저작자표시-비영리-변경금지 2.0 대한민국 이용자는 아래의 조건을 따르는 경우에 한하여 자유롭게 l 이 저작물을 복제, 배포, 전송, 전시, 공연 및 방송할 수 있습니다. 다음과 같은 조건을 따라야 합니다: l 귀하는, 이 저작물의 재이용이나 배포의 경우, 이 저작물에 적용된 이용허락조건 을 명확하게 나타내어야 합니다. l 저작권자로부터 별도의 허가를 받으면 이러한 조건들은 적용되지 않습니다. 저작권법에 따른 이용자의 권리는 위의 내용에 의하여 영향을 받지 않습니다. 이것은 이용허락규약(Legal Code)을 이해하기 쉽게 요약한 것입니다. Disclaimer 저작자표시. 귀하는 원저작자를 표시하여야 합니다. 비영리. 귀하는 이 저작물을 영리 목적으로 이용할 수 없습니다. 변경금지. 귀하는 이 저작물을 개작, 변형 또는 가공할 수 없습니다.
이학 석사학위 논문
병원성파울러자유아메바의 비접촉
배양에 의한 U87MG 세포의
i
nf
l
ammasome형성 관련인자의
발현 양상
아 주 대 학 교
대 학 원
의생명과학과/
분자의학전공
심 문 희
병원성파울러자유아메바의 비접촉
배양에 의한 U87MG 세포의
i
nf
l
ammasome형성 관련인자의
발현 양상
지도교수
신 호 준
이 논문을 이학 석사학위 논문으로 제출함.
2013년
8월
아 주 대 학 교
대 학 원
의생명과학과/
분자의학전공
심 문 희
심문희의 이학 석사학위 논문을 인준함.
심사위원장
신
호
준
인
심 사 위 원
박
선
인
심 사 위 원
권
명
희
인
국문요약
-병원성파울러자유아메바의 비접촉 배양에 의한 U87MG
세포의 i
nf
l
ammasome형성 관련인자의 발현 양상
병원성 파울러자유아메바(Naegleriafowleri)는 토양,연못,습지 등에 존재하 는 자유생활아메바로서, 사람이나 실험동물에서 원발성 아메바성 수막뇌염 (PAM,primary amebicmeningoencephalitis)을 일으킨다고 알려져 있다.파울러 자유아메바는 오염된 연못,호수에서 수영 또는 수상스포츠를 하는 사람들에게 감염되어 중추신경계 (CNS:centralnervoussystem)에 치명적인 질병을 유발하 게 된다.
U87MG세포(교모세포종)는 중추신경계를 구성하는 세포 중에 하나로 inflammasome형성과 관련하여 사이토카인을 분비하는 것으로 알려져 있다. Inflammasomes은 선천성 면역에서 중심적인 역할을 하며,박테리아 flagellin 등 의 병원체를 감지하고 관련 분자 패턴 (PAMPs)및 요산의 결정 등을 손상시킨 다.Inflammasomes은 NLRP3,IPAF와 같은 NOD유사 수용체(NLR)들로 구성되 며,이들을 포함하는 NLR 단백질로 정의할 수 있다.NLR 단백질은 caspase-1의 활성화로 이어지는 상호작용으로 inflammasome어댑터 단백질인 ASC를 형성하 며,IL-1β와 IL-18활성을 유도한다.원발성 아메바성 수막뇌염을 일으키는 파울 러자유아메바에 감염 되었을 때,뇌세포에서 inflammasome의 형성과 그와 관련 된 인자들의 발현양상이 충분히 밝혀져 있지 않다.
적세포의 inflammasome관련 인자들의 발현양상을 알아보고자 실험을 진행하였 다.
U87MG 세포에 파울러자유아메바를 비접촉적으로 30분,60분,180분 배양하였 을 때 inflammasome형성 관련 인자들의 발현 양상을 관찰하였다.Western blot 과 ELISA 분석결과,파울러자유아메바를 비접촉적으로 배양한 후 U87MG 세포 에서 NLRP3와 IL-1β의 발현이 배양시간에 따라 증가되는 것을 확인하였고, Caspase-1또한 배양 1시간 후 강한 발현이 확인되었다.그리고 NLRP3의 특이 억제제인 Glybenclamide를 처리 한 실험결과에서는,IL-1β와 Caspase-1발현이 감소되는 것을 확인하였다.
결과적으로 파울러자유아메바와 U87MG세포를 비접촉성으로 함께 배양했을 때, NLRP3,ASC,IL-1β,그리고 Caspase-1과 같은 inflammasome형성관련 인 자들의 발현이 증가 되었으며,이러한 인자들이 inflammasome형성에 중요한 역 할을 할 것으로 생각된다.
