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의학 박사학위 논문
신생 마우스 모델에서 고농도 산소
노출로 유도되는 비정상적 폐포화
과정에 대한 5-lipoxygenase activating
protein inhibitor의 효과
아주대학교 대학원
의학과
박민수
신생 마우스 모델에서 고농도 산소
노출로 유도되는 비정상적 폐포화
과정에 대한 5-lipoxygenase activating
protein inhibitor의 효과
지도교수 배기수
이 논문을 의학 박사학위 논문으로 제출함.
2011년 1월
아주대학교 대학원
의학과
박민수
박민수의 의학 박사학위 논문을 인준함.
심 사 위 원 장
박 문 성 (인)
심 사 위 원
배 기 수 (인)
심 사 위 원
김 흥 수 (인)
심 사 위 원
신 호 준 (인)
심 사 위 원
최 병 민 (인)
아주대학교 대학원
2011년 1월 5일
감사의 글
본 논문이 완성함에 있어서 항상 관심과 지도를 아끼지 않으신 배기수 교수님과 박문성 교수님께 깊은 감사를 드립니다.
2011년 1월 5일 저자 씀
– 국문 요약 –
신생 마우스 모델에서 5-lipoxygenase activating protein
(FLAP) inhibitor가 85% 산소에 의한 비정상적 폐포화
과정에 미치는 영향
배경: 미숙아에서 발병하는 기관지폐이형성증은 만성적인 호흡곤란과 산소의존도를 나타내는 질환으로서 인공환기요법, 고농도산소, 감염, 영양결핍, 수액과다공급 등의 다양한 원인으로 인한 염증성 반응과 비정상적 폐포화 과정 및 폐포 생성의 감소를 일으키는 것으로 알려져 있다. 최근 동물실험 연구에 의하면 신생 랫드에서 고농도 산소를 투여한 경우 비정상적 폐포생성을 초래하는데 이 과정에 leukotriene이 관여하는 것으로 보고되고 있다. 또한 치사 농도 이하의 농도인 85% 산소에 노출된 신생 마우스에서도 비정상적인 폐포화 현상이 초래됨이 보고되었다. 이에 85% 산소에 노출된 신생 마우스 모델에서 leukotriene 합성 억제 물질인 5-lipoxygenase activating protein (FLAP) inhibitor 투여로 비정상적 폐포화 과정을 예방할 수 있으리라는 가설하에 연구를 진행하였다.고농도산소노출(OX)군으로 나누어 각각 21% 산소와 85% 산소에 14일간 노출시켰다. 각 군 내에서 소집단으로 세분하여 FLAP inhibitor로 알려진 MK-0591을 각각 0, 10, 20, 또는 40 mg/kg/d 씩 정해진 기간 동안 (생후 1-4일, 생후 5-9일, 생후 10-14일) 피하주사하였다. 14일 후 마우스를 희생시켜, 기관절개 및 삽관술을 통해 4% paraformaldehyde를 25 cmH2O 압력으로 주입하여 폐를 팽창시킨 상태에서 고정하여 조직병리학적 검사 및 형태계측학적 검사를 시행하였다.
결과: FLAP inhibitor를 투여하지 않은 비치료군의 경우, RA군과 OX군 사이에는 형태계측학적으로 의미있는 차이를 보였다. RA군에 비해 OX군에서 폐포의 수가 현저하게 적었으며, 반대로 폐포의 평균 크기는 유의하게 컸고, 폐포중격의 수는 감소되어 있었다. 따라서 85% 고농도산소 노출에 의하여 폐포가 단순화되는 비정상적인 폐포화 과정이 유도됨을 알 수 있었다. FLAP inhibitor를 투여한 치료군의 경우, 고농도산소 노출에 의한 비정상적인 폐포화 과정의 예방 효과를 비교하였는데, 약물 투여 시기 및 투여 용량에 따라 예방 효과의 정도에 차이를 보였다. 전반적으로 투여 용량이 증가함에 따라 예방 효과가 뚜렷하게 나타나는 추세를 보여 치료군에서 폐포의 수, 폐포 크기 및 폐포 중격의 수 등에서 RA군에 근접하는 형태계측학적 소견을 보였다. 투여 시기별로 구별하여 볼때 생후 1-4일과 생후 10-14일에 투여한 경우 이러한 예방 효과가 유의하게 나타났으며, 효과의 정도는 용량-의존적인
패턴을 보였다. 그러나 생후 5-9일에 투여한 경우는 용량에 관계 없이 전혀 예방 효과를 나타내지 않았다. 결론: 신생 마우스를 85% 고농도산소에 14일 간 노출시킨 마우스 동물 모델에서 FLAP inhibitor 투여로 비정상적 폐포화 현상을 억제하는 효과를 얻었고, 약물 투여 시기에 있어서 결정적 시간대(critical window period)가 존재하며, 동시에 그 효과의 크기는 용량-의존적이었다. 향후 최적의 효과를 나타내기 위하여 필요한 투여 시기 및 투여 용량 결정과 실제 임상에서의 기관지폐이형성증 예방 또는 치료 효과를 검증하기 위한 추가 연구가 요구된다. 핵심어: 신생아, 마우스, 고농도산소, 폐포생성, leukotriene, 기관지폐이형성증
차 례
국문 요약 ... i 차 례 ... iv 그림 차례 ... vi 표 차례 ... viii I. 서 론... 1 II. 연구 대상 및 방법 ... 3 A. 연구 대상 ... 3 1. 연구 동물 ... 3 2. 시험약 ... 3 B. 방법 ... 3 1. 연구 디자인... 3 2. 고농도산소 노출 ... 4 3. 기도과민반응의 평가 ... 5 4. 폐조직 표본 제작 ... 5 5. 조직병리 검사 및 형태계측학 분석 ... 6 C. 통계 분석 방법 ... 6III. 결 과 ... 8 A. 체중 변화 및 사망률 ... 8 B. 폐기능 검사 ... 8 C. 조직병리 검사 및 형태계측학 분석 ... 9 IV. 고 찰 ... 21 V. 결 론... 28 참고문헌 ... 29 ABSTRACT ... 33
