mM Tris base

를 이용하여

SRB-bound

protein

을 녹인 후

ELISA reader

^로

^540nm

^에서

홉광도를 측정하여 대조군과 比較 調흉하였다

.

@ Lipid peroxidation

定뭘

Lipid peroxidation

은

GO

나 太陰調볍場 抽出物

을 일정시간 동안 처리한 大腦神經細뼈의 상층액과 세포용해액내의

TBARS(thiobarbituric acid

reactive substances)

를 측정한 것으로 , 위액에

12N H2S04

와 10%

phosphotungstic acid

를 각

각 2.0ml 와 0.3ml 를 넣고 10 분 동안 반응시켰다

^,

반응 완료후

TBA

를

1.0ml

를 가한 후

90

도에서

1

시간 동안 가열한 다음 냉각후 n-butanol 로 처리하 였다 . n-butanol 처리완료 후 원침하여 이를 제거한

다음

553nm

^{에서 형광측정법에 의해 측정하였다}

6)

統計 處理

얻

f

똥용 結果에 대한 유의성의 검정은

ANOVA

한 후에 Tukey-Kramer

multiple comparison test

에 의하였으며

p 값이 0.05

이하인 것만 유의한 것 으로 하였다

III.

實 驗 成 績

1.

嚴素自由基의 훌性效果

1)

細뼈生存率 分析

(1) MTT

定뭘

嚴素냄由基가 培養 大腦神經細뼈에 미치는 影響을 調흉하기 위하여 glucose

oxidase (GO)

가

5

에서

60mU/ml

까지의 각각의 빼度로 포항된

t

흩養滾에

서

4

시간 동안 t 흠養한 후

GO

의 毒性效果를

MTT

assay

법에 의하여 調흉한 結果

5mU/ml GO

처 리

에서는 세포의 생존율이 대조군

000%)

에 비하여

69.3%

로 나타났다 . 그러나

15mU/ml

의 처리에서

는

60.3%

로 이보다 다소 낮게 나타났다

.

또한

30

과

60mU/ml GO

를 처리한 경우 이의 생존율은 각

각

50.8(p(0.05)

과

37.4%(p(0.0l)

^{로 대조군에}

비하여 모두 유의하게 낮게 나타났다

. (Table 1) GO

가 시간에 따라 염養 大腦神經細뼈에 미치는 影響을 빼]흉하기 위하여

30mU/ml GO

가 포함된 혐養浪에서 大腦神經細뼈를 각각

1

에서

6

시간 동안 댐養한 후 세포의 생존율을

MTI

^、

^assay

^{법에 의하}

여 대조군과 比較 調흉한 結果

1

시간 땀養에서는 대

조군

000%)

에 비하여

72.6%

의 細뼈生存率을 보

였다 . 또한

2

시간 培養에 있어서는

67.8%

^{로 대조}

군에 비"6}< 겨 다소 낮은 생존율을 나타냈으며

4

시간 땀養에서는 대조군에 비하여

51.6%(P(0.05)

의

MTI Decrease of cell GO(mUjml)

absorbance(570nm) viability(% )

0 1.7910.17

5 1.2410.14 30.7

15 1.08 1 0.11 39.7

30 0.9110.08 * 49.2

60 0.6710.04

** 62.6

GO MTI absorbance(570nm)

(mUjml) 1hr ^¬1T 4hr 6hr

0 1.46 1 0.18 1.4910.15 1.5310.12 1.4710.14

30 1.06:t 0.07 1.0110.05 0.7910.03* 0.48:t 0.01

**

NR Decrease of cell

GO(mUjml)

absorbance(5µLn viability(%)

0 1.621 0.16

5 1.2710.18 21.7

10 1.1510.13 29.0

20 0.871 0.06 * 46.3

40 0.8010.02

** 50.6

-

사상체질의학회지 제 11 권 저

12 호 1999 -

Table 1. Absorbance (% of control) at

570nm wavelength for the MTT

assay on glucose oxidase(GO) in

cultured mouse cerebral neurons.