핵심어
:
파울러자유아메바, inflammasome, U87MG세포, NLRP3, IL-1β, Caspase-1차
례
국문요약 ···ⅰ 차례 ···ⅲ 그림 차례 ···ⅴ Ⅰ.서론 ···1 A.파울러자유아메바 ···1 B.파울러자유아메바의 병인론 ···3 C.파울러자유아메바 inflammasome의 관계 ···6 D.연구목적 ···8 Ⅱ.재료 및 방법 ··· 9 A.파울러자유아메바의 배양 ···9 B.U87MG 세포의 배양 ···9 C.파울러자유아메바에 의한 표적세포의 inflammasome형성관련인자 발현유도 ···10 1.U87MG 세포와 아메바 영양형의 비접촉 배양 ···10 2.세포용해실험 ···10 D.NLRP3,ASC,IL-1β,caspase-1발현 관찰을 위한 Westernblot시행 ···11 1.전체 단백질 채취 ···11 2.Westernblot분석 ···11E.IL-1β,caspase-1발현 측정을 위한 ELISA 분석 ···12
2.Caspase-1의 발현 ···12 F.Inflammsome특이억제제 처리 실험 ···13 Ⅲ.결과 ···14 A.파울러자유아메바의 비접촉 배양에 의한 U87MG 세포의 사멸 ···14 B.파울러자유아메바 배양에 의한 표적세포의 Inflammsome형성관련인자의 발현 관찰 ···16
1.Westernblot분석에 의한 NLRP3,ASC,IL-1β,caspase-1 발현 ···16
2.ELISA분석에 의한 IL-1β,caspase-1발현 ···18
C.Inflammasome억제제 처리에 의한 NLRP3,ASC,1IL-1β,Caspase-1의 발현 관찰 ···21
Ⅳ.고찰 ···23
Ⅴ.결론 ···26
참고문헌 ···27
그 림 차 례
Fig.1.ThelifecycleofN.fowleri····2
Fig.2.ThreehypotheticalmechanismsforN.fowleripathogenesis···5
Fig.3.U87MG cellsco-culturedwithN.fowleritrophozoitesinthe
non-contactsystem usingtissuecultureinsertplate···15
Fig.4.Expressionofinflammasome-relatedmoleculesfrom U87MG cells coculturedwithN.fowleriinanon-contactcultivation ···17
Fig.5.ExpressionofIL-1β from U87MG cellscoculturedwith
N.fowleriinanon-contactcultivation···19
Fig.6.Expressionofcaspase-1from U87MG cellscoculturedwith
N.fowleriinanon-contactcultivation···20
Fig.7.InhibitionofNLRP3,ASC,IL-1β andCasspase-1expression from U87MG cellscoculturedwithN.fowleriusingspecific
Ⅰ.서
론
A.파울러자유아메바 (
Naegl
er
i
af
owl
er
i
)
자유아메바(genusNaegleria)는 토양과 담수 등 광범위한 자연환경에서 자유 생활을 하는 아메바로서 자연 환경에서는 세균들을 포식하는데,특히 병원성 파 울러자유아메바(N.fowleri)는 사람,마우스 및 다른 실험동물에 감염 시 원발성 아메바성 수막뇌염(primary amoebicmeningoencephalitis;PAM)을 유발하여 사 망에 이르게 하는 병원성이 매우 높은 원충이다 (CarterRF,1970;John DT, 1982).
파울러 자유아메바는 35℃의 온도에서 최적으로 생장하며 40-45℃에서도 생 존가능하다.그 생활사 중 영양형,포낭형,편모형 이라 불리는 3가지 형태를 가 지고 있다(Fig.1)(JohnDT,1982;Marciano-CabralF,1988).
파울러자유아메바에 의한 원발성 아메바성 수막뇌염은 오염된 물에서의 목욕 또는 수영과 연관이 있으며,병원성 자유아메바의 수막뇌염 유발 경로는 다수의 아메바영양형이 비강(nasalcavity)을 통해 비강 점막(mucosalmembrane)을 뚫 고 후신경(nasalnerve)을 통하여 후엽(olfactorybulb)과 뇌막을 침범하며 염증을 유발하여 뇌염으로 숙주를 사망에 이르게 한다 (Marciano-CabralF,1990).
Fig.1.ThelifecycleofN.fowleri.N.fowlerichangesitsform according totheenvironmentalconditions.Thestagesareamoeboid,flagellateandcyst.
기후온난화 등과 같은 여러 지구 환경의 변화는 파울러자유아메바 감염 위험을 크게 증가시키고 있으며 (CogoPE 등,2004)전 세계적으로 감염 예가 지속적으 로 보고되고 있는 점을 고려하면 파울러자유아메바의 병인 유발 기전,특히,염 증 유발 기전 규명 연구는 향후 특이 백신 또는 치료제 개발을 위해 매우 중요 하다.원발성 아메바성 수막뇌염의 진단은 생검 시 감염부위에서 아메바 영양형 의 존재,혹은 척수액으로부터의 파울러자유아메바를 배양했을 때 영양형의 유무 와 분리 등을 기초로 한다.이 질환을 일으키는 아메바의 감염부위는 중추신경계 라고 알려져 있다.감염 후 증상은 격심한 두통,식욕부진,메스꺼움,고열(38-4 0℃),구토,뇌막자극의 증후 그리고 뇌염을 동반한 심각한 증상을 일으킨다 (John DT,1982;Martinez AJ 및 Visvesvara GS,1997;Im KI및 Shin HJ, 2004;SchusterFL 및 VisvesvaraGS 2004).
B.파울러자유아메바의 병인론
파울러자유아메바의 병원성 유발기전(pathogenic mechanisms)은 숙주세포에 아메바의 접촉(adhesion)이 일어난 다음 숙주세포사멸을 유도하는 세포병변 효과 (cytopathiceffect)가 일어난다고 보고되었다(van KlinkF 등,1992).파울러자유 아메바는 후신경을 통해서 중추신경계로 들어 갈 수 있는데, sucker-like appendage(food-cup과 동일한 구조로 간주함)또는 amebostome이라는 구조물을 이용한 식세포작용(phagocytosis)과 효소 등을 분비하는 세포용해 과정에 의해서 신경 조직을 파괴한다(SchusterFL 및 Visvesvara GS,2004;Im KI및 Shin HJ,2004;Marciano-CabralF,1988;Marciano-CabralF 등,1990).숙주세포의
fibronectin을 통해 파울러자유아메바가 부착하는데, integrin 유사단백질 및 proteinkinaseC가 관여 한다는 것이 보고되었다(HanKL 등,2004).세포용해에 관여하는 병인 요소로써는 phospholipases(CursonsRT,등 1978;BarbourSE 및 Marciano-CabralF,2001),neuraminidases(EisenD 및 FransonRC,1987),pore forming enzymes(Herbst R 등, 2004), protease등이 보고되고 있다. 한편 Fritzinger 등 (2006)은 보체(complement)의 막공격복합체(membrane attack complex)및 여러 가지 세균의 독소에 의한 pore-forming protein의 공격으로부 터 아메바의 막을 보호하는 CD59-likeprotein을 클로닝하였다.그 외의 여러 보 고된 논문들을 정리하면 파울러자유아메바의 병인기전으로는 다음과 같은 가설 이 가능하다(Fig. 2). 첫번째 병인기전은 접촉성 병인기전(contact-dependent pathogenic mechanism)으로 아메바 세포질의 분출 형태인 food-cup 구조체나 amoebostome 구조체들을 형성하여 표적세포에 부착하여 세포파괴를 유발하는 과정이다(Fig.2).두번째 병인 기전은 비접촉성 병인기전(contact-independent pathogenicmechanism)으로 수용성(soluble)용해물질(cytolyticfactor)들을 분비 하여 표적세포를 파괴하는 과정이다(Fig.2).마지막 세번째는 표적세포에 대한 병인기전은 아니지만 아메바의 생존에 제 3의 중요한 기전으로 알려지고 있는 자가포식(autophagy)과정이다(Fig.2).