그림 차례
Fig. 1. Changes in airway resistance (RL) in room air (RA) and
85% oxygen (OX) group. 13 Fig. 2. Changes in dynamic compliance (Cdyn) in room air (RA)
and 85% oxygen (OX) group. 14 Fig. 3. Histo-morphologic findings of lungs of 14 day-old mice
either exposed to room air (RA) or 85% oxygen (OX) for 14 days since birth and treated with MK-0591 subcutaneously
once daily during P1-P4. 15 Fig. 4. Histo-morphologic findings of lungs of 14 day-old mice
either exposed to room air (RA) or 85% oxygen (OX) for 14 days since birth and treated with MK-0591 subcutaneously
once daily during P5-P9. 16 Fig. 5. Histo-morphologic findings of lungs of 14 day-old mice
either exposed to room air (RA) or 85% oxygen (OX) for 14 days since birth and treated with MK-0591 subcutaneously
once daily during P10-P14. 17 Fig. 6. Morphometric analyses of lungs of mice exposed to either
with MK-0591 subcutaneously once daily. 18 Fig. 7. Morphometric analyses of lungs of mice exposed to either
room air (RA) or 85% oxygen (OX) since birth and treated with 40 mg/kg of MK-0591 subcutaneously once daily
표 차례
I. 서 론
기관지폐이형성증(Bronchopulmonary dysplasia)은 미숙아에게 흔히 발병하는 질환으로서, 최근 20여년 간의 신생아학의 눈부신 발전에도 불구하고 그 발병율이 감소되지 않고 있다. 또한 그동안 수많은 연구가 이루어졌지만 아직도 기관지폐이형성증의 효과적인 예방법이나 확립된 치료법이 없어 신생아를 돌보는 의사들에겐 해결되지 않은 큰 문제점으로 남아 있다. 기관지폐이형성증은 재태연령이 적을수록 많이 발병하는 질환으로 이 질환을 정의할 때에는 일반적으로 신생아의 기관지 및 폐의 구조적 결함이나 미성숙 뿐만 아니라 기능적 결함 및 미성숙에 기인한다는 전제도 포함되어 있다. 역사적으로 볼 때 (Northway) 이 질환은 다음과 같은 다양한 조직학적 소견을 나타낸다. 주된 소견은 폐조직 내 중성구 침윤, 폐부종, 폐섬유화, 폐허탈 및 폐기종의 혼재와 같은 염증성 소견은 물론 폐포화의 감소 등이 있다. 그 외에도 기관지 리모델링을 통한 기관지평활근의 비후, 기관지과민반응의 증가, 폐포상피세포 증식의 저하, 폐포 중격(septation) 생성의 저하, 폐포의 상대적 크기의 증가 및 폐혈관화의 감소 등이 대표적인 소견이다. 현재까지 이 질환은 다요인적 발병 원인에 의한 것으로 알려져 있으며, 그 중에서도 고농도산소에 의한 폐의 염증성 변화, 비정상적인 폐포화 및 기관지과민반응이 주요 병태생리적 변화로 부각되고 있다. 신생랫드에서는 고농도산소에 의한 폐포생성의 억제 작용이 leukotriene을 통하여 일어나며, 시기에 따라 반응이 다르게 나타났다고 보고하였다 (Manji 등,2001). 또한 성장기 랫드에서는 고농도산소가 기도과민반응을 유발하며, 이는 임상에서 볼 수 있는 미숙아의 기관지폐이형성증 환아의 기관지과민반응과 유사하다고 보고되었다 (Iben 등, 2000). 다른 연구에서는 TGF- 및 IL-13 에 의한 cysLT1 수용체의 발현 증가가 LTD4 에 대한 반응으로 나타난 기관지평활근 증식과 연관되어 있으며, 이를 근거로 임상적 기관지폐이형성증에서의 leukotriene의 역할을 시사한바 있다 (Espinosa 등, 2003). 그러나 이와는 달리 50% 산소에 노출된 신생랫드에서 초래되는 폐포 생성 억제 효과를 cysLT1 수용체 길항제인 montelukast 투여로 방지할 수 없었다는 보고도 있다 (Jouvencel 등, 2003). 본 연구에서는 신생 마우스를 고농도산소에 노출시켜 초래되는 기관지 리모델링 및 기관지과민반응, 그리고 비정상적 폐포화 과정을 FLAP inhibitor인 MK-0591 투여로 예방할 수 있을 것이라는 가설을 검증하였다.