Cultured mouse cerebral neurons were treated with

various concentrations of glucose oxidase(GO) for 4

hours. The values are the mean:tSE for 6

experiments. Significant differences from the control

are marked with asterisks. .p(0.05: ..p(O.Ol

Table 2. Time-response relationship of

glucose oxidase(GO) by MTT

assay in cultured mouse motor

neurons.

Cultured mouse motor neurons were treated with

30mU/ml GO for various time intervals. The values

are the mean:tSE for 6 experiments. Significant

differences from the control are marked with

asterisks. .p(0.05: "p(O.Ol

생존율을

. ⁶

시간 培養에 있어서는

32.7%(p(0.OU

의 생존율을 각각 나타냈다 . (Table

2)

(2) NR

定뭘

t

픔養中인 大腦빼經細뼈를

?+Ca 2+ . Mg- free

인

Hank

^’

s balanced salt solution(HBSS. Gibco}

으로

3

회 세책 한 후 GO 가

5

에서

40mU/ml

까지 의

i

없않로 포함된

tg:

養

i

에서

4

시간 t 흠養한 다음 이 의 彩뿔을 뼈훌한 結果

5mU/ml

의 처리에서 세포 의 생존율은 대조군

(100%)

에 비하여

78.3%

로 나

타났으며

10mU/ml

에서는

71.0%

^{로 나타났다}

.

^또

한

20

과

40mU/ml

에서는 각각

53.7(p(0.05).

49.4%(p(0.OlJ

^{로 나타났다}

. (Table 3)

Table 3. Absorbance (% of control) at

540nm wavelength for the NR

assay on glucose oxidase(GO) in

cultured mouse motor neurons.

Cultured mouse motor neurons were grown in media

containig various concentrations of glucose

oxidase(GO) for 4 hours. The values represent the

mean:!:SE for 6 experiments. Significant differences

from the control are marked with asterisks. .p(0.05:

"p(O.Ol

GO

가 培養時間에 따라 大腦神經細뼈에 미치는

影響을 調훌하기 위하여

MCV(midpoint

Cytotoxicity value)

값인 20mU/ml

GO

溫度에서

1-6

시간 동안 t 흩養한 후 각 시간별로 세포의 생존 율을 調훌한 果

1

시간

. ²

시간 땀養에서는 대조군

000%)

에 비하여 각각

80.7. 75.5%

로 나타났으

며

4

시간과

6

시간 각각

56.4(p(0.05). 40.2%

(p(O.OU

^{로 나타났다}

. (Table 4)

GO NR absorbance(S40nm)

(mUfml) 1hr 2hr 4hr 6hr

0 1.35 :!: 0.15 1.43i: 0.11 1.49:!: 0.13 1.32:!: 0.16

40 1.09:!: 0.10 1.08W0.07 0.84:!: 0.05" 0.53:!: 0.02

Total protein(% of control)

GO

(mUfml)

concentration of Taeyeumjoweetang( μ g/ml)

0 2S 45 90 180

0 100:!:5.4 l00:!: 3.6 l00:!:6.4 loo:!:4.7 100:!: 5.5

40 48.7 :1:4.1 61.8 :1:4.8 70.5:!: 4.3 84.6:!: 5.2 93.7:!: 5.9**

-

太陰해멸場이 Glucose

Oxidase

어

|

의해 손상된 大腦皮質 빼^l쟁細뼈에 미치는 影옐 -

Table 4. Time-response relationship of

glucose oxidase(GO) by NR assay

in cultured mouse motor neurons.

Cultured mouse motor neurons were incubated with

40mU/ml GO for various time intervals. The values

represent the mean :!:SE for 6 experiments

Significant differences from the control are marked

with asterisks. "p(0.05: "p(O.OI

2.

韓쫓抽出物의 效果

1) SRB

定量

( 1) GO

의 影響

嚴素입머훌가

t

끔養 大腦 i!i$ 經細뼈에 미치는 影뿔을 총단백질양의 측면에서 調훌하기 위하여

Glucose

Oxidase (GO)

가 10 에서 BOrnU/rnl 까지의 각각의

없度로 포함된 t 흠養浪에서

4

시간 동안 培養한 후

GO

에 의한 단백질 합성의 변화에 대해 調흉한 結果

10rnU/rnl GO

처리에서는 단백질의 합성이 대조군

000%)

에 비하여

79.2%

^{로 나타났다}

.