Fig.2.ThreehypotheticalmechanismsforN.fowleripathogenesis. (1)Contact-dependentmechanism.(2)Contact-independentmechanism. (3)Autophagymechanism.
C.파울러자유아메바와 i
nf
l
ammasome의 관계
Inflammasomes은 선천성 면역에서 중심적인 역할을 하며,박테리아 flagellin 등의 병원체를 감지하고 관련 분자 패턴 (PAMPs)및 요산의 결정 등을 손상시 킨다.Inflammasomes은 NLRP3,IPAF와 같은 NOD유사 수용체(NLR)들로 구성 되며, 이들을 포함하는 NLR단백질로 정의할 수 있다. NLR 단백질은 caspase-1의 활성화로 이어지는 상호작용으로 inflammasome어댑터 단백질인 ASC를 형성한다.염증성 장 질환,류마티스 관절염과 죽상 경화증과 같은 여러 염증성 질병에서 inflammasomes의 역할이 보고되었다(Chen GY 및 Núñez G, 2011). 파울러자유아메바에 의한 원발성 아메바성 수막뇌염은 병원체의 병인인자의 자극과 숙주세포의 인식에 의해,광범위한 급성염증반응이 빠르게 유도되어 불가 역적인 조직손상이 일어나는 것과 밀접한 관련이 있다.급성 염증반응을 조절하 는 중요한 인자로 염증 사이토카인들이 있으며,이들 사이토카인들은 여러 면역 세포들에서 발현되며,IL-1β는 대표적인 염증 사이토카인으로 면역세포 내에서 IL-1β 전구체 상태로 저장되어 있다가 염증신호가 오면 잘려져서 활성을 갖게 되어 세포 밖으로 방출되어 급성염증반응을 조절한다.이러한 염증신호를 받아 활성형의 IL-1β 생산을 조절하는 세포내 단백질들을 inflammasome 이라고 한 다.이런 염증조절결합체라는 단백질 복합체를 활성화시킴으로서 감염초기에 중 요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 활성화된 inflammasome은 IL-1β와 IL-18의 전구체를 화학적 성숙상태로 전환 시키고,성숙화 된 IL-1β와 IL-18은 세포를 자극하여 외부의 감염으로부터 공격 한다.이처럼 inflammasome은 IL-1β,IL-18등 여러 단백질이 결합되어진 결합
체로 되어있고,그 중 핵심이 되는 중요한 단백질이 NLRP3(NACHT,LRR and PYD domains-containing protein 3)이다.NLRP3는 chromosome1q44에 위치 한 NLRP3유전자에서 전사된 1,016개의 아미노산으로 되어있는 단백질이다.이 NLRP3는 면역세포와 IECs모두에서 발현된다(KummerJA 등,2007;Leemans JC 등 2011).NLRP3 와 함께 더불어 apoptosis와 같은 관련되는 단백질인 Caspase활성화 채용 도메인 (CARD)(ASC)과 caspase-1이 inflammasome 이 라하는 multi-protein complex를 형성한다.이 complex는 특정 조건이 되면 caspase-1의 활성을 촉진시킨다.Caspase-1은 미성숙 사이토카인 IL-1β 전구체 와 IL-18전구체 등을 성숙한 형태로 만드는 역할을 한다(Hong S 등,2011).결 과적으로 caspase-1염증성 사이토카인의 활성화는 IL-1β와 IL-18의 성숙을 촉 진시킨다.
최근 아메바 실험 동물모델 연구를 통한 아메바성 수막뇌염의 병리학적 관찰 결과,중추신경 조직 병변을 일으키는 직접적인 원인이 아메바 감염에 대한 숙주 의 염증반응과 다형핵 세포(polymorphonuclearcell)의 분해라는 연구 결과가 보 고되었다(Cervantes-Sandoval등,2008).그동안 아메바 감염에 의한 중추신경 조직의 병변이 아메바와의 직접적인 접촉에 의한 것이라는 관점에서 벗어나 숙 주세포의 과도한 면역반응이 가장 중요한 원인이 된다는 사실을 알게 되었다.파 울러자유아메바에 의한 숙주의 면역반응은 외부로부터 IL-8,IL-1β 또는 TNF-α 와 같은 염증성 사이토카인을 실험동물의 뇌로 직접 주입을 해도 뚜렷한 변화가 없었으며 (Andersson PB 등,1992),실험 동물 모델을 통한 생체내 관찰 결과, 아메바 감염 시 아메바 영양형이 많이 존재하더라도 숙주 염증세포가 없는 부위 에서는 오히려 숙주세포 용해능이 감소됨이 관찰되었다 (GianinazziC 등,2005). 따라서 원발성 아메바성 수막뇌염의 인체 내에서의 병인 기전을 연구하기 위해
서는 아메바 감염시 숙주 면역세포들의 염증반응과 이를 촉발할 수 있는 아메바 유래 분비 물질들에 대한 연구가 매우 시급한 실정이다.급성염증을 유발하는 병 원체의 감염기전에 관한 최근의 연구 결과들은 병원체 감염에 의해 유도되는 급 성염증반응이 면역세포에서 생산되는 염증성 사이토카인 IL-1β 및 IL-18과 직접 적인 관련이 있음을 제시해 주고 있다 (NeteaMG 등,2010).