II. 실험 재료 및 방법
A. 실험 재료
1. 실험 동물
임신 기간이 확인된 FVB/n 마우스를 Harlan Sprague-Dawley Laboratories (Indianapolis, IN)로부터 구입하였다. 임신 마우스는 출산 5일 전에 동물실험실에 도착하여 환경에 적응하도록 하였다. 임신 마우스는 동물실험실 내 표준 사료 및 물을 필요에 따라 자유롭게 공급하여 유지하였고, 12시간:12시간 명암 싸이클 환경에서 사육하였다. 연구계획서는 연세대학교 의과대학 동물실험윤리위원회의 사전 심의 및 승인을 받았다. 2. 실험 약제
5-lipoxygenase activating protein inhibitor, MK-0591는 파우더 형태로 MSD
본사로부터 공급받았다. 시험약은 H2O와 Tween 80을 4:1 비율로 섞은 용매에 녹여 재구성하였으며, 최종 농도는 8 mg/mL 였다. 마우스 체중 그램 당 재구성된 시험약 1.25 µL, 2.50 µL, 또는 5.00 µL를 정해진 기간동안 매일 피하주사하여 각각 10, 20, 또는 40 mg/kg이 되도록 하였다. B. 실험 방법 1. 실험 디자인 신생 마우스의 개체 간 차이를 최소화하고 대조군과 시험군 간의 영양 섭취
면에서 동등한 상황을 만들기 위하여 최소 2마리의 어미로부터 출생한 시간이 상호간에 6시간 이내인 신생 마우스를 모아서 섞은 후 무작위로 나누어 대기 노출(RA)군 또는 85% 고농도산소 노출(OX)군에 배정하였다. 또한 성숙 마우스에게는 85% 고농도산소를 지속적으로 투여할 경우 식욕 감퇴와 유즙 생산 감소는 물론 3-4일 내에 사망할 수 있는 치명적인 결과를 초래하기 때문에 어미 마우스를 24시간 마다 OX군과 RA군 간에 교체하여 주었다. 매 실험마다 정해진 투여 기간[생후 1-4일(P1-P4), 생후 5-9일(P5-P9), 또는 생후 10-14일(P10-P14)] 동안 각 군 내에서 소집단으로 나누어 2-3마리씩 배정하여 각각 다른 용량(0, 10, 20, 또는 40 mg/kg)의 MK-0591을 피하주사하였다. 2. 고농도산소 노출 실험 최소 2마리의 어미로부터 출생한 지 12시간 이내에 출생 시간이 서로 6시간 이내인 신생 마우스를 모아서 섞은 후 무작위로 나누어 같은 수의 새끼를 각 어미에게 배정하여 케이지에 넣었다. 배정된 새끼의 수는 각 시기 별로 RA군과 OX군 간에 동일하게 유지하였다. 산소 노출은 특별히 제작된 700 mm x 500 mm x 300 mm 크기의 Plexiglas로 만든 산소노출실(oxygen chamber) 내로 산소 농도 85%를 지속적으로 유지할 수 있는 정도의 속도(분당 5 L)로 산소를 주입하였으며, 산소 농도는 산소분석기(oximeter)로 확인하였다. 산소노출실 내의 이산화탄소 축적을 예방하기 위하여 소다라임(soda lime)을 내부에 배치해 두었다. 산소 노출을 위해 마우스 케이지를 통째로 산소노출실 내에 넣었다. 산소 노출 기간 동안 매일
흉곽함몰이 생기는 것 처럼 호흡곤란의 징후나 활동 저하와 같이 유의한 병적 변화의 증거가 있을 때는 과용량의 펜토탈을 복강내로 주사하여 동물을 곧바로 안락사시키기로 계획하였다. 그러나 실제 실험에서는 신생 마우스나 어미 마우스 중 한마리도 병적 변화와 같은 현상을 보이지 않아 안락사된 마우스는 없었다. 또한 산소 노출 전과 완료 시점에서 신생 마우스의 체중을 측정하여 기록하였다. 3. 기도과민반응의 평가 기도과민반응의 평가는 기존에 보고된 방법을 사용하여 기도과민반응을 포함한 폐기능을 검사하였다 (Takeda 등, 1997). 생후 14일된 마우스를 펜토탈(pentobarbital sodium, 70–90 mg/kg, intraperitoneal)로 마취시키고, 21G 스테인레스 관을 이용하여 기관절개삽관한 후 인공 환기시키면서 폐기능 검사를 시행하였다. 기도과민반응은 에어로솔화된 메타콜린(methacholine, MCh)을 투여 후
기도 저항(cmH2O/mL/sec)의 변화를 측정함으로써 평가하였다. 폐저항(lung
resistance, RL) 및 compliance는 FlexiVent system (Scireq, Canada)을 사용하여 측정하였다. 4. 폐조직 표본 제작 폐조직 표본 제작을 위해 마우스에 펜토바비탈(pentobarbital) 200 mg/kg를 복강 내 주사하여 희생시킨 후 심장 박동이 남아 있는 동안 대퇴동맥을 절단하여 혈액을 제거하였다. 사망이 확인된 후 기관절개를 시행하였고, 25-gauge Silastic catheter를 기관내 삽관하였다. 기관삽관을 통하여 25 cmH2O 압력으로
동안 10분 간 폐가 팽창할 시간을 주었고, 더 이상 압력의 변화가 없을 때 기관을 묶고 폐를 절제하였다. 폐조직은 4% paraformaldehyde에 넣어 둔 후 다음날 phosphate buffered solution으로 세척한 후 순차적으로 높은 농도의 에타놀에 넣어 탈수시킨 후 파라핀으로 고정하여 블록을 만들었다. 파라핀으로 고정된 폐조직을 5 마이크론 두께로 절편을 만들어 H&E 염색을 하였고, 이것을 조직병리학 검사 및 형태계측학 분석에 사용하였다. 폐 내로 paraformaldehyde를 주입하는 10분 동안 압력이 20 cm H2O 이하로 떨어지면, 누출이 있는 것으로 간주하여 폐의 팽창이 정상적으로 이루어지지 않은 것으로 단정짓고 조직병리 검사 및 형태계측학 분석에서 제외시켰다. 5. 조직병리 검사 및 형태계측학 분석 기관지 상피조직 및 폐포 구조(호산구 침윤, 기관지 상피 변화, 기관지 평활근 비후, 폐포 중격 등)의 변화를 평가하기 위하여 조직병리 검사를 시행하였다. 올림푸스 광학현미경을 사용하여 400배 확대하여, 폐조직을 검사하였고, 각 필드의 디지털 이미지를 캡쳐하여 형태계측학 분석에 사용하였다. 형태계측학 분석은 Molecular Devices의 Metamorph 6 프로그램을 이용하였으며,
폐포의 크기(면적, m2), 폐포의 수, 폐포의 둘레(m), 둘레:면적 비(length to area
ratio, LAR, m-1) 등을 측정하였다.
