파울러자유아메바 배양에 의한 표적세포의

1.Western blot분석에 의한 NLRP3,ASC,IL-1β,caspase-1발현

파울러자유아메바의 비접촉배양에 대해 표적세포(U87MG)에서 inflammasome 형성 관련인자가 발현되는지 알아보고자,U87MG 세포에 파울러자유아메바를 비 접촉으로 혼합배양 하여 실험하였다.TRAIL 처리 후 6시간동안 경과를 지켜봤 고, 파울러자유아메바는 3x10⁶개로 처리하였다(Fig.4).TRAIL은 500ng/ml의 농도를 사용하였다.U87MG 세포의 inflammfasome형성관련인자 발현은 30분에 서 1시간까지 가장 높게 보였고 3시간까지 발현되었다.IL-β의 발현은 파울러자 유아메바를 혼합배양 후 1시간 째 가장 강하게 발현되는 것을 확인할 수 있었다.

NLRP3는 파울러자유아메바 혼합배양 후 시간이 지남에 따라 점차 강하게 발현 되는 모습이 확인 되었고,caspase-1의 발현도 파울러자유아메바 혼합배양 후 30 분 째에서 발현이 가장 강했고,그 이후 점차 발현이 약한 모습으로 나타나는 것 을 확인하였다.ASC의 발현은 30분,1시간,3시간 째 모두 비슷한 발현을 보여주 었다.결과적으로 본 실험을 통해 파울러자유아메바의 비접촉성 배양으로 인해 U87MG 세포에서 inflammasome형성관련인자 발현이 유도됨을 알 수 있었다.

Fig. 4. Expression of inflammasome-related molecules from U87MG cells cocultured with N. fowleri in a non-contact cultivation. Cell extracts prepared from U87MG cells cocultured with N. fowleri were subjected to Western blot analysis using NLRP3 (118kDa),ASC (24kDa), IL-1β (31kDa)and Caspase-1(39kDa)antibodies.Lane1;Control(U87MG cell only),lane2;TRAIL treatment,lane3;N.fowlericocultivation (30min),lane4;

N.fowlericocultivation(60min),lane5;N.fowlericocultivation(180min).

2.ELISA분석에 의한 IL-1β,caspase-1발현

파울러자유아메바의 비접촉배양에 대한 표적세포(U87MG세포)에서의 inflammasome형성 관련인자발현을 알아보기 위해 IL-1β와 Caspase-1의 발현을 ELISA로 확인하였다(Fig.5).U87MG 세포에 파울러자유아메바를 30분,1시간, 3시간 동안 혼합배양을 하였을 때,IL-1β 발현이 1시간 후 가장 강하게 유도되 었고, 3시간 후에는 발현이 감소됨을 알 수 있었다.Caspase-1의 경우,파울러 자유아메바를 혼합배양 후 시간이 지남에 따라 Caspase-1의 발현양이 점차 높아 지는 것을 확인하였다(Fig.6).

Fig. 5. Expression of IL-1β from U87MG cells cocultured with N.

fowleriin a non-contactcultivation.Cellextracts prepared from U87MG cells cocultured with N.fowleritrophozoitesweresubjected to ELISA using IL-1β antibodies.

Fig.6.Expression ofcaspase-1 from U87MG cells cocultured with N.

fowleriin a non-contactcultivation.Cellextracts prepared from U87MG cells cocultured with N.fowleritrophozoitesweresubjected to ELISA using Caspase-1antibodies.

C. I nf l ammasome 억제제에 의한 NLRP3, ASC, I L-1β, Caspase-1의 발현 관찰

Inflammasome을 유발하는 단백질활성의 연관성을 알아보고자 U87MG 세포에 파울러자유아메바를 비접촉적으로 혼합배양 한 후 NLRP3 특이억제제 (Glybenclamide)를 처리하였다. 그 결과 TRAIL과 LPS 그리고 파울러자유아메 바 전체세포추출액을 처리하여 배양한 U87MG세포로부터 NLRP3와 IL-1β, Caspase-1발현이 감소하는 것을 확인 할 수 있었다.비접촉 혼합배양 상태에서 파울러자유아메바를 30분,1시간,3시간 동안 배양한 경우 표적세포인 U87MG세 포의 IL-1β,Caspase-1,NLRP3,ASC의 발현이 특이억제제인 glybenclamide에 의해서 억제되는 것을 알 수 있었다(Fig.7).

Fig.7.Inhibition of NLRP3,ASC,IL-1β and Casspase-1 expression from U87MG cells cocultured with N.fowleriusing specific inhibitor. Cell extracts prepared from U87MG cells cocultured with N. fowleri trophozoites in a non-contact cultivation were subjected to Western blot analysis.Lane1;U87MG only,lane2;TRAIL,lane3;LPS,lane4;N.fowleri lysate,lane5;N.fowlericocultivationfor30min,lane6;N.fowlericocultivation for60min,lane7;N.fowlericocultivationfor180min.

Ⅳ.고 찰

Inflammasome특이 억제제를 처리하였을 때 Caspase-1이 눈에 띄게 감소되

유아메바를 처리하지 않았을 때에도 U87MG 세포에 IL-1β와 NLRP3,ASC가 발 현되는 모습을 보며 추가연구가 필요한 것으로 생각된다.이에 따른 정확한 뒷받 침 하는 근거를 마련하기 위해 파울러자유아메바의 혼합배양이 없이 오직 U87MG 세포만을 complete media와 incomplete media로 다양하게 배양해 Western blot을 시행한 결과,파울러자유아메바에 대한 공동배양이 없이 오직 U87MG 세포에서도 파울러자유아메바를 혼합배양 한 실험군에 비해서는 아주 미세한 발현을 확인할 수 있었다.

결과적으로 파울러자유아메바와 U87MG세포를 비접촉성으로 함께 배양했을 때, NLRP3,ASC,IL-1β,그리고 Caspase-1과 같은 inflammasome형성관련 인 자들의 발현이 증가 되었으며,이러한 인자들이 inflammasome형성에 중요한 역 할을 할 것으로 생각된다.

Ⅴ.결 론

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ABSTRACT

-Expr essi on ofi nf l ammasome-r el at edmol ecul esf r om U87MG cel l scocul t ur edwi t hNaegl er i af owl er ii n t he

non-cont actsyst em

MoonHe eSi m

Depa r t mentofMi c r obi ol ogy,Aj ouUni ver s i t y ( Supe r vi s e dbyHo-J oonShi n,Ph. D)

Naegleria fowleri,a free living amoeba widespread in moistsoil,water and sediment,existas a virulent pathogen causing fetalprimary amoebic meningoencephalitis(PAM)inexperimentalanimalsandinhumam.

Inflammasomes are large intracellularmultiprotein complexes thatplay a centralrolein innateimmunity.They detectandrespondtoalargerangeof pathogen-associated molecularpatterns (PAMPs),including bacterialflagellin, and damage-associated molecular patterns (DAMPs), such as uric acid crystals.inflammasomescompriseamemberoftheNOD-likereceptor(NLR) family,such asNLRP3 and IPAF,and aredefined by theNLR protein that

they contain.The NLR protein recruits the inflammasome-adaptor protein, expressionofIL-1β,NLRP3andcaspase-1weredown-regulated.

Thus,this study showed thatthe targetcells (U87MG cells)cocultured with N. fowleri trophozoites in a non-contact system secret some inflammasomes,NRLP3,caspase-1 and IL-1β,which may play an important roleontheinflammationresponse.