D.연구목적
면역세포 내 inflammasome 형성은 병원체의 병원성물질을 면역세포의 특정 수용체가 인식하여 유도되며,세포내 여러 가지 신호전달물질(ROS,tyrosine kinase등)의 활성에 의해 유도된다.그러나 파울러자유아메바에 의한 IL-1β 분 비과정에 관여하는 숙주 수용체에 대한 정보는 알려진 것이 전혀 없다. 본 연구는 아메바 유래 분비인자가 표적세포의 inflammasome형성과 관련하 여 어떤 관련인자들의 발현에 관여되는지 실험을 통해 밝히고자 하였다.병원성 파울러자유아메바의 영양형을 비접촉 배양 상태에서 표적세포인 U87MG 세포들 과 배양한 후,inflammasome 형성관련인자로 IL-1β,NLRP3,Caspase-1, ASC 등의 발현을 알아보고자 W estern blot과 ELISA 실험을 시행하였다.더 불어 inflammasome형성에 관여하는 NLRP3의 특이억제제를 처리하여 발현정 도의 변화를 관찰하고자 하였다.Ⅱ.재료 및 방법
A.파울러자유아메바의 배양
파울러자유아메바 (CarterNF69 균주;ATCC No.30215)는 Nelson's 배지 (Willaert,1971)를 이용하여 37℃에서 무균 배양하였다.배양하여 얻은 아메바 영 양형을 800 x g에서 3분 동안 원심분리 하여 침사액을 인산염완충식염수 (phosphate-bufferedsaline:PBS)로 한 번 세척한 후,다시 원심분리 하였다.모 은 침사액을 1% penicillin/streptomycin을 첨가한 DMEM (Dulbecco'smodified EagleMedium,Welgene,Korea)배지를 사용하여 재 부유 시켜 실험에 이용 하 였다.
B.U87MG 세포의 배양
사람 교모세포주인 U87MG 세포주는 5% 우태아 혈청 (fetalbovineserum; FBS,invitrogen,CA,USA),1% penicillin/streptomycin을 첨가한 DMEM배지를 사용하여 37℃,5% CO₂항온기에 무균 배양하였다.
C. 파울러자유아메바에 의한 표적세포의 i
nf
l
ammasome 형성
관련인자 발현 유도
1.U87MG 세포와 아메바 영양형의 비접촉 배양
Tissue insert Plate(Corning, costar, Incorporated US)에 U87MG 세포를 3x10⁵의 개수로 배양하였다. 파울러자유아메바를 혼합배양 하기 전에 1% penicillin/streptomycin을 첨가한 DMEM배지로 세포성장을 정지시켜주고 파울러 자유아메바는 U87MG 세포보다 10배의 농도(3x10⁶개)로 하여 비접촉적으로 30 분,1시간,3시간으로 혼합배양 하였다.또한 대조군으로 TRAIL (TNF-Related ApoptosisInducing Ligand)을 500ng/ml의 농도로 처리하여 6시간 배양하였으 며, inflammasome 유도에 기여하는 LPS(Lipopolysaccaride, Sigma, USA)를 10ng/ml의 농도로 실험에 사용하였다.
2.세포용해실험
U87MG 세포들에 파울러자유아메바 영양형을 비접촉적으로 3x10⁶개 혼합배양
하여 30분, 1시간, 3시간 별로 관찰하였다. 이후 U87MG세포들에 Tripsin-EDTA(Tripsin Ethylenediaminetetraaceticacid)를 처리한 후 2분 후에 1% penicillin/streptomycin을 첨가한 DMEM배지로 세포를 모아 1,500 rpm에서 3분 동안 원심분리 하여 침사액을 얻었다.이 침사액을 인산염완충식염수로 한 번 세척한 후 다시 원심분리 하였다. 그 후 Cell lysis buffer (Intron Biotechnolohy,Seongnam,Korea)를 100㎕을 넣어 세포를 용해 시켰다.그리고 4℃에서 20분동안 용해시킨 후 13,000rpm에서 20분 원심분리 하였다.그리고 세
포전체단백질을 얻어 새 튜브에 옮긴 후 -20℃에서 보관하였다.
D.NLRP3,ASC,I
L-1β,caspase-1발현 관찰을 위한
West
er
n bl
ot시행
1.전체 단백질 채취 비접촉 상태에서 3x10⁶개의 파울러자유아메바 영양형을 U87MG 세포에 30분, 1시간,3시간동안 혼합배양 하여 세포를 모은 후 Celllysisbuffer100㎕를 넣어 세포를 용해 시켰다.그리고 4℃에서 20분동안 용해시킨 후 13,000rpm에서 20분 간 원심분리 하였다.그리고 세포전체단백질을 얻어 새 튜브에 옮긴 후 -4℃에서 보관하였다.그 후 Sptectrophotometer로 단백질 농도를 측정하였다. 2.Western blot분석모은 단백질에 SDS-PAGE sampleloading buffer를 첨가하였으며,5분간 끓 인 후 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)gel에 적하하여 80V로 전기영동 하였다.이 acrylamidegel단백질 을 Nitrocellulose Membranes (NC,whatman Co,Bedford,MA,USA)으로 250mA에서 2시간 전기 이동하였고,3% BSA(Bovineserum albumin)로 실온에 서 2시간 동안 blocking시켰다.그리고 나서 NC막을 1% PBST로 세척하였으 며, 1차 항체는 Rabbit polyclonal anti-IL-1β antibody, rabbit polyclonal anti-Caspase-1 antibody, rabbit polyclonal anti-ASC antibody, rabbit polyclonalanti-NLRP3 antibody를 각각 1:500으로 희석하여 O/N 반응 시켰고,
2차 항체는 Anti-RabbitIgG HRP (horseradishperoxidase)conjugate를 1:5000으 로 희석하여 실온에서 2시간 반응시켰으며, 세척 후 Enhanced Chemical Luminescence(ECL,Amersham Biosciences,Buckinghamshire,England)로 확 인하였다.