C. 통계 분석 방법
2-용량에 따른 각 군간의 비교는 modified t-test를 사용하여 post hoc 분석을 시행하였다.
III. 결 과
A. 체중 변화 및 사망률 전체 실험 기간을 통해서 산소 노출 기간 동안 사망한 예는 없었다. 또한 안락사를 요하는 정도의 병적 변화를 나타낸 개체도 관찰되지 않았다. 고농도산소 노출 전의 RA군과 OX군의 평균 체중은 차이가 없었다. 생후 14일까지의 고농도산소 노출이 완료된 시점에서 RA군과 OX군의 평균 체중은 유사하였으며, 통계학적으로 차이를 보이지 않았다. B. 폐기능 검사 시험약을 투여하지 않은 상태(비치료군)에서의 고농도산소 노출에 의한 기관지과민반응 유발 여부를 확인하기 위하여 14일 간 대기 또는 고농도산소에 노출시킨 후 폐기능 검사를 시행하였다. 메타콜린 자극 전의 기초 기도저항(RL) 및 dynamic compliance (Cdyn)는 RA군과 OX군 간에 차이를 보이지 않았다(p>0.05). 메타콜린의 농도를 3.125 mg/mL부터 25 mg/mL까지 증가시키면서 측정한 RL 및 Cdyn 또한 두군 간에 차이를 보이지 않았다(p>0.05) (Figure 1). 폐기능 검사 후에모든 동물에서 기관지폐세척(bronchoalveolar lavage)을 시행하여 세척액을
현미경적으로 검사하였다. 두군 모두에서 세척액 내 염증세포나 호산구는 거의 발견되지 않았으며, 두군 간의 차이는 발견하지 못했다.
C. 조직병리 검사 및 형태계측학 분석
1. 고농도산소 노출 효과 분석
OX-비치료군(고농도산소에 노출되었으며, 시험약을 투여하지 않고 시험약 대신 동량의 용매만 주사한 군)에서는 조직형태학적으로 볼때 폐포화 과정이 정지되어 단순화(simplification)된 소견을 보였다. 기공(氣空, airspaces)의 수는 RA-비치료군에 비해 유의하게 적었으며, 크기는 유의하게 컸다. 또한 이차 폐포 중격(secondary alveolar septa)의 수는 유의하게 적었다. OX-비치료군에서는 대부분의 기공의 모양이 RA-비치료군에서 보이는 것과는 달리 폐포관(alveolar duct)과 폐포낭(alveolar sac) 주위로 폐포 송이(cluster)를 이루지 않고 단순한 주머니 모양을 하고 있었다. 특징적으로 폐조직 내에서 염증성 세포 침윤의 뚜렷한 증거는 없었다. OX-비치료군의 기관지평활근의 두께는 RA-비치료군에 비해 증가되지 않아 기관지평활근 비후의 소견은 없는 것으로 판단되었다(Figures 3, 4, 및 5).
2. 대기노출군에서의 시험약의 효과
RA군을 OX군과 동일하게 시험약을 투여하지 않은 비치료군과 RA-치료군으로 구분하였고, RA-치료군은 MK-0591를 각각 10, 20, 또는 40 mg/kg 투여하였다. RA군에서는 비치료군과 치료군 사이에 조직병리학적 검사나 형태계측학 분석 상 유의한 차이를 보이지 않았으며, RA-치료군 내에서도 시험약의 용량에 따른 차이는 보이지 않았다(Figures 3, 4, 및 5).