또한

20rnU/rnl

의 처리에서는 대조군에 비하여

71.43%

로 다소 낮게 나타났다 . 또한

40

과 BOrnU/rnl

GO

를 처리한 경우 단백질 합성은 각각

51.6

(p(0.05)

과

31.4%(p(0.01)%

로 나타나 대조군에

비하여 모두 유의하게 낮게 나타났으며

. ^MCV

^값은

40rnU/rnl

에서 나타났다 . (Table

5)

(2)

태음조위탕의 效果

Jg:

養 大腦빼經細뼈에 대한

GO

의 산화적 손상에 있어서 太陰調볍場의 效果를 총단백질의 양적변화

Table 5. Dose-response relationship of

glucose oxidase(GO) on total

protein synthesis in cultured

mouse cerebral neurons.

GO concentration (mU/ml)

0 10 20 40 80

Total protein (% of control)

l00:!: 5.6 79.2:!: 6.2 71.4:!: 5.7 51.6:!:4.6 ^‘ 31.4:!: 4.9""

Cultures mouse cerebral neurons were exposed to

10. 20. 40 and 80mU/ml glucose oxidase (GO) for 4

hours. respectively. Amount of total protein was

measured by SRB assay(540nm). and shown as % of

control. The results indicate the mean:!:SE for 6

experiments. Significant differences from the contrl

are marked with asterisks. "p(0.05: "p(O.OI

Table 6. Dose-response relationship of

Taeyeumjoweetang for its

neuroprotective effect on

glucose oxidase(GO) in total

protein synthesis.

Cultured mouse cerebral neurons were treated with

TaeyeurrUoweetang. Cultures were preincubated with

25. 45. 90 and 180 μ g/ml Taeyeu

찌 oweetang

for 3

hours. respectively. After then. cultures were

exposed to 40mU/ml GO for 4 hours. Amount of

total protein was measured at wavelength of 540nm

The results indicate the mean:!:SE for 6

experiments. Asterisks indicate the significant

differences between groups.. 'p(0.05: "p(O.OI

GO TBARS Decrease of concentration

(pmol/106 cells) cell viability(%)

(mU/ml)

0 ®E.6:t 4.2

15 24.8:t 5.3 9.7

35 35.5:t 5.7** 57.1

70 47.8:t 6.2 111.5

140 58.9:t 5.9** 160.6

-

사상체질의학회지 제 11 권 제 2 호 1999

-

측면에서 뼈흉하기 위하여

GO

의

MCV

값 (midcyto-

toxicity value)

인 40mU/ml

GO

없I 표에서 4 시간

동안 노출시키기

3

시간 전에

25

에서

180 ^μ g/ml

太 陰調뿜場이 각각 포함된

jif

養빼에서 전처리한 후 이 의 防휠效果를 해흉하였다

.

^{그 結果}

25 ^μ g/ml GO

만을 처리한 경우 총단백질의 양적변화는 대조군

000%)

에 비하여

61.8%

^{로 나타났으며}

.

또한

45

μ g/ml

太陰調볍場의 처리에서는 대조군에 비하여

70.5%

로 나타났다

.

그리고 90,

180 μ g/ml

처리에

서는 각각 84.6(p(0.05),

93.7%(p(0.OU

로

GO

만의 처리에 비하여 높게 나타났다

(Table 6)

2) Lipid peroxidation

定量

(1) GO

의 影쩔

GOil

앓않에 따른 lipid

peroxidation

의 측정하기 위하여

GO

가 15 에서 140mU/ml 까지의

i

度로 각 각 포함된 t 끔養ji{ 에서 大腦神원細뼈를

4

시간 동안 처 리한 후 세포의 생존율을 대조군과 比較 調3 훌하였다

.

그 結果

15mU/ml GO

처리에서는

TBARS

가

24.8

:!:5.7(pmol/106 cells)

로 나타났다

.