E.I
L-1β,caspase-1발현 측정을 위한 ELI
SA 분석
1.IL-1β의 발현
IL-1β의 발현은 ELISA kit(R&D Systems,USA)를 이용하여 측정하였다.플 레이트에 Standard를 각각 0,3.9,7.8,15.6,31.2,62.5,125,250pg/ml의 농도로 단계희석하여 200㎕/ml씩 첨가하였다.동시에 세포전체단백질 sample도 함께 200㎕/ml씩 첨가한뒤,실온에서 2시간동안 배양하였다.다음 1% PBST로 1분씩 3번 세척하였다.IL-1β Conjugate를 200㎕/ml씩 첨가한 후 실온에서 1시간 배 양하였다.다시 1% PBST로 1분씩 3번 세척한 뒤,SubstrateSolution을 1:1비율 로 200㎕/ml씩 첨가하였다.20분 뒤 Stop soultion을 50㎕/ml씩 첨가하고, Microplatereader기로 450nm에서 측정하였다.
2. Caspase-1의 발현
Caspase-1의 발현은 ELISA kit(R&D Systems,USA)를 이용하여 측정하 였다.플레이트에 RD1W Soulution을 50㎕/ml씩 첨가 하였다.Standard를 각각 의 농도가 0,6.25,12.5,25,50,100,200,400pg/ml의 농도로 단계희석 하여 100 ㎕/ml씩 첨가하였다.동시에 세포전체단백질 sample도 함께 100㎕/ml씩 첨가
한 뒤,실온에서 1시간30분 동안 배양하였다.다음 1% PBST로 1분씩 3번 세척 하였다.Caspase-1Antiserum을 100㎕/ml씩 첨가한 후 실온에서 30분간 배양하 였다.다시 1% PBST로 1분씩 3번 세척한 뒤,Caspase-1 Conjugate 100㎕/ml 씩 첨가하였다.1% PBST로 1분씩 3번 세척한 뒤,SubstrateSolution을 1:1비율 로 200㎕/ml씩 첨가하였다.20분 뒤 Stop soultion을 50㎕/ml씩 첨가하고, Microplatereader기로 450nm에서 측정하였다.
F.I
nf
l
ammsome특이 억제제 처리실험
U87MG 세포의 inflammasome발현을 유도하는 신호물질들이 억제 되는지 알 아보기 위하여 NLRP3의 특이 억제제인 Glybenclamide(Invivogen,San Diego, CA 92121-USA)를 사용 하였다.6-wellplate에 3x10⁵개수로 세포를 분주 한 후 37℃,5% 배양기에서 배양하였다.그 후 3x10⁶개의 파울러자유아메바를 비접촉 적으로 혼합배양 한 후 30분,1시간,3시간 후에 각각 관찰하였으며,TRAIL과 LPS,파울러자유아메바 전체세포추출물(N.fowlerilysate)처리 후 6시간 뒤에 억 제제를 처리하였다.억제제의 농도는 0.25mg/ml을 사용하였다.억제제를 처리 한 후 24시간이 지난 뒤에 세포를 모아 Westernblot으로 실험하였다.
Ⅲ.결
과
A.파울러자유아메바의 비접촉 배양에 의한 U87MG 세포의 사멸
Tissuecultureinsertplate를 통해 파울러자유아메바와 U87MG 세포를 비접촉 상태에서 함께 배양한 후,광학현미경을 이용하여 표적세포의 형태학적인 변화를 관찰하였다.특히 TRAIL은 세포사를 유도하는 TNF 가족군으로써 정상세포는 보존하고 암세포는 선택적으로 apoptosis를 유발하여 세포사를 일으킨다.또한 대표적인 면역 활성 요소인 LPS(lipopolysaccharide)는 inflammasome반응과 비 교할 수 있도록 실험에 사용하였다.그 결과 배양 시간이 경과 할수록 표적세포 의 사멸이 증가함을 알 수 있었다 (Fig.3).이러한 연구 결과는 파울러자유아메바 가 표적세포인 U87MG 세포에 직접 접촉하지 않았을 경우에도 다른 형태로 표적 세포에 세포독성을 유도한다는 것을 제시해 준다.이 연구 결과는 파울러자유아메 바의 분비 단백질이 강한 비접촉성 숙주세포 사멸 기전을 유도함과 동시에 inflammasome형성 관련인자에도 관여할 수 있음을 보여준다.Fig.3.U87MG cells cocultured with N.fowleri trophozoites in the non-contactsystem using tissuecultureinsertplate.
B.파울러자유아메바 배양에 의한 표적세포의 i
nf
l
ammasome
형성 관련인자의 발현 관찰
1.Western blot분석에 의한 NLRP3,ASC,IL-1β,caspase-1발현
파울러자유아메바의 비접촉배양에 대해 표적세포(U87MG)에서 inflammasome 형성 관련인자가 발현되는지 알아보고자,U87MG 세포에 파울러자유아메바를 비 접촉으로 혼합배양 하여 실험하였다.TRAIL 처리 후 6시간동안 경과를 지켜봤 고, 파울러자유아메바는 3x10⁶개로 처리하였다(Fig.4).TRAIL은 500ng/ml의 농도를 사용하였다.U87MG 세포의 inflammfasome형성관련인자 발현은 30분에 서 1시간까지 가장 높게 보였고 3시간까지 발현되었다.IL-β의 발현은 파울러자 유아메바를 혼합배양 후 1시간 째 가장 강하게 발현되는 것을 확인할 수 있었다. NLRP3는 파울러자유아메바 혼합배양 후 시간이 지남에 따라 점차 강하게 발현 되는 모습이 확인 되었고,caspase-1의 발현도 파울러자유아메바 혼합배양 후 30 분 째에서 발현이 가장 강했고,그 이후 점차 발현이 약한 모습으로 나타나는 것 을 확인하였다.ASC의 발현은 30분,1시간,3시간 째 모두 비슷한 발현을 보여주 었다.결과적으로 본 실험을 통해 파울러자유아메바의 비접촉성 배양으로 인해 U87MG 세포에서 inflammasome형성관련인자 발현이 유도됨을 알 수 있었다.