3. 고농도산소노출군에서의 시험약의 효과
OX군에서 비치료군과 MK-0591을 10, 20 또는 40 mg/kg로 투여한 OX-치료군의 폐조직을 광학현미경으로 관찰한 결과, 시험약의 용량과 폐포화의 호전 정도 간에 의미있는 용량-반응 관계가 관찰되었다. 즉, 시험약의 용량을 증량시킴에 따라 폐포화의 호전 정도가 점차 증가되는 것을 관찰하였다. 시험약 투여 시기와 관계없이 OX군 중 40 mg/kg의 MK-0591를 투여한 군에서는 조직형태학적 소견이 RA군과 유사하게 나타났다(Figures 3, 4 및 5). 형태계측학적 분석에서는 OX군 중 40 mg/kg의 MK-0591를 투여한 군에서 폐포의 수, 크기, 평균 및 총 둘레, 구형 표면적(sphere surface areas) 등이 RA군과 동일하게 나타났다(Figure 6). OX군 중 MK-0591를 20 mg/kg 투여한 군에서는 폐포화 호전 정도에 있어서 RA군에 근접하는 소견을 보였으나, 통계학적으로 유의한 수준은 아니었다. OX군 중 시험약 10 mg/kg를 투여한 군에서는 폐포화 호전의 소견이 전혀 없이 OX-비치료군과 거의 유사한 소견을 보였다.
4. 시험약 투여 시기에 따른 효과 (Effects of window period of treatment)
OX군에 대한 시험약의 폐포화 호전 효과를 비교하는데 있어서 시험약 10 또는 20 mg/kg을 투여한 군에서는 폐포화 호전 효과가 뚜렷하게 나타나지 않았기 때문에 투여 시기에 따른 효과를 비교 분석할 수 없었다. 따라서 투여 시기에 따른 효과는 시험약 40 mg/kg을 투여한 군에서 비교분석하였다. OX-치료군 중 시험약 40 mg/kg을 각각 P1-P4 또는 P10-P14 기간 동안 투여한 경우에는 OX-비치료군보다 기공의 수가 유의하게 많았으며, 기공의 크기는 적었고, 기공의 총
흥미롭게도 동일한 용량의 시험약을 P5-P9 동안 투여한 군에서는 OX-비치료군의 소견과 거의 흡사한 정도로 폐포화 호전 효과는 전혀 나타나지 않았다(Figure 7).
Table 1. Body weights of mouse pups at 14 days of age
Treatment Group* Room Air (g) n 85% Oxygen (g) n
0 mg/kg 7.31 ± 0.65 11 7.19 ± 0.38 10
10 mg/kg 8.04 ± 0.80 14 8.15 ± 0.31 12
20 mg/kg 6.94 ± 0.67 12 6.83 ± 0.74 11
40 mg/kg 7.39 ± 1.04 15 7.58 ± 1.20 15
Overall 7.34 ± 0.86 52 7.34 ± 0.89 48
There were no significant differences in body weights between the room air and hyperoxia groups regardless of the dose of MK-0591 administered. * 0 mg/kg: vehicle control; others: MK-0591 in vehicle. Mean ± SD.
Fig. 1. Changes in airway resistance (RL) in room air (RA) and 85% oxygen (OX)
Fig. 2. Changes in dynamic compliance (Cdyn) in room air (RA) and 85% oxygen (OX)
Fig. 3. Histo-morphologic findings of lungs of 14 day-old mice either exposed to room air (RA) or 85% oxygen (OX) for 14 days since birth and treated with MK-0591 subcutaneously once daily during P1-P4. Top row is room air and bottome row is 85% oxygen. Column I: lungs of mice
given vehicle only; Column II: MK-0591 10 mg/kg; Column III: MK-0591 20 mg/kg; Column IV: MK-0591 40 mg/kg. Hyperoxia-exposed mice treated with 40 mg/kg of MK-0591 during P1-P4 showed the lung histo-morphology similar to room air controls.
Fig. 4. Histo-morphologic findings of lungs of 14 day-old mice either exposed to room
air (RA) or 85% oxygen (OX) for 14 days since birth and treated with MK-0591
subcutaneously once daily during P5-P9. Top row is room air and bottome row is 85%
oxygen. Column I: lungs of mice given vehicle only; Column II: MK-0591 10 mg/kg; Column III: MK-0591 20 mg/kg; Column IV: MK-0591 40 mg/kg. Hyperoxia-exposed mice treated with MK-0591 during P5-P9, regardless of the dose, did not show improvement in alveolarization and were comparable to hyperoxia controls (i.e., exposed to hyperoxia and given vehicle only).
Fig. 5. Histo-morphologic findings of lungs of 14 day-old mice either exposed to room
air (RA) or 85% oxygen (OX) for 14 days since birth and treated with MK-0591
subcutaneously once daily during P10-P14. Top row is room air and bottome row is 85%
oxygen. Column I: lungs of mice given vehicle only; Column II: MK-0591 10 mg/kg; Column III: MK-0591 20 mg/kg; Column IV: MK-0591 40 mg/kg. Hyperoxia-exposed mice treated with 20 or 40 mg/kg of MK-0591 during P10-P14 showed the lung histo-morphology similar to room air controls.
Fig. 6. Dose–response relationships in morphometric changes of lungs of newborn mice
exposed to either room air (open circle) or 85% oxygen (filled circle) for 14 days and
treated with 0, 10, 20, and 40 mg/kg MK-0591 subcutaneously once daily during
spaces, row III is the mean area of air spaces, and row IV is LAR (mean perimeter/mean area). Dose-dependent improvements in morphometric parameters of oxygen-exposed mice toward values approaching those of room air controls were observed for the groups treated with MK-0591 during P1–P4 and P10–P14, but not during P5–P9. The protective effects were evident at 20 and 40 mg/kg during P10–P14 in a dose-dependent manner, while the effects were seen only at 40 mg/kg during P1–P4. * P < 0.05 between-group against room air control at an equivalent dose of MK-0591; † P < 0.05 within-group against vehicle control.