또한

35, 70

및

140mU/ml GO

처 리의 경우

TBARS

가 각각

35.5:!:5.7(p(0.OU, 47.8:!:6.2(p(0.OU, 58.9:!:

5.9(pmol/106 cells)(p(O.OU

로 나타났다

.

이에 대

한 細뼈生存率 減少는

57.1. 111.5, 160.6%

로 각 각 나타났으며 細뼈生存率 減少의

MCV

값은

35mU/

mlGO

처리에서 나타났다 . (Table

7) (2)

太陰調몹場의 效果

t

흩養 大腦빼經細뼈에 대한

GO

의 산화적 손상에 있어서 太陰調볍場의 效果를

lipid peroxidation

측 연에서 째훌하기 위하여

GO

의

MCV

값 (midcyto-

toxicity value) 35mU/ml GO

없않에서 4 시간

동안 노출시키기 3 시간 전에

15

에서

120 ^μ g/ml

太 陰뼈볍場이 각각 포항된

jif

養냈에서 전처리한 후

Table 7. Dose-response relationship of

glucose oxidase(GO) on lipid

peroxidation in cultured mouse

cerebral neurons.

Cultured mouse cerebral neurons were exposed to

various concentrations of glucose oxidase(GO) for 4

hours. Thiobarbituric acid(TBA) fluorometric assay

was adopted to analyse lipid peroxidation and TBA

reactive substance (TBARS) were represented as

pmol/106 cells. The values are the mean:!:SE for 6

experiments. Significant differences from the control

are marked with asterisks.'p(O.05: "p(O.Ol

이의 防짧效果를 調흉하였다 . 그 結果

35mU/ml GO

만을 처리한 경우

TBARS

는 대조군

32.6:!:

5. 2(pmol/1 06cells)

에 비하여

98.4:!:7.l(pmol/

106 cells)

로 나타났다 . 그러나

15 ^μ g/ml

太陰調볍

場의 처리에서는 대조군

31.5 :!:4. 7 (pmol/

106 cells)

에 비하여

85.5:!: 6. 9(pmo!/1 06cells)

로

나타났으며

30 ^μ g/ml

太陰調뿜場의 처리에서는 대

조군

32.8:!: 5.1 (pmo!/l 06cells)

에 비하여

83.6

:!:6.3(pmo!/106cells)

^{로 나타났다 . 또한}

60

과

120 ^μ g/ml

太陰調뽑楊처리에 있어서는 각각 대조

군

34.7:!:5.7

과

38.6 :!:4.6(pmo!/1 06cells)

에 비

하여

68.2:!: 5. 7(p(0.05)

과

55.5:!:5.1 (pmo!/

1 06cells)(p(0. 0 U

로 나타나 이는

GO

만의 처리에

비하여 매우 유의하게 減少하였다

(Table 8)

TBARS(pmÇt/10" cells) GO

(mU/ml) concentration of Taeyeumjoweetang( JJ g/ ml)

0 15 30 60 120

0 32.6Î 5.2 31.5 i:4.7 32.8:t 5.1 34.7:t 5.7 38.61:4.6

35 98.4 ::: 7.1 85.5:t 6.9 83.6:t 6.3 68.2:!: 5.7* 55.5Ä5.1*'*

-

太陰調뿜場이 Glucose

Oxidase

어

|

의해 손싱된 大腦皮質 神經細뼈에 미치는 影뽑 -

Table 8. Dose-response relationship of

Taeyeumjoweetang for

neuroprotective effect on glucose

oxidase(GO) in lipid peroxidation.

Cultured mouse cerebral neurons were treated ‘씨 th

Taeyeumioweetang. Cultures were preincubated

with 15. 30. 60 and 120 μ g/ml Taeyeumioweetang

for 3 hours. respectively. After then. cultures were

exposed to 30mU/ml GO for 4 hours. TBA reactive

substance(TBARS) were represent as pmol/l06 cells

The results represent the mean:!:SsE for 6

experiments. Asterisks indicate the significant

differences between groups. "p(O.OI

IV.