Fig. 4. Expression of inflammasome-related molecules from U87MG cells cocultured with N. fowleri in a non-contact cultivation. Cell extracts prepared from U87MG cells cocultured with N. fowleri were subjected to Western blot analysis using NLRP3 (118kDa),ASC (24kDa), IL-1β (31kDa)and Caspase-1(39kDa)antibodies.Lane1;Control(U87MG cell only),lane2;TRAIL treatment,lane3;N.fowlericocultivation (30min),lane4;
2.ELISA분석에 의한 IL-1β,caspase-1발현
파울러자유아메바의 비접촉배양에 대한 표적세포(U87MG세포)에서의 inflammasome형성 관련인자발현을 알아보기 위해 IL-1β와 Caspase-1의 발현을 ELISA로 확인하였다(Fig.5).U87MG 세포에 파울러자유아메바를 30분,1시간, 3시간 동안 혼합배양을 하였을 때,IL-1β 발현이 1시간 후 가장 강하게 유도되 었고, 3시간 후에는 발현이 감소됨을 알 수 있었다.Caspase-1의 경우,파울러 자유아메바를 혼합배양 후 시간이 지남에 따라 Caspase-1의 발현양이 점차 높아 지는 것을 확인하였다(Fig.6).
Fig. 5. Expression of IL-1β from U87MG cells cocultured with N.
fowleriin a non-contactcultivation.Cellextracts prepared from U87MG cells cocultured with N.fowleritrophozoitesweresubjected to ELISA using IL-1β antibodies.
Fig.6.Expression ofcaspase-1 from U87MG cells cocultured with N.
fowleriin a non-contactcultivation.Cellextracts prepared from U87MG cells cocultured with N.fowleritrophozoitesweresubjected to ELISA using Caspase-1antibodies.
C. I
nf
l
ammasome 억제제에
의한
NLRP3, ASC, I
L-1β,
Caspase-1의 발현 관찰
Inflammasome을 유발하는 단백질활성의 연관성을 알아보고자 U87MG 세포에 파울러자유아메바를 비접촉적으로 혼합배양 한 후 NLRP3 특이억제제 (Glybenclamide)를 처리하였다. 그 결과 TRAIL과 LPS 그리고 파울러자유아메 바 전체세포추출액을 처리하여 배양한 U87MG세포로부터 NLRP3와 IL-1β, Caspase-1발현이 감소하는 것을 확인 할 수 있었다.비접촉 혼합배양 상태에서 파울러자유아메바를 30분,1시간,3시간 동안 배양한 경우 표적세포인 U87MG세 포의 IL-1β,Caspase-1,NLRP3,ASC의 발현이 특이억제제인 glybenclamide에 의해서 억제되는 것을 알 수 있었다(Fig.7).
Fig.7.Inhibition of NLRP3,ASC,IL-1β and Casspase-1 expression from U87MG cells cocultured with N.fowleriusing specific inhibitor. Cell extracts prepared from U87MG cells cocultured with N. fowleri
trophozoites in a non-contact cultivation were subjected to Western blot analysis.Lane1;U87MG only,lane2;TRAIL,lane3;LPS,lane4;N.fowleri
lysate,lane5;N.fowlericocultivationfor30min,lane6;N.fowlericocultivation for60min,lane7;N.fowlericocultivationfor180min.
Ⅳ.고
찰
파울러자유아메바(Naegleria fowleri)는 자연환경 속에서 서식하는 자유생활 아메바로서,인체에서 원발성 아메바성 수막뇌염(PAM)을 유발하여 사망에 이르 게 하는 고병원성 원충으로 알려져 있다.파울러자유아메바는 비강으로 침입하 여,비강점막과 후엽을 관통하여 뇌 조직 세포로 부착해 심한 염증(inflamation) 을 유발한다.이러한 아메바의 침투 능력은 파울러자유아메바의 병원성 유발기전 에 중요한 역할을 한다(Marcino-CabralF,1988).이러한 배경으로 최근 primary cultureratmicroglial세포가 숙주의 방어 작용을 관찰하고자 하였는데,파울러 자유아메바와 혼합 배양한 microglial 세포들에서 방어적인 면역반응으로 TNF-α,IL-1β,IL-6 등의 염증관련 사이토카인들이 분비되는 것을 밝혔다(Oh YH 등,2005).본 연구에서는 사람의 교모세포종인 U87MG 세포에 파울러자유 아메바를 비접촉적으로 혼합배양 하였을 때, IL-1β와 Caspase-1, 그리고 inflammasome complex를 구성하는 NLRP3와 ASC의 발현을 Western blot과 ELISA를 통하여 관찰하였다.먼저 Western blot결과 파울러자유아메바를 비접 촉성으로 혼합배양 한 후 30분,1시간,3시간까지 inflammasome형성관련인자가 유도되었으며, IL-1β와 Caspase-1,NLRP3가 가장 강하게 발현되는 순간은 파 울러자유아메바 혼합배양 후 1시간 때임을 확인하였다.그리고 ELISA실험 결과 에서 IL-1β발현은 파울러자유아메바 혼합배양 후 1시간 때 가장 강하게 나타났 다.그에 비해 Caspase-1발현은 파울러자유아메바 혼합배양 후 30분,1시간,3시 간 째 시간의 경과에 따라 반응이 점점 증가하는 것을 확인할 수 있었다.따라서 본 연구에서는 파울러자유아메바에 의한 비접촉성 배양이 inflammasome형성관 련인자의 활성화에 기여한다는 것을 관찰하였다.Inflammasome특이 억제제를 처리하였을 때 Caspase-1이 눈에 띄게 감소되 는 것을 확인 할 수 있었는데,이는 Caspase-1이 inflammsome형성에 필수적으 로 연관되어 있다고 판단된다.파울러자유아메바를 비접촉적으로 혼합배양 한 U87MG 세포에서 다양한 inflammasome 형성관련인자 단백질이 발현되는 것으 로 보았을 때,파울러자유아메바의 비접촉성 배양에 의해 표적세포에서 발현된 IL-1β,Caspase-1,NLRP3,ASC가 아마도 중추신경계 inflammasome반응과 관 련이 있을 것이라고 추측이 된다.하지만 파울러자유아메바의 의한 직접적인 세 포신호전달에서 어떤 활성을 요구하는지에 대한 연구는 아직 확인되지 않았다. 따라서 파울러아메바와의 생존에 연관된 유전자 뿐 아니라,inflammsome발현을 유도하는 다양한 단백질을 찾아 그의 대한 신호전달 특성과 관계를 연구해야 할 것으로 생각된다.