Fig. 7. Morphometric analyses of lungs of mice exposed to either room air (RA) or 85%
oxygen (OX) since birth and treated with 40 mg/kg of MK-0591 subcutaneously once
daily during different periods. [A] Number of airspaces per field of interest (FOI) [B]
Mean area of airspaces [C] Total perimeter of airspaces per FOI [D] Perimeter/Area. All the alveolarization parameters of the groups treated with 40 mg/kg of MK-0591 during P1-P4 or P10-P14 were comparable to those of the room air controls, whereas those of the groups treated during P5-P9 were significantly different from the room air controls. * P < 0.05 vs. room air control group.
IV. 고 찰
신생 동물 모델에서 고농도산소 노출의 해악적 효과로 인한 비정상적인 폐포화 과정에 대해서는 비교적 많은 보고가 있었다 (Manji 등, 2001; Frank, 1991; Boros 등, 1997; Phillips 등, 1995; Taniguchi 등, 1986; Warner 등, 1998). 비정상적인 폐포화 현상은 폐포의 수의 감소 및 크기의 증가와 함께 폐포중격형성 저하로 인하여 가스교환표면적의 감소를 초래하는 것으로 대변될 수 있다. 그러나, 보고된 연구논문들마다 사용된 산소의 농도가 다르고, 고농도산소 투여기간 및 투여시기는 물론 동물의 종류나 계통 및 나이 등이 다양하여 결과를 해석하는데 어려움이 있다. 본 연구에서는 FVB/n 계통의 신생 마우스를 사용하였으며, 85% 산소를 출생 직후부터 14일간 지속적으로 투여하여 정상적인 폐발달에 장애를 초래함을 보여주었고, 특히 조직학적 및 형태계측학적 분석을 통해 폐포화 과정에 이상이 생기는 것을 확인하였다. 또한 과거에 보고된 다른 연구에서와는 달리 (Warner 등, 1998) 고농도산소에 노출된 신생 마우스 중 한마리도 사망하지 않았고, 체중의 증가 또한 대기노출대조군과 유의한 차이를 보이지 않아 FVB/n 계통의 신생 마우스에서는 14일 간의 85% 산소 노출이 치명적이지 않음을 보여주었다. 동시에 14일 간의 85% 산소에 노출된 마우스의 기관지폐포세척액 및 폐조직 표본에서 대기노출대조군에 비해 염증성 세포의 수가 의미있게 증가하지 않았으며, 실제로 거의 눈에 띄지 않을 정도로 적게 나타났다. 즉, 이 동물모델은 폐발달 중 폐포화 과정에 조직발생학적 이상을 초래하여 임상에서의 기관지폐이형성증과 유사한 소견을 보여줌과 동시에 염증성 반응에 이차적으로
뒤따르는 광범위한 괴사, 섬유화 및 상처화 변화 등이 결여되어 있어 염증성 반응에 의한 폐발달(폐포화) 이상을 배제할 수 있는 장점을 가지고 있다.
임상적 기관지폐이형성증이나 마우스 또는 랫드의 다른 계통 동물
모델에서는 고농도산소 노출에 의하여 기도과민반응이나 기관지평활근
리모델링이 초래되는 것을 보고되고 있으나 대부분 염증성 반응과 연관되어 나타나는 것이 보통이다 (Denis 등, 2001; Henderson 등, 2002; Holgate 등, 2003; Mochizuki 등, 1998; Sheikh 등, 2001; Thibeault 등, 2003). 그러나 본 연구의 FVB/n 신생 마우스를 사용한 동물 모델에서는 폐포화 과정의 이상 외에는 기도과민반응이나 기관지평활근 리모델링의 소견은 초래되지 않았다. 이는 곧 폐포화 과정에 관여되는 기전과 기도과민반응이나 기관지평활근 리모델링 유도에 관여되는 기전이 독립된 다른 기전임을 시사한다고 할 수 있다. Leukotriene은 기관지천식 및 폐섬유화증과 같이 여러가지 다양한 만성 염증성 질환의 발병기전에 연관되어 있는 것으로 알려져 있다. 여러 연구 결과에서 leukotriene 생성 억제가 염증 반응 및 기관지과민반응을 저하시켜 경과를 호전시키는 방향으로 유도한다고 하였다 (Beller 등, 2004; Bigby 등, 2002; Leff 등, 2001; Medina 등, 1994; Nathan 등, 2001; Speer, 1999; Zeldin 등, 2002). 또한 고농도산소 노출로 인한 비정상적인 폐포화 현상에 leukotriene이 매개체로서 작용한다는 보고도 흔히 접할 수 있다 (Manji 등, 2001; Boros 등, 1997; Phillips 등, 1995; Taniguchi 등, 1986; Hosford 등, 2002; Kertesz 등, 1992). 고농도산소 노출로
억제와 연관된다고 한다 (Boros 등, 1997). 이러한 보고에서도 고농도산소에 노출된 대부분의 동물에서는 폐 내에 염증성 반응이 증명되었다. 이에 반하여 본 연구의 결과에서 보듯이 염증성 변화 없이도 폐포화 과정이 억제되는 것은 leukotriene이 염증성 반응을 통하여 폐포화 과정을 억제한 것은 아니라는 결론을 얻을 수 있다. 즉, 아직까지 leukotriene 매개로 인한 폐포화 과정 억제 기전은 확실하지 않으나 염증 이외의 다른 기전을 유도하여 초래된 결과일 것으로 추정된다. 이를 뒷받침하는 증거로서 본 연구 결과에서 볼 수 있듯이 FLAP을 억제하여 효과적으로 leukotriene 생성을 억제시키는 MK-0591(5-lipoxygenase activating protein inhibitor)를 투여함으로써 고농도산소로 인한 폐포화 억제 현상이 예방된 것을 제시할 수 있다. 이러한 결과로부터 몇가지 의미있는 가설을 도출해 낼 수 있다. 첫째, 고농도산소는 leukotriene 생성의 증가와 연관되어 있다. 둘째, leukotriene은 비정상적인 폐포화 과정에 관여한다. 셋째, leukotriene의 작용기전은 순전히 염증성 반응과 연관된 성질에 기인하지는 않는다. 넷째, 폐포화 과정에 관여하는 여러 성장인자의 신호전달체계가 leukotriene에 의하여 중단되거나 수정되었을 수 있다. 정상적인 폐발달, 특히 폐포화에 관여하는 인자로는 MMP, retinoic acids, FGF, PDGF, TGF, VEGF 및 그 수용체 등 다양하게 보고되고 있으며, 고농도산소 노출에 의하여 영향을 받아 이들의 정상적인 조화 및 조절 프로그램으로부터 이탈하게 되는 결과를 초래할 수 있다. 마지막으로, 이러한 leukotriene의 작용을 방지함으로서 정상적인 폐포화 과정이 회복될 수 있다.