考 察

『東醫꿇世保元IJ 빼뼈論

5)J

에서는 우리 몸의 職뼈를

ffM

교的인 價念에 의해 며魚 즉

t

뚫

.

^中

^t

1#-,

中下뚫 , 下뿔로 나누어 빠 볍院

gM

^{立 ,} 牌 몹部 位

. ^{1Jf' IJ}

^、陽없位

.

웹 大陽 ffl\{iL 로 설명하였다 . 鷹服 의 形成過뽑은 水뤘으로부터 비롯되는데 水뤘은 各 뼈의 形態的인 휠因에 의해 { 흉홉과 消펼

.

上升과 下 降의 氣運을 갖게 되어 각각 熱氣와 源氣

.

溫氣와 冷氣를 지니게된다

.

이 溫 熱 평 寒의 氣運은 各 服로부터 前며海와 後四海로 쩔化하게 되는데

.

^이때

四海의

i

허 j 뚫 內外 ,11\ 人을 통해 各뼈의 짧을 形成 하게 된다

.

頭腦는 빠之黨에

l

뭘하며 이를 살펴보면 , ‘水웠의

Its

i

젊氣는 별院에서

if

으로 化하여 혀밑으로 들어가

*

바가 되니

ifi

따란

i

후이 모여 있는 곳이다

.

뿌밥의 폐氣는 귀로 나와서 빼이 되고 그 神이 預腦로 들어 가

fun

양가 되니

ijli

흩란 빼이 모여 있는 곳이다 . iji 海의

i

펴

II

은 안으로는

Mj

로 돌아가고

. ^{j 융律는 밖으}

로 皮毛로 돌아가므로 뿜脫 , 좀 , 耳 , 행腦

.

^皮毛는

모두 빠의 무리이다 .’라고하였다

6)

太陰

A

의 '1Jf 大빠IJ ^、 한 職뼈形局이 成立되는 機顆 에 대해서 주濟馬는

r*

^{醫壽世保元IJ 며端論}

^5)J

에서 ‘太陰

A

은 황性은 廣짧하고 樂情은

1

足急하니

.

룹性이 廣

5

양한즉 氣注땀而

IJf

깜盛이요 , 樂情이

f

^足急

한즉 氣激

Rrn

而

Rrn

깜빼 하게 되니 결국 太陰之職局이 府大뻐小로 形成되게 된다.고 _{하였다. 또한 .頭腦之}

빠海는 빠의 根本이다.라고하였으니

,1Jf

大빠小한 體 質을 가진 太陰

A

은 頭腦之腦海가 充足되어야 할 것 이다

.

따라서 빠의 根本 즉 뼈元을 補演할수 있는 處方이나 혔勳은 곧 頭腦之麻海를 補

9

^{옳할 수 있게}

되는 것이다

.

太陰調뽑場은

^Em

元을 補彈하거나 빼理할 수 있는 藥材를 두루 包含하고 있으며 食後힘滿 ,

mM

빼無力 病 , 짖鷹病에 사용되었다

.

반면에 太陰 ,A0] 陰血흉 觸되어 耳題

.

^{닙暗 ,}

^!

^빼弱

.

體痛 등의 증상이 나타나 거나

.

^{및眼素弱에}

ⁱ

효益之方으로 사용하는 鷹흉大補 場

.

^{빼볍귀淸場이나} 供辰黑〕댐과도 같이 사용되었 으므로 빠의 根

4:

을 강하게 補

?

옳하는 效能이 있다고 생각된다

.

그런데 太陰調볍場은 본래 食後혐滿

,1tiI!

聊無力 ,

i

世

i

없 , 젖鷹 등

6)

의

1iE

狀에 應用되었으며 後 世에 이르러서도 洪

7)

은 뼈痛

.

^黃훨

^p

^쁨息

.

짧훌

.

^橋

A

帶下 , 下血 등에 사용하였으며 朴

19)

과

.

^朝醫學

^20>

에서는 黃펄 ,

f$

寒H 총氣頭痛 , 身痛

.