본 연구에서 NLRP3inflammasome형성관련인자를 구성하는 ASC발현은 변 화가 없었는데 비하여 NLRP3와 Caspase-1,IL-1β의 발현은 확인이 되었다.이 에 따른 실험으로는 CRT-MG 세포라인으로도 같은 실험을 해 보았으나 마찬가 지로 IL-1β,NLRP3,Caspase-1과는 다르게 ASC에서는 발현에 대한 변화가 없 는 차이를 보여 주었다.또한 THP-1세포에 Mycobacterium kansasii를 혼합배 양 하여 Caspase-1의 활성화와 IL-1β분비에 대한 실험결과를 보았을 때 ASC의 발현에는 변화가 없었다(ChenCC 등,2012).이러한 내용을 바탕으로 추측해 보 면,ASC는 inflammasome형성하는 관련인자 요인 중 하나이지만,파울러자유아 메바 뿐만 아니라 Mycobacterium kansasii를 혼합배양 하였을 때와 마찬가지로, ASC의 발현을 Caspase-1의 활성화와 그에 따른 IL-1β의 발현과는 상관이 없다 고 판단된다.하지만 inflammasome형성을 구성하는 필수요인 중 하나로서 그의 대한 정확한 기전은 앞으로 좀 더 연구해 볼 필요가 있다고 생각한다.파울러자
유아메바를 처리하지 않았을 때에도 U87MG 세포에 IL-1β와 NLRP3,ASC가 발 현되는 모습을 보며 추가연구가 필요한 것으로 생각된다.이에 따른 정확한 뒷받 침 하는 근거를 마련하기 위해 파울러자유아메바의 혼합배양이 없이 오직 U87MG 세포만을 complete media와 incomplete media로 다양하게 배양해 Western blot을 시행한 결과,파울러자유아메바에 대한 공동배양이 없이 오직 U87MG 세포에서도 파울러자유아메바를 혼합배양 한 실험군에 비해서는 아주 미세한 발현을 확인할 수 있었다.
결과적으로 파울러자유아메바와 U87MG세포를 비접촉성으로 함께 배양했을 때, NLRP3,ASC,IL-1β,그리고 Caspase-1과 같은 inflammasome형성관련 인 자들의 발현이 증가 되었으며,이러한 인자들이 inflammasome형성에 중요한 역 할을 할 것으로 생각된다.
Ⅴ.결
론
본 연구는 원발성 아메바성 수막뇌염을 유발하는 파울러자유아메바에 대한 병 원성 유발기전 중 염증반응을 이해하기 위해 파울러자유아메바를 비접촉적으로 U87MG 세포주와 혼합배양 하여 실험하였다.먼저 비접촉 배양에서 파울러자유 아메바에 의한 숙주세포 사멸이 시간이 지남에 따라 증가되었다.파울러자유아메 바를 비접촉적으로 혼합배양 하였을 때 inflammasome형성에 연관된 단백질의 활성을 알아보기 위하여,NLRP3,Caspase-1,IL-1β의 발현을 관찰하였다.파울 러자유아메바가 혼합배양 된 U87MG세포에서 IL-1β,Caspase-1,NLRP3의 발 현양상을 Western blot을 시행하여 확인 한 결과,배양시간에 따라 발현양이 증 가됨이 관찰되었다.또한 ELISA 실험 결과,파울러자유아메바를 혼합배양한 뒤 30분부터 1시간까지가 IL-1β가 높게 발현됨을 알 수 있었으며,Caspase-1은 파 울러자유아메바를 혼합배양 한 후 시간의 경과에 따라 점차 증가함을 확인할 수 있었다.한편,inflammasome의 특이 억제제인 Glybenclamide를 처리 한 결과 Caspase-1,IL-1β의 발현이 감소함을 확인하였다.본 실험결과 U87MG 세포와 파울러자유아메바의 비접촉적인 배양 후,표적세포로부터 IL-1β와 Caspase-1, NLRP3 발현이 증가되었으며,이런 인자들의 발현증가는 inflammasome형성에 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.참 고 문 헌
1. Andersson PB, Perry VH, Gordon S. Intracerebral injection of proinflammatory cytokines or leukocyte chemotaxins induces minimal myelomonocytic cell recruitment to the parenchyma of the central nervoussystem.JExpMed,176(1):255-259,1992
2.BarbourSE,Marciano-CabralF.Naegleria fowleriamoebae express a membrane-associated calcium-independent phospholipase A(2).Biochim BiophysActa,1530(2-3):123-133,2001
3.CarterRF.Description ofa Naegleria sp.isolated from two cases of primary amoebic meningo-encephalitis, and of the experimental pathologicalchangesinducedbyit.JPathol,100(4):217-244,1970
4.Cervantes-SandovalI,Serrano-Luna Jde J,García-Latorre E,Tsutsumi V,ShibayamaM.Characterization ofbrain inflammation during primary amoebicmeningoencephalitis.ParasitolInt,57(3):307-313,2008
5.Chen CC,TsaiSH,Lu CC,Hu ST,Wu TS,Huang TT,Saïd-SadierN, Ojcius DM,LaiHC.Activation ofan NLRP3 inflammasome restricts
6. Chen GY, Núñez G. Inflammasomes in intestinal inflammation and cancer.Gastroenterology,141(6):1986-1999,2011
7.Cogo PE,ScagliM,GattiS,RossettiF,Alaggio R,Laverda AM,Zhou L,Xiao L,Visvesvara GS.FatalNaegleria fowlerimeningoencephalitis, Italy.Emerg InfectDis,10(10):1835-1837,2004
8. Cursons RT, Brown TJ. Use of cell cultures as an indicator of pathogenicityoffree-livingamoebae.JClinPathol,31(1):1-11,1978
9.Eisen D,Franson RC.Acid-active neuraminidases in the growth media from culturesofpathogenicNaegleriafowleriand in sonicatesofrabbit alveolarmacrophages.Biochim BiophysActa,924(2):369-372,1978
10.GianinazziC,Schild M,MüllerN,Leib SL,Simon F,NuñezS,JossP, Gottstein B.Organotypic slice cultures from ratbrain tissue:a new approach for Naegleria fowleriCNS infection in vitro.Parasitology,
131:797-804,2005
11.Han KL,LeeHJ,Shin MH,ShinHJ,Im KI,ParkSJ.Theinvolvement ofan integrin-likeprotein and protein kinaseC in amoebicadhesion to fibronectinandamoebiccytotoxicity.ParasitolRes,94(1):53-60,2004
12.HerbstR,Marciano-CabralF,LeippeM.Antimicrobialandpore-forming peptides of free-living and potentially highly pathogenic Naegleria fowleriare released from the same precursormolecule.J BiolChem,
279(25):25955-25958,2004
13.Shin HJ,Im KI.Pathogenic free-living amoebae in Korea.Korean J Parasitol,42(3):93-119,2004
14. John DT. Primary amebic meningoencephalitis and the biology of