약물의 약리학적 효과는 다른 용량이나 농도에서 다르게 나타날 수 있으므로 본 연구에서는 시험약인 MK-0591을 증량시켜 가면서 비정상적인 폐포화 현상을 예방하는 효과의 정도를 평가하였다. 이미 언급된 바와 같이 고농도산소 노출로 신생 마우스의 폐 내 폐포화 정도를 나타내는 폐포의 수, 크기 및 기공의 둘레 등의 변수가 대기노출대조군에 비하여 통계학적으로 의미있는 정도의 차이를 나타내었다. 전체적으로 볼때 본 연구의 결과는 MK-0591의 비정상적인 폐포화 과정의 예방적 효과는 용량의존적인 것으로 나타났다(Fig. 6). MK-0591 10 mg/kg에서는 전혀 예방효과가 나타나지 않았으며, 20 mg/kg를 투여하였을 때에는 중등도의 예방효과가 관찰되어 형태계측학적 변수들이 시험약을 투여받지 않은 고농도산소노출대조군보다는 통계학적으로 의미있게 향상되었으나 대기노출대조군에 비해서는 유사한 정도로 호전시키지는 못하였다. 그러나 MK-0591 용량을 40 mg/kg으로 높여서 투여한 군에서는 폐가 형태계측학적으로 대기노출대조군과 유사하게 호전되었음을 보여주었다. 여기서 용량을 더 높은 용량인 80 또는 120 mg/kg로 증량하였을 때 예방효과가 더 호전될 지에 대해서는 검사하지 않았으나, 이미 40 mg/kg에서 대기노출대조군과 유사한 정도의 폐포화 정상화 소견을 보이고 있기 때문에 용량을 추가로 증량하는 것이 크게 의미가 없다고 판단되었다. 단, 오히려 더 높은 용량에서 효과가 역설적으로 감소하거나 악화시킬 수 있는 가능성도 배제할 수는 없다. 결국 본 연구에서 확인된 사실은 MK-0591 용량을 10, 20, 그리고 40 mg/kg까지 증량시킬때 용량-반응 관계가 존재하여 최고농도인 40 mg/kg에서 비정상적인 폐포화 현상의 예방적 효과가 극대화되었다는 것이다. Manji 등은 그들의
이때는 MK-0591의 용량을 20 mg/kg로 투여하여 폐포화 호전이 관찰되었다 (Manji 등, 2001). 그러나 이 연구에서는 산소농도를 95% 이상으로 노출시켰으며, 10일간 노출시켰을때 심한 폐간질 및 폐포내 부종과 단백증이 관찰되어 염증성 반응이 진행되었음을 시사한다. 마우스의 경우는 이렇게 높은 산소농도에서는 1주일 이내에 심각한 염증 반응을 보이며, 병적 변화를 보이면서 사망하는 것이 보통이다. 따라서 용량에 대한 반응 정도는 종 간의 차이 외에도 이러한 산소농도 및 노출 기간의 차이 등에 의한 것으로 판단된다. 또한 약물의 효과를 보는 부분에 있어서는 모든 랫드를 생후 4일째부터 고농도산소에 노출시켰는데 이는 사람에서는 거의 생후 1개월에 해당하는 나이이며, 폐발달 단계로 보아서는 폐포화 초기단계에 해당하며 사람 태아 재태연령 32주 이상에 해당한다. 본 연구에서는 최대한 임상적인 상황과 유사하게 동물모델을 만들기 위하여 출생직후부터 산소를 투여하였으며, 이는 폐발달 단계로 보아서는 낭성 단계에 해당하고, 사람 태아 재태연령 24-28주에 견줄만 하다.