^{無什 , 食휴햄l휘 ,}

!liI!ij

때無力 , 脫陰에 應며할 수 있다고 하였으며 金

2l!

은 氣짤支갖

.

^過없↑

_*

^大陽

^1fF.

^候群

.

^{消化不良 ,} 뽑職썼

^,

+-.

指陽 j 윌傷

.

법消傷 등에 據댔應며하였으나 頭腦

-

사상채질의학회지 제 11 권 제

2

호

1999 -

에 대한 끓‘誠과賢뚫的

!iff

究는 未備하였다 .

또한 본 實뚫에 { 횟 m 된 太陰뼈벌場의 각 構成훗物 의 4:1t! 學的인 效能을 살펴보면

22-28)

옳

^J

仁은 微寒 無꿇

.

^味

^lJ'

^淡

.

^利水慘

ⁱ

^월

. ^{j 버熱} . r

뺑

.

^健

⁸

^뿌止

ⁱ

^형

. ^J

腦으로 開빠之법氣

. ⁱ

^챔

fti1tft

하며

. t

業은 I 젊無꿇 ,

味없

.

^깜氣

^I¥

^융

^.

^補뽑氣로

^rMRiIi

^之볍氣

.

^消

^fti1tft

^하

고

.

^짧

¹ⁱⁱ

^子는

^T

^無毒

.

^味辛

^lJ' .

^消쇼化찮

.

^{下氣定 P 밟}

.

健봅

. ^Iii!'

^껏

. ^flJ

^{大小使하며 ,} 찢門걷은 微寒無毒 , 味

lJ' .

^微苦

. ^{j 챔操生 i}

^{후 , 化짧止 l 찢}

^{'. (rf}

^ι、

ⁱ

^{間 Rili. 治虛勞}

^?

^￥

熱

. i

댐陽通便 , 감뽑生

i

훤으로 補빠和빠하고

.

밤햇은

微溫無毒

.

^味辛졸

. ⁱ

렴RiIi! 是氣 , 去

*

^排

⁸

^앓

^.

^表散寒쩌

^.

開

8

댐隔휴氣

i

^{혐頭目 하여}

^:ti:HiIi

^{而有外樓之力하며 , 빼}

i

^黃

은

i

짧無毒

.

^{味辛苦 , 發仔解表}

.

^{平P 밟利水}

.

^{治{용寒痛}

.

惡寒無

it

하여 解

^Ri/i

之表쩌하고 , 五味子는 溫無뚫

.

^味

嚴

.

麻

i

효뽑

.

^生

ⁱ

^훨

^it.

^海精止

ⁱ

^{￥ 明덤하여 健빠直}

뻐하며 , 石홉浦는 微溫無뚫 , 味辛

.

^芳좀開혔

. ^i!

^쪼

*liir

i

융

.

^通九혔

.

^明耳目

.

^{治뼈煩帳問한다}

^.

따라서 本方은 전체적으로 볼 때 太陰

A

의 뿜氣를 補彈하고

j

월을 제거하여

11

해할 基짧을 만들고 빠 의 氣運을 튼튼하게 해서 밖으로 떨쳐나옴과함께

.

師의 表

%

를 풀고 뼈의 氣運을 均調시키며 뼈를 補

.

和 , 健 .直시키는處方으로 뼈小한 太陰

A

의 업院에서 水뤘之氣를 上升시켜 水뤘

i

닮氣가 폼下에서

i

휠海로

.

頭腦에서

llit

海로 充足되게 해 주는 處方이다

7.20.28)

그러므로 太陰調몹場이 J:. 섣에 있는 빠之黨인 頭腦

의

lli'U

海를 충족시키며

,

神이 머무를 여건을 마련하

여 주므로서 실제 頭腦의 1X 思에 使用할때 유용하게 응용할수 있는 處方이 될수있다고 생각된다

.

이에 著者는 신생생쥐에서 순수 분리한 大腦꽤원

細뼈를

!g:

養하여

Glucose Oxidase{G

이에 노출시

킨 후 이의 毒件效果를써IJ定하였으며

.