Naegleriafowleri.AnnuRevMicrobiol,36:101-123,1982
15.KummerJA,Broekhuizen R,EverettH,AgostiniL,Kuijk L,Martinon F,van Bruggen R,TschoppJ.InflammasomecomponentsNALP 1and 3 show distinct but separate expression profiles in human tissues suggesting a site-specific role in the inflammatory response. J
Histochem Cytochem,55(5):443-452,2007
16.LeemansJC,CasselSL,SutterwalaFS.Sensing damageby theNLRP3 inflammasome.ImmunolRev,243(1):152-162,2011
17. Marciano-Cabral F. Biology of Naegleria spp. Microbiol Rev,
18. Marciano-Cabral F, Zoghby KL, Bradley SG. Cytopathic action of
Naegleria fowleri amoebae on rat neuroblastoma target cells. J
Protozool,37(2):138-144,1990
19.Martinez AJ,Visvesvara GS.Free-living,amphizoic and opportunistic amebas.BrainPathol,7(1):583-598,1997
20.Netea MG,Simon A,van deVeerdonk F,Kullberg BJ,Van derMeer JW, Joosten LA. IL-1beta processing in host defense: beyond the inflammasomes.PLoS Pathog,6(2):e1000661,2010
21.OhYH,JeongSR,Kim JH,SongKJ,Kim K,ParkS,SohnS,ShinHJ. Cytopathic changes and pro-inflammatory cytokines induced by
Naegleria fowleri trophozoites in rat microglial cells and protective effectsofananti-Nfa1antibody.ParasiteImmunol,27(12):453-459,2005
22.SchusterFL,VisvesvaraGS.Free-living amoebaeasopportunisticand non-opportunistic pathogens of humans and animals.Int J Parasitol,
34(9):1001-1027,2004
23.van Klink F,Alizadeh H,StewartGL,Pidherney MS,Silvany RE,He Y, McCulley JP, Niederkorn JY. Characterization and pathogenic potential of a soil isolate and an ocular isolate of Acanthamoeba
castellanii in relation to Acanthamoeba keratitis. Curr Eye Res,
11(12):1207-1220,1992
24.Young JD,LowreyDM.Biochemicalandfunctionalcharacterizationofa membrane-associated pore-forming protein from the pathogenic ameboflagellate Naegleria fowleri. J Biol Chem, 264(2):1077-1083, 1989
ABSTRACT
-Expr
essi
on ofi
nf
l
ammasome-r
el
at
edmol
ecul
esf
r
om
U87MG cel
l
scocul
t
ur
edwi
t
hNaegl
er
i
af
owl
er
ii
n t
he
non-cont
actsyst
em
MoonHe
eSi
m
Depa
r
t
mentofMi
c
r
obi
ol
ogy,Aj
ouUni
ver
s
i
t
y
(
Supe
r
vi
s
e
dbyHo-J
oonShi
n,Ph.
D)
Naegleria fowleri,a free living amoeba widespread in moistsoil,water and sediment,existas a virulent pathogen causing fetalprimary amoebic meningoencephalitis(PAM)inexperimentalanimalsandinhumam.
Inflammasomes are large intracellularmultiprotein complexes thatplay a centralrolein innateimmunity.They detectandrespondtoalargerangeof pathogen-associated molecularpatterns (PAMPs),including bacterialflagellin, and damage-associated molecular patterns (DAMPs), such as uric acid crystals.inflammasomescompriseamemberoftheNOD-likereceptor(NLR) family,such asNLRP3 and IPAF,and aredefined by theNLR protein that
they contain.The NLR protein recruits the inflammasome-adaptor protein, ASC, which in turn interacts with caspase-1 leading to its activation. Consequently caspase-1 promotes the maturation of the proinflammatory cytokines such as,interleukin IL-1β and IL-18.Inflammasome activation is crucialforhostdefense to pathogens,butrecentstudies have also found a role for the inflammasomes in the pathogenesis of several inflammatory diseases such as inflammatory bowel disease, rheumatoid arthritis and microorganism infection.
To observe the induction ofinflammasome-related molecules from target cellscoculturedwithN.fowleritrophozoitesinanon-contactsystem,U87MG cellswerecultured with TRAIL,LPS andamoebictrohozoitesfor30,60and 180mins,respectively.By Western blotting and ELISA analysis,amountsof IL-1β and NLRP3 protein from U87MG cells cocultured with N.fowleri
trophozoites were increased a time-dependentmanner.Amountofcaspase-1 wasincreased at60min.On theotherhand,when theglybenclamidewhich is a specific-NLRP3 inhibitor was treated on the coculture system,the expressionofIL-1β,NLRP3andcaspase-1weredown-regulated.
Thus,this study showed thatthe targetcells (U87MG cells)cocultured with N. fowleri trophozoites in a non-contact system secret some inflammasomes,NRLP3,caspase-1 and IL-1β,which may play an important roleontheinflammationresponse.