본 연구에서 주목해야 할 만한 결과로는 치료 효과를 얻기 위해서는 적절한 시기가 존재한다는 것이다. 정상적으로는 신생 마우스는 출생후 4일까지 조직발생학적으로 볼때 폐발달의 낭성 단계에 해당하는 폐를 가지고 있다. 이후 생후 5일부터는 폐포 중격 형성이 시작되면서 폐포 단계로 넘어간다. 출생 직후부터 생후 4일까지 매우 초기에 고농도산소에 노출될 경우 이러한 정상적인 폐발달 과정이 방해를 받게 되는데, 정상적으로 생후 5일부터 시작되어야 할 폐포화 과정이 지연되거나 정지되는 현상이 생기는 것으로 보여진다. 본 연구에서 관찰되는 현상은 예방적 치료효과를 나타낸 MK-0591 40 mg/kg 투여군에서 투여된 시기에 따라 그 결과가 전혀 다르게 나타난다는 것이다(Fig. 7). 약물이 생후 1-4일 또는 생후 10-14일에 투여된 군에서는 고농도산소 노출에 의한 비정상적인 폐포화 현상이 확실히 예방되는 소견을 보인 반면, 생후 5-9일에 투여된 군에서는 동일 용량에서 이러한 효과가 전혀 나타나지 않음을 알수 있다. 이런 현상은 MK-0591 투여가 예방적/치료적 효과를 나타내기 위해서는 특정한 시기에 투여되어야 하는 “therapeutic window period”가 존재하기 때문이다. 즉, leukotriene이 정상적인 폐포화에 악영향을 미치는 시기에 적절하게 leukotriene 생성 억제제를 투여함으로써 예방적/치료적 효과를 나타낸다고 보인다. 이 시기는 고농도산소 노출과 같은 자극에 민감하게 반응하는 시기일 뿐만 아니라 정상적인 발달과정 중 적절한 신호의 발생 및 전달이 필수적인 시기라고도 할 수 있다. 반대로 이러한 “therapeutic window period”가 아닌 시기에 투약을 한 경우에는 이미 손상이 가시화되어 뒤늦게 leukotriene 생성을 억제하더라도 효과를 나타내기 어렵기 때문이거나 생후 5-9일과 같은 특정
자체가 저하되어 있는 시기라고 볼수도 있다. 이렇게 치료적인 반응이 지속적이거나 연속적으로 나타나지 않고 치료적 반응이 없는 시기에 의해 분리되어 나타나는 현상을 보면, 폐포화 과정이 마치 밀물과 썰물의 교차와 같은 패턴을 따르는 것으로 추정해 볼 수 있다. 본 연구의 결과는 정상적인 폐의 발달, 특히 폐포화 과정을 이해하는데 기여할 뿐만 아니라 비정상적인 폐포화로 인한 병적 상태를 예방하거나 치료하는 신약이나 치료법의 개발에 그 중요성이 부각된다고 할 수 있다.
V. 결 론
정상적인 폐포화 과정의 기전과 이러한 과정에서 이탈하여 비정상적인 과정을 초래하는 원인 및 기전 모두 아직은 밝혀지지 않았다. 아마도 본 연구에서 나타난 FLAP inhibitor인 MK-0591의 비정상적 폐포화 과정의 예방적 효과를 충분히 이해하고 활용하기 위해서는 정상적인 발달 과정에 대한 더 깊은 이해가 필요할 것으로 생각된다. 그럼에도 불구하고 본 연구의 결과는 폐포화 과정의 이해 및 임상적으로 흔히 접하는 기관지폐이형성증과 같은 비정상적 폐포화 과정에 대한 치료 및 예방 전략 모색에 몇가지 중요한 단서를 제시하고 있다. 즉, 본 연구에서 처럼 치명적 농도 이하의 고농도산소에 노출된 신생 마우스에서 나타나는 비정상적인 폐포화 과정은 비염증성 기전에 의하여 초래될 수 있으며, MK-0591와 같은 FLAP inhibitor를 적정 용량으로 적절한 시기에 투여함으로써 예방될 수 있다는 것이다. 현재와 같이 임상 진료 실전에서 기관지폐이형성증에 대한 효과적인 치료 대안이 존재하지 않는 현실을 감안할때 임상적 기관지폐이형성증과 유사한 조직병리학적 소견을 보이는 동물 모델에서 비정상적 폐포화 과정을 예방할 수 있는 MK-0591와 같은 신약후보물질의 개발을 추진하는 것이 절실히 요구되는 상황이다.참고문헌
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ABSTRACT
One of the most striking characteristics of bronchopulmonary dysplasia is aberrant alveolarization. It has been reported that in newborn rats aberration of alveolarization by hyperoxia is mediated by leukotrienes (LT). We hypothesized that LT synthesis inhibitor MK-0591 given during hyperoxia exposure in newborn mice would prevent aberrant alveolarization.
Newborn mice immediately after birth were divided into room air control group and hyperoxia group (85% O2 for 14 days). Each group was treated with either vehicle or MK-0591 10, 20, or 40 mg/kg of SQ daily for the designated periods (days 1-4, 5-9, or 10-14). Mice were sacrificed on day 14, and lungs were inflated with 4% paraformaldehyde, fixed and stained for histopathological and morphometric analyses.
Lungs of hyperoxia groups treated with MK-0591 showed alveolarization that resembled lungs of room air controls with increasing doses given only in certain window periods (days 1-4 and 10-14), while lungs of untreated hyperoxia groups showed a definite evidence of aberrant alveolarization.
In newborn mice, LT synthesis inhibitor MK-0591 given during critical window periods at certain doses prevents aberration of alveolarization caused by 85% oxygen exposure.
KEYWORDS: Newborn, hyperoxia, alveolarization, leukotriene, bronchopulmonary dysplasia