^또한

^GO

^{에 의}

하여 꿇끊된 毒件에 대한 韓훗抽

II

’物인 太陰짧

j

볍傷의 效果를 뼈흉하여 이에 有릎‘件있는

f.Ii

果를 얻었다

.

특히 嚴素 엄

m

基는 細뼈뺑의 지질과산화반응을 촉 진시킬 뿐만 아니라 질소자유기의 하나인 Nitric

Oxide(NO)

와 相효 作며함으로서 f-j: 이 강한 물질

인 Peroxynitl 따을 생성하여 병변을 더욱 가속화 시킨다고 한다 . 또한 배양 해마신경세포에서 홍분성 아미노산 (EMs) 을 분비케 유도한다는 것이 밝혀졌

으며 분비된

EMs

는

N-methyl-D aspartase

(NMDA)

수용체를 과활성화시킴으로서 세포내

ci+

^{의 뀔常性을 깨뜨리며 그 결과 째원細뼈를 뼈}

{ 용시킬 뿐만 아니라 나아가서는 細뼈의 死滅을 초래

한다고 한다

29-32)

그 밖에도 嚴素며머基는 protein

kinase C(PKC)

나 cyclic

AMP

와 같은 이차전달

자에 영향을 미침으로서 細뼈毒↑

*

^{을 초래한다고 한}

다 . 최근에 짧素입由훌의 산화적 뼈

f

^{용에 대하여 짧}

혔햄

l

의 抽出物이나 動뺀物에서 정제한 天然빼

H

‘物들 이 강력한 항산화작용을 나타낸다는 실험결과들이 보고되고 있다

.

세포배양기술이 널리 보급되연서 실 험 목적에 적합한 세포종을 배양하여 病變의 모델을 만든 다음 각종 治擔했

l

나 ￥흥햇抽

^:J

‘物이나 天然抽 81 物들을 처리함으로서 病變의 治濟에 새로운 접근을 시도하고 있다

.

따라서 배양세포를 이용한 시험관내 실험은 배양세포가 생체에서와 같이 形態學的 특정 은 물론 生理나 生化學的 ↑훗質을그대로 가지고 있 어 각종 藥뻗j의 잣얘

g

_{이나 毒↑}

_#

_{物質의 안전성 검색}

등에 매우 적합한 실험방법으로 인정받고 있다 . 더 욱이 면역세포화학염색법이 발달하게 되자 이를 이 용하여 순수한 세포종의 판별과 이의 순수배양이 가 능하게 되면서 배양세포를 재료로한 실험은 시험관 내의 매우 적합한 분석도구가 되었다

.

산소자유기는 또한 腦虛血이나 多發뺨硬化끓의 병 인으로 밝혀지면서 嚴素自m 基의

^@

매經毒↑

*

^{에 대한}

病理센

j

機f\H.1J. 明에 대하여 많은 liJf 究가 이루어져 왔

다

30.33-

찌

본 質월에서 GO 를 생쥐의 배양 大腦꽤

-

大陰調몹漫이 Glucose

Oxidase

어

|

의해 손상된 大腦皮質 神經細뼈에 미치는 影홉 -

:;(if'J..: 細뼈에 노출시 킨 후

NR assay

와

MTT assay

법

으로 分析한 結果

GO

는 처리 농도와 시간에 비례하 여 細뼈의 生存率을 현저하게 減少시켰다 . 이같은 結果는 홉

^%

素自由基가 배양 생쥐의 척수신경절세포와 소의 배양 회소즐기아교세포에 각각 毒件을 나타냈 다는 實뚫 결과와 일치하였다

16.35)

이러한 현상은 짧素엄

EI3

基가 中樞나 未稍神웰細뼈에 모두 細뼈毒件 을 가지고 있음을 짧明해 주고 있다 본 實뚫에 있 어서 嚴素-냄由 가 생쥐의 배양 大腦神經細뼈에 毒 性을 나타낸 것은

GO

가 항산화계에 챔傷을 줌으로 서 항산화효소의 T6 ↑훈減少를 초래했거나 또는 嚴素

엽 m 基중

superoxide

와 같은 환원제가 세포내

Fe3+

와 상호작용히여 毒件을 나타냈을 가능성도 배

제할 수는 없지만

36-37)

본 실험의

NR assay

와

MTI assay

룹 비롯하여

lipid peroxidation

정 량

분석이나

SRB

분석의 결과를 볼 때

GO

는 細뼈體 의 지질과산화반응 촉진과 단백질합성의 억제에 의 한 것으로 생각된다

30)

이에

GO

의 산화적 손상에 대한 神經毒件을 조사

하기 위하여

5-60rnU/rnl

의 GO 가 각각 여러 농도

로 포함된 t 흠養浪에서 大腦神經細뼈를 시간별로 배

양한후

MTI assay

에 의한 세포 생존율을 측정하

였다

.

그 결과

GO

의 처리농도에 비례하여 유의하 게 세포의 生存率이 減少하였다

. (Table I)

또한

GO

의 처리 시간에 의한 영호

t

을 조사하기 위빼

GO 30rnU/rnl

에서

1- 6

시간 동안 각각 배양 대뇌

신경세포를 배양한 결과

GO

의 처리 시간에 비례하 여 세포의 생존율을 유의하게 감소시겼다

. (Table 2)

GO

의 독성에 대한 영호

t

을

NR assay

에 의뼈

조사하기 위하여

5-40rnU/rnl

의

GO

가 각각 여러 농도로 포함된

^11M

양액에서 大腦

^ffi

띠원細뼈를 시간별로 배양한 후 NR

assay

에 의한 세포생존율을 측정하 였다 . 그 결과

GO

의 처리농도에 비례하여 유의 하

게 細뼈의 生存率이 減少하였다

. (Table 3)

또한

GO

의 처리 시간에 의한 영향을 조사하기 위하여

GO

의

MCV

인

40rnU/rnl

에서

1-6

시간 동안 각각

배양 대뇌신경세포를 배양한 결과

GO

의 처리 시간 에 비례하여 세포의 생존율을 유의하게 감소시켰 다 . (Table

4)

그런데 최근에는 한약추출물을 비롯한 천연추출물 들이 항산화효과나 세포성장인자 등의 약리적 활성 을 가지고있어 腦나 휴隨의 神원病變을 비롯하여 中 風이나 웰과 같은 각종 難治性.횟뽕、의治擔에 매우 效果가 뛰어나다는

%

究들이 보고되고 있다 . 그러므 로 본 실험에서는 여러 腦病變의 原因이라고 밝혀진 嚴素범由훌에 대하여 이의 산화적 손상에 의한 太陰 調뿜場의 效果를 조사하기 위하여 생쥐에서 순수분 리히여 배양한 대뇌신경세포에 홈쫓素自由基의하나인

GO

를 처리한 후 太陰뼈뽑場의 효과를

lipid

peroxidation

측정 및 총단백질량측정 등에 의하여

조사하였다

.

총단백질 조사를 위한

SRB

분석에 있어서

GO

가

10-80rnU/rnl

의 농도로 각각 포함된 배양액에서

배양 대뇌신경세포를

4

시간동안 배양한 다음 총단백 질량은 처리 농도에 비려

l

하여 감소하였으며

MCV

는

40rnU/rnl GO

처 리 에서 나타났다

. (Table 5)

그러

나 40rnU/ml

GO

를 6 시간 동안 신경세포에 처리하

기 전

25-180 ^μ ug/rnl

의 太陰調뽑場을 각각 포함

된 배양액에서

3

시간 동안 전처리 한 경우 처리한 농도에 비례하여 단백질양의 증가를 보였으며

.

특히

90-180 ^μ g/rnl

의 太陰調뿜場 처리에서는 對照群에

비하여

84-93%

以上으로 나타나 이는

40rnU/rnl

GO

만을 처리한 경우

(51.6%)

에 비하여 매우 유의 한 뺑加를 나타냈다 . (Table

6)

또한 GO 가 지질과산화반응에 미치는 영호

t

을 조 사하기 위하여

15-140rnU/rnl

의 여러 농도가 각